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文檔簡介
1、第三章核酸化學(xué),Nucleic Acid chemistry,核酸是一類重要的生物大分子,擔(dān)負(fù)著生命信息的儲存與傳遞。 核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域,是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,第一節(jié) 核酸是遺傳物質(zhì)的載體,一、核酸的研究發(fā)現(xiàn)史 1868年,F(xiàn). Miescher從細(xì)胞核中分離得到一種酸性物質(zhì),即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。,1944年,Avery的轉(zhuǎn)化實驗,or,and,可分離,1952年, Hexshey、Chase T2噬菌體(搗碎器實驗) 1953年,Watson、Crick DNA雙螺旋模型 核酶(Ribozyme),98核中(染色體中) 真核 線粒體(mDNA)
2、 核外 葉綠體(ctDNA) DNA 擬核 原核 核外:質(zhì)粒(plasmid) 病毒:DNA病毒,二、核酸的種類和分布,核酸分為兩大類: 脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid (DNA) 核糖核酸 Ribonucleic Acid(RNA),RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,tRNA rRNA mRNA 其它 RNA病毒:SARS,三、分子生物學(xué)的中心法則,第二節(jié) 核酸的基本化學(xué)組成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,堿基,戊糖,元素組成: C H O N P,核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖(核糖或脫氧核糖)和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個核苷分子含一分子堿
3、基和一分子戊糖,一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外,還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。,組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為 -D-2-脫氧核糖;RNA所含的糖則為-D-核糖。,一、戊糖,二、堿基,1. 嘌呤(Purine),2. 嘧啶(Pyrimidine),核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多,大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。,三、核苷(nucleoside),核苷 戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵,稱為C-N糖苷鍵,假尿苷() 次黃苷(肌苷)I 黃嘌呤核苷 X 二氫尿嘧啶核苷 D 取代核苷的表示方式 7-甲基鳥苷 m5G,Adenosine
4、 Guanosine Cytidine Uridine,四、核苷酸(nucleotide) 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸,五、核苷酸衍生物,1. 繼續(xù)磷酸化,2.環(huán)化磷酸化,cAMP,cGMP,3. 肌苷酸及鳥苷酸(強力味精),4. 輔酶 NAD、NADP、FMN,IMP GMP,六、多聚核苷酸(核酸),多聚核苷酸是通過一個核苷酸的C3-OH 與另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。,5-磷酸端(常用5-P表示);3-羥基端(常用3-OH表示) 多聚核苷酸鏈具有方向性,當(dāng)表示一個多聚核苷酸鏈時,必須注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DN
5、A RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,第三節(jié) DNA的結(jié)構(gòu),一、DNA的一級結(jié)構(gòu) 脫氧核糖核酸的排列順序 可以用堿基排列順序表示 連接鍵:3,5-磷酸二酯鍵 磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架 堿基形成側(cè)鏈 多核苷酸鏈均有5-末端和3-末端 DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。,2. 基因與基因組,基因(gene):一段有功能的DNA片段,生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位(交換單位)。,基因組
6、(genome):某生物體(完整單倍體)所含全部遺傳物質(zhì)的總和。 包括:核基因組(擬核/核DNA)及核外(質(zhì)粒/質(zhì)體DNA),各種細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大小,3. 原核生物基因組特點 重復(fù)序列少,多位編碼區(qū) 多為操縱子形式組織 有重疊基因存在,真核生物基因組特點 以染色體存在 重復(fù)序列多,基因組計劃 人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP ) 酵母基因組計劃 (YGP) 大腸桿菌(E.Coli),二、DNA的二級結(jié)構(gòu) DNA的雙螺旋模型,1953年,J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基礎(chǔ)上,根據(jù)DNA結(jié)晶的X-衍射圖譜和分子模型,提出了著
7、名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,并對模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測。 在DNA分子中,嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。,DNA雙螺旋模型要點,B型結(jié)構(gòu) 兩條鏈反向平行,右手螺旋 堿基在內(nèi)(AT,GC)堿基平面垂直于螺旋軸 戊糖在外,雙螺旋每轉(zhuǎn)一周 為10堿基對(bp) A型結(jié)構(gòu) 堿基平面傾斜20,螺旋變粗變短,螺距23nm。 Z型結(jié)構(gòu) 左手螺旋,只有小溝,雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù),雙螺旋穩(wěn)定的力 氫鍵 堿基堆積力(疏水相互作用及范德華力) 離子鍵等 則DNA變性劑(熱、pH、脲/酰胺、有機溶劑),DNA的存在形式,二、DNA的三級結(jié)構(gòu),DNA雙螺旋的進一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu),負(fù)超螺旋 原核
8、雙鏈環(huán)狀DNA(dcDNA) 病毒 單鏈環(huán)狀DNA(scDNA) 單鏈線性DNA(ssDNA),真核 雙鏈線性DNA(dsDNA),第四節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能,一、結(jié)構(gòu)特點 堿基組成 A、G、C、U (AU/GC) 稀有堿基較多,穩(wěn)定性較差,易水解 多為單鏈結(jié)構(gòu),少數(shù)局部形成螺旋 分子較小 分類 mRNA(hnRNA 核不均一RNA) tRNA rRNA (snRNA/asRNA) 少數(shù)RNA病毒,二、tRNA,占RNA總量的15 一種氨基酸對應(yīng)最少一種RNA,分子量25000左右,大約由7090個核苷酸組成,沉降系數(shù)為4S左右。 分子中含有較多的修飾成分。 3-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)
9、。,tRNA的三級結(jié)構(gòu),三、rRNA,占RNA總量的80,四、mRNA和hnRNA,占細(xì)胞總RNA的35,真核細(xì)胞mRNA的3-末端有一段長達(dá)200個核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA),稱為 “尾結(jié)構(gòu)” ,5 -末端有一個甲基化的鳥苷酸,稱為” 帽結(jié)構(gòu)“ 。,五、snRNA (small nucleic RNA 核小RNA) scRNA (small cytoplasmic RNA) asRNA (antisense RNA),第五節(jié) 核酸的性質(zhì),二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中,由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系,因而具有獨特的紫外線吸收光譜,一般在260nm左右有最大吸收峰,可以作為核
10、酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。 以A260/A280進行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠(EB),在紫外下發(fā)出熒光,三、核酸的變性、復(fù)性與分子雜交,1. 變性 穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂,空間結(jié)構(gòu)破壞,變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 變性表征 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加(增色效應(yīng)) 變性因素 pH(11.3或5.0) 變性劑(脲、甲酰胺、甲醛) 低離子強度 加熱,DNA的變性過程是突變性的,它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此,通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時的溫度稱熔解溫度,用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之間。
11、DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。 G和C的含量高,Tm值高。因而測定Tm值,可反映DNA分子中G, C含量,可通過經(jīng)驗公式計算:(G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,2. 熱變性和Tm,3. 核酸的復(fù)性,變性核酸的互補鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下,重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。 DNA復(fù)性后,一系列性質(zhì)將得到恢復(fù),但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù),具有減色效應(yīng)。 將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時,DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性,因此又稱為“退火”。 退火溫度Tm25 復(fù)性影響因素 片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性(重復(fù)序列數(shù)目)/ 溶液離子強度,4.分子雜交,DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。 核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。 Southern 雜交(Southern bolting) Northern 雜交(Northern bolting) Western 雜交 (Western bolting),四、核酸的序列測定,雙脫氧鏈終止法(Sanger酶法) 2. Gilbert化學(xué)降解法,本 章 小 結(jié),核酸是
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