9.基因工程抗體和抗體工程.ppt

1、第五節(jié) 抗體工程,抗體研究進(jìn)展3個(gè)階段： 1890年白喉抗毒素，多克隆抗體； 1975年雜交瘤技術(shù)單克隆抗體； 1994年基因工程抗體；,C genes code for the constant regions of immunoglobulin protein chains.V gene is sequence coding for the major part of the variable (N-terminal) region of an immunoglobulin chain.,Immunoglobulin genes are assembled from their parts

2、 in lymphocytes,Figure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete domains.,Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Figure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete domains.,Immunoglo

3、bulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Table 24.1 Each immunoglobulin family consists of a cluster of V genes linked to its C gene(s).,Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Figure 24.5 The lambda C gene segment is preceded by a J segment, so that V-J r

4、ecombination generates a functional lambda light-chain gene.,Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Figure 24.6 The kappa C gene segment is preceded by multiple J segments in the germ line. V-J joining may recognize any one of the J segments, which is then spliced to the

5、C gene segment during RNA processing.,Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes,Figure 24.7 Heavy genes are assembled by sequential joining reactions. First a D segment is joined to a J segment; then a V gene segment is joined to the D segment.,Immunoglobulin genes are assem

6、bled from their parts in lymphocytes,Figure 24.8 The lambda family consists of V gene segments linked to a small number of J-C gene segments.,The diversity of germline information,Figure 24.9 The human and mouse kappa families consist of V gene segments linked to 5 J segments connected to a single C

7、 gene segment.,The diversity of germline information,Figure 24.10 A single gene cluster in man contains all the information for heavy-chain gene assembly.,The diversity of germline information,Figure 24.12 Consensus sequences are present in inverted orientation at each pair of recombining sites. One

8、 member of each pair has a spacing of 12 bp between its components; the other has 23 bp spacing.,Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangements,Figure 24.13 Breakage and reunion at consensus sequences generates immunoglobulin genes.,Recombination between V and C g

9、ene segments generates deletions and rearrangements,Figure 15.8 Reciprocal recombination between direct repeats excises the material between them; each product of recombination has one copy of the direct repeat.,Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangements,Figur

10、e 15.9 Reciprocal recombination between inverted repeats inverts the region between them.,一、噬菌體抗體庫技術(shù)的基本方法,獲取目的基因 抗體庫技術(shù)的載體 淘篩 表達(dá)與鑒定,它是在PCR技術(shù)和Phage Display的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與P 或P相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對(duì)噬菌體表面的抗體分子進(jìn)行篩選。,噬菌體抗體庫技術(shù),1990年Mc Caffe

11、rty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。,噬菌體表面展示系統(tǒng)(phage surface display system ),噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn):,外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端,將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8 的先導(dǎo)系列的緊靠下游,隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫,從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段,用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)

12、直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。,使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。,篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，,該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來; 可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù); 抗體基因篩選的范圍廣; 技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短;可規(guī)?；a(chǎn); 適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。,噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細(xì)胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統(tǒng)一和識(shí)別一增殖過程

13、上模擬了B細(xì)胞的成熟過程，從而在實(shí)際應(yīng)用上具有很大意義。,二、噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn),模擬天然全套抗體庫 避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 可獲得高親和力的人源化抗體,單克隆抗體 噬菌體抗體 雜交瘤技術(shù) 展示技術(shù),宿主細(xì)胞: 雜交瘤 細(xì)菌 篩選范圍 : 103 107109 時(shí)間: 幾個(gè)月 幾周 操作: 繁雜 相對(duì)簡單 免疫: 必須 可避免 人源抗體: + 費(fèi)用: 高 低 生產(chǎn)量: 有限 無限 基因獲取: 再克隆 直接 應(yīng)用前景: 有限 不可估,三、基因工程抗體表達(dá),原核細(xì)胞表達(dá) 真核細(xì)胞表達(dá) 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá),第六節(jié) 抗體診斷試劑,一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑 鑒定病原菌的抗體試劑

