儀器分析平面色譜法.ppt

1、1,平面色譜法,plane chromatography,2,色譜分類,GC LC SFC,3,概述,平面色譜法是在平面上進(jìn)行分離的一種色譜方法 是一種基于混合物組分在固定相和流動(dòng)相之間的不均勻分配或保留而將其分離的方法,4,特點(diǎn)：,方便、快速、成本較低，易于推廣 樣品的預(yù)處理比較簡(jiǎn)單 應(yīng)用范圍廣 展開劑選擇范圍寬,5,歷史簡(jiǎn)介,1938年，俄國(guó)人Izmailov和Shraiber首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄膜上分離一種天然產(chǎn)物。 1949年，兩位美國(guó)化學(xué)家報(bào)導(dǎo)了用薄層色譜法成功地分離了精油中的萜烯。 1958年，德國(guó)化學(xué)家Stahl系統(tǒng)描述了用作涂布薄層的材料（薄層色譜固定相）和涂板設(shè)備，對(duì)薄層色譜

2、技術(shù)也進(jìn)行了規(guī)范化描述。 Stahl于1965年出版了薄層色譜法一書。,6,20世紀(jì)80年代,出現(xiàn)了儀器化薄層色譜法，薄層色譜的每一步均用儀器來(lái)代替以往的手工操作，再配以薄層掃描儀，這樣就使薄層色譜法的定量結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性大大提高。,7,平面色譜參數(shù),定性參數(shù) 相平衡參數(shù) 面效參數(shù) 分離參數(shù),8,（一）定性參數(shù),比移值（Rf） Rf = L/ L0 相對(duì)比移值（Rr） Rr = Rf(i) / Rf(s) = Li / Ls,最佳范圍 0.3 0.5 可用范圍 0.2 0.8,9,（二）相平衡參數(shù),分配系數(shù)（distrabution coefficient; K ） 容量因子（capaci

3、ty factor; k）,保留比R是在單位時(shí)間內(nèi)一個(gè)分子在流動(dòng)相中出現(xiàn)的幾率。在平面色譜中，也可表示組分分子在平面上移動(dòng)的速度,10,當(dāng)Vs和Vm固定時(shí)，Rf 由K決定 K不等是分離的前提 當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件固定時(shí)，K只與組分性質(zhì)有關(guān),Rf為1 的組分，K與k為0，表示該組分不被固定相保留； Rf為0 的組分，K與k為，表示該組分停留在原點(diǎn)，完全被固定相所保留。,11,思考題：,下列色譜參數(shù)中數(shù)值在01之間的是（ ） ARf Br CR Dk,12,（三）面效參數(shù),理論塔板數(shù) L為原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離，W為組分斑點(diǎn)的縱向?qū)挾取?塔板高度 H = L0 / n L0為斑點(diǎn)到溶劑前沿的距離,13,（四）

4、分離參數(shù),分離度（resolution R） 分離數(shù)（separation number SN）,14,（四）分離參數(shù),分離數(shù)（separation number SN） 在相鄰峰的分離度為1.177時(shí)，在Rf=0及Rf=1兩種組分的色譜峰間能容納的色譜峰數(shù)。SN越大，薄層板的容量越大。,15,第二節(jié) 薄層色譜法（thin layer chromatography; TLC）,將細(xì)粉狀的吸附劑或載體（固定相）涂布于玻璃板、塑料板或鋁箔上，成一均勻薄層并進(jìn)行活化，將混合物樣品與對(duì)照品溶液點(diǎn)在同一薄板的一端（原點(diǎn)），在密閉的容器中用適當(dāng)?shù)娜軇鲃?dòng)相或展開劑）展開，顯色后樣品斑點(diǎn)與對(duì)照品斑點(diǎn)進(jìn)行比

5、較，用于定性鑒別或含量測(cè)定的方法。,16,特點(diǎn),分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中 靈敏度高，g ng 展開時(shí)間短，min 試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單，對(duì)被分離組分性質(zhì)沒(méi)有限制 上樣量較大 所用儀器簡(jiǎn)單，操作方便,17,一、薄層色譜法的主要類型,吸附薄層色譜法 固定相為吸附劑 一般極性大的組分移動(dòng)速度慢 分配薄層色譜法 固定相為液體（吸附于載體上），固定相極性大于流動(dòng)相極性時(shí)為正相色譜 在正相色譜中極性大的組分移動(dòng)速度慢,18,二、吸附薄層色譜的吸附劑和展開劑,（一）吸附劑 硅膠 氧化鋁 硅膠具微酸性適于分離酸性和中性物質(zhì) 氧化鋁具微堿性適于分離堿性和中性物質(zhì),19,硅膠,表面帶有硅醇基呈弱酸性，硅醇基與極性基團(tuán)形成氫

