生物化學(xué)課件3核酸化學(xué).ppt

1、第三章核酸化學(xué),Nucleic Acid chemistry,核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲存與傳遞。 核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,第一節(jié) 核酸是遺傳物質(zhì)的載體,一、核酸的研究發(fā)現(xiàn)史 1868年，F(xiàn). Miescher從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。,1944年，Avery的轉(zhuǎn)化實驗,or,and,可分離,1952年， Hexshey、Chase T2噬菌體（搗碎器實驗） 1953年，Watson、Crick DNA雙螺旋模型 核酶（Ribozyme）,98核中（染色體中） 真核 線粒體（mDNA）

2、 核外 葉綠體（ctDNA） DNA 擬核 原核 核外：質(zhì)粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,二、核酸的種類和分布,核酸分為兩大類： 脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）,RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,tRNA rRNA mRNA 其它 RNA病毒：SARS,三、分子生物學(xué)的中心法則,第二節(jié) 核酸的基本化學(xué)組成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,堿基,戊糖,元素組成： C H O N P,核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個核苷分子含一分子堿

3、基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。,組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為 -D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖。,一、戊糖,二、堿基,1. 嘌呤（Purine）,2. 嘧啶（Pyrimidine）,核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。,三、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵,假尿苷（） 次黃苷（肌苷）I 黃嘌呤核苷 X 二氫尿嘧啶核苷 D 取代核苷的表示方式 7-甲基鳥苷 m5G,Adenosine

4、 Guanosine Cytidine Uridine,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸,五、核苷酸衍生物,1. 繼續(xù)磷酸化,2.環(huán)化磷酸化,cAMP,cGMP,3. 肌苷酸及鳥苷酸(強力味精),4. 輔酶 NAD、NADP、FMN,IMP GMP,六、多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通過一個核苷酸的C3-OH 與另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3-OH表示） 多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DN

5、A RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,第三節(jié) DNA的結(jié)構(gòu),一、DNA的一級結(jié)構(gòu) 脫氧核糖核酸的排列順序 可以用堿基排列順序表示 連接鍵：3，5-磷酸二酯鍵 磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架 堿基形成側(cè)鏈 多核苷酸鏈均有5-末端和3-末端 DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。,2. 基因與基因組,基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。,基因組

6、（genome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和。 包括：核基因組（擬核/核DNA）及核外（質(zhì)粒/質(zhì)體DNA）,各種細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大小,3. 原核生物基因組特點 重復(fù)序列少，多位編碼區(qū) 多為操縱子形式組織 有重疊基因存在,真核生物基因組特點 以染色體存在 重復(fù)序列多,基因組計劃 人類基因組計劃（Human Genome Project， HGP ） 酵母基因組計劃 （YGP） 大腸桿菌（E.Coli）,二、DNA的二級結(jié)構(gòu) DNA的雙螺旋模型,1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA結(jié)晶的X-衍射圖譜和分子模型，提出了著

7、名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測。 在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。,DNA雙螺旋模型要點,B型結(jié)構(gòu) 兩條鏈反向平行，右手螺旋 堿基在內(nèi)（AT，GC）堿基平面垂直于螺旋軸 戊糖在外，雙螺旋每轉(zhuǎn)一周 為10堿基對（bp） A型結(jié)構(gòu) 堿基平面傾斜20，螺旋變粗變短，螺距23nm。 Z型結(jié)構(gòu) 左手螺旋，只有小溝,雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù),雙螺旋穩(wěn)定的力 氫鍵 堿基堆積力（疏水相互作用及范德華力） 離子鍵等 則DNA變性劑（熱、pH、脲/酰胺、有機溶劑）,DNA的存在形式,二、DNA的三級結(jié)構(gòu),DNA雙螺旋的進一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)，負(fù)超螺旋 原核

8、雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA） 病毒 單鏈環(huán)狀DNA（scDNA） 單鏈線性DNA（ssDNA）,真核 雙鏈線性DNA（dsDNA）,第四節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能,一、結(jié)構(gòu)特點 堿基組成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解 多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋 分子較小 分類 mRNA（hnRNA 核不均一RNA） tRNA rRNA （snRNA/asRNA） 少數(shù)RNA病毒,二、tRNA,占RNA總量的15 一種氨基酸對應(yīng)最少一種RNA,分子量25000左右，大約由7090個核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。 分子中含有較多的修飾成分。 3-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)

9、。,tRNA的三級結(jié)構(gòu),三、rRNA,占RNA總量的80,四、mRNA和hnRNA,占細(xì)胞總RNA的35,真核細(xì)胞mRNA的3-末端有一段長達(dá)200個核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為 “尾結(jié)構(gòu)” ，5 -末端有一個甲基化的鳥苷酸，稱為” 帽結(jié)構(gòu)“ 。,五、snRNA （small nucleic RNA 核小RNA） scRNA （small cytoplasmic RNA） asRNA （antisense RNA）,第五節(jié) 核酸的性質(zhì),二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核

10、酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。 以A260/A280進行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光,三、核酸的變性、復(fù)性與分子雜交,1. 變性 穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 變性表征 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)） 變性因素 pH（11.3或5.0） 變性劑（脲、甲酰胺、甲醛） 低離子強度 加熱,DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之間。

11、DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。 G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,2. 熱變性和Tm,3. 核酸的復(fù)性,變性核酸的互補鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。 DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。 將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火”。 退火溫度Tm25 復(fù)性影響因素 片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/ 溶液離子強度,4.分子雜交,DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。 核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。 Southern 雜交（Southern bolting） Northern 雜交（Northern bolting） Western 雜交 （Western bolting）,四、核酸的序列測定,雙脫氧鏈終止法（Sanger酶法） 2. Gilbert化學(xué)降解法,本 章 小 結(jié),核酸是