14、常用診斷血清的品種和用途 沙門氏菌屬診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 病原性大腸埃希氏菌診斷血清,診斷血清的制備步驟 制備細(xì)菌抗原 免疫動(dòng)物和制備抗體血清 診斷血清診斷方法,乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被動(dòng)血凝診斷試劑 妊娠診斷試劑 抗ABO血型系統(tǒng)血清,二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑,熒光抗體診斷試劑 熒光抗體的制備 免疫熒光測定方法 免疫酶抗體診斷試劑 免疫酶染色法用抗體診斷試劑 酶免疫測定用抗體診斷試劑 HBsAg酶標(biāo)診斷試劑 HBeAg酶標(biāo)診斷試劑,HAVAg（甲型肝炎病毒抗原） 酶標(biāo)診斷試劑 測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶標(biāo)抗體診斷試劑 甲胎蛋白（AFP）酶標(biāo)抗體診 斷試劑 癌胚

15、抗原（CEA）的酶標(biāo)抗體 診斷試劑,放射免疫用抗體診斷試劑 放射免疫技術(shù)是將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來建立的檢測技術(shù)。 放射性核素標(biāo)記抗體的方法： 氯胺-T法 Iodogen氏法,抗原的測定有： 夾心法 間接法 竟?fàn)幏?3.競爭法 Ag AgAb + Ab Ag(標(biāo)本) (定量) AgAb,E,E,終止液,標(biāo)本,酶標(biāo)抗體,底物,顯色,顯色,固相,固相,標(biāo)本,酶標(biāo)二抗,底物,1.夾心法,2.間接法,HBsAg放射性核素標(biāo)記抗體 診斷試劑 HBeAg放射性核素標(biāo)記抗體 診斷試劑 HAV抗原放射性核素標(biāo)記抗體 診斷試劑 AFP放射性核素標(biāo)記抗體 診斷試劑 CEA放射性核

16、素標(biāo)記抗體 診斷試劑,常用標(biāo)記抗體試劑有：,三、導(dǎo)向診斷藥物,放射性核素標(biāo)記抗體 腫瘤放射免疫顯像 放射免疫顯像優(yōu)點(diǎn)： 在體內(nèi)確切腫瘤定位作用，準(zhǔn)確性達(dá)90%，靈敏度達(dá)100%。 在體內(nèi)可檢出0.5cm大小的病灶，并可檢出肺腦的轉(zhuǎn)移灶。,小分子抗體易到達(dá)腫瘤部位， 可顯著提高N/NT值。 抗體在腫瘤部位可保留69日 能觀擦抗體在血中的半衰期和 可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。,放射免疫顯像定位技術(shù) 將抗腫瘤單克隆抗體（Ab）與二乙基三胺五乙酸（DTPA）在體外偶聯(lián)成Ab-DTPA，再注入體內(nèi)后，就能與體內(nèi)組織相結(jié)合。由于抗體分子量大，需3天完成。3天后注入放射性核素In-113M（半衰期100m），因DT

17、PA是重金屬離子絡(luò)合劑，所以In-113M可以結(jié)合到DTPA分子上，使腫瘤組織顯像。這一過程在2小時(shí)內(nèi)可完成。,建立預(yù)定位技術(shù)需解決3個(gè)問題： 抗體在腫瘤組織滯留要7天以上。 Ab-DTPA偶聯(lián)物比較穩(wěn)定； 內(nèi)源性金屬離子對(duì)DTPA的封閉 作用要小。,第六節(jié) 抗體治療藥物,以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟。 一、放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物 抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡便用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。,二、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物 常用的抗癌藥物 氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的

18、MTX量，使體外細(xì)胞毒性體高二倍。,抗體類藥物逆轉(zhuǎn)耐藥性 腫瘤細(xì)胞對(duì)抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性（MDR）。 MDR是由基因調(diào)控的，其編碼蛋白稱為P糖蛋白，其中P170是與腫瘤耐藥相關(guān)的主要蛋白，由Mdr1基因編碼，1280氨基酸殘基，分子量170K。,認(rèn)為P蛋白是ATP酶依賴性藥泵，藥物進(jìn)入細(xì)胞后與P蛋白結(jié)合，利用ATP水解釋放的能量將藥物泵出胞外，使胞內(nèi)藥物蓄積減少，因而產(chǎn)生耐藥性。,三、毒素偶聯(lián)的抗體藥物 免疫毒素及其換代制品 在導(dǎo)向藥物中，毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯(lián)物，其中B鏈非特異性結(jié)合，使其僅在體外應(yīng)用。,第二代免疫毒素是利用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結(jié)合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在