6、鍵而表現(xiàn)其吸附性能，不同組分的極性基團(tuán)因與硅醇基形成氫鍵的能力不同而被分離。 硅膠吸水形成水合硅醇基而失去吸附能力，加熱（105110）可失去水而提高活度，增加吸附能力，這一過(guò)程稱為“活化” 。 含水量越多，級(jí)數(shù)越高，吸附能力越弱，同一組分在此硅膠上的Rf值越大。,20,氧化鋁和硅膠含水量與活性的比較,21,與硅膠的分離效率有關(guān)的是,粒度和孔徑 硅膠粒度越小，均勻性越好，分離效率越高； 表面積 硅膠表面積越大，則與樣品之間的相互作用越強(qiáng)，即吸附力越強(qiáng)。,22,氧化鋁,堿性（pH910）分離堿性（生物堿）、中性物質(zhì) 中性（pH7.5）廣泛 酸性（pH45）酸性、中性,23,商品出售的薄層色譜用氧

7、化鋁和硅膠有：,氧化鋁（硅膠） G，表示含有粘合劑煅石膏； 氧化鋁（硅膠） H ，表示不含有粘合劑； 氧化鋁（硅膠）HF254，表示不含粘合劑而含有熒光物質(zhì)；在254nm波長(zhǎng)紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光背景。,24,（二）展開劑,薄層色譜中的展開是在一個(gè)具有一定空間和形狀的密閉容器中，展開劑沿薄層（固定相）運(yùn)動(dòng)。 通過(guò)組分分子與展開劑分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心而達(dá)到分離。,25,展開劑的選擇,主要是根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活度和展開劑的極性三者的相對(duì)關(guān)系進(jìn)行選擇 先用單一溶劑展開，然后根據(jù)分離效果進(jìn)行調(diào)整，經(jīng)常使用混合展開劑 分離酸堿組分時(shí)，展開中加入少量酸、堿。,26,化合物極性、吸附劑活

8、度和展開劑極性間的關(guān)系,27,三、薄層色譜操作方法,薄層板制備 點(diǎn)樣 展開 顯色,28,薄層板制備,玻璃板的大小 軟板不加粘合劑 硬板加粘合劑如515%石膏 或 0.250.75%CMC-Na,29,點(diǎn)樣,配樣溶劑的選擇 取決于待分析化合物的類型及其特性，相似相溶。合適的樣品濃度應(yīng)為0.01%0.1% 點(diǎn)樣量 影響展開后樣品的形狀和位置。一般而言，樣品量在最小檢測(cè)限的幾倍至幾十倍是比較恰當(dāng)?shù)?。點(diǎn)樣量一般為幾微升。,30,展開,展開劑流速 展開劑在薄層中的流速與展開劑的粘度、表面張力、吸附劑種類、粒度、均勻度、展開距離等因素有關(guān)。 薄層板上吸附劑的顆粒越粗，展開劑遷移速度越快；薄層板上吸附劑的顆

9、粒越細(xì)且均勻，展開劑移動(dòng)速度越慢。,31,展開,展開器皿 使用的器皿一般為長(zhǎng)方形密閉玻璃缸，稱為層析缸或色譜缸。 展開方式 常用上行法，另外還有下行法、徑向展開、多次展開 、雙向展開。,32,展開過(guò)程中注意溶劑蒸氣飽和,邊緣效應(yīng) 同一物質(zhì)在同一薄層板上出現(xiàn)中間部分的Rf值比邊緣的Rf值小，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。 產(chǎn)生原因 防止邊緣效應(yīng) 密閉容器，先用溶劑蒸氣飽和。,33,顯色斑點(diǎn)的定位,有色物質(zhì) 日光下觀察 有紫外吸收 紫外燈下觀察 在熒光背景下呈現(xiàn)暗斑 無(wú)色物質(zhì) 噴灑顯色劑,34,四、定性和定量分析,定性分析 Rf值 定量分析 洗脫法 直接定量法,目視比色法 薄層掃描法,35,五、高效薄層法

10、,高效薄層色譜法（high performance thin layer chromatography；HPTLC） 是在現(xiàn)代色譜理論指導(dǎo)下，以經(jīng)典薄層色譜法為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一種新型薄層色譜技術(shù)。,36,特點(diǎn),分離效率高 分析速度快 檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn) 高效薄層色譜法與經(jīng)典薄層色譜法比較見表18-2,37,六、薄層掃描法,用一定波長(zhǎng)的光束照射展開后的薄層板，測(cè)定薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度A（或熒光強(qiáng)度F）隨展開距離l的變化，所記錄的Al（或Fl）曲線稱為薄層色譜掃描圖，利用薄層掃描圖進(jìn)行定量及定性分析的方法成為薄層掃描法。,38,薄層吸收掃描法,透過(guò)法與反射法 單波長(zhǎng)法和雙波長(zhǎng)法,39,測(cè)定波長(zhǎng)的選

11、擇,常采用雙波長(zhǎng)法s 選用被測(cè)組分的最大吸收波長(zhǎng)，R選用不被被測(cè)組分吸收的波長(zhǎng)（薄層板的空白吸收）。由于從測(cè)量值中減去了薄層本身的空白吸收，所以在一定程度上消除了薄層不均勻的影響，使測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度提高。,40,反射法測(cè)定,測(cè)光方式可分為透射法及反射法 透射法比反射法強(qiáng)度大，但受外界條件的影響較大，使用上受到限制。因此常用反射法,41,掃描方法,線形掃描快速，但在斑點(diǎn)不規(guī)則和濃度不均勻時(shí)測(cè)量誤差較大。 曲折形掃描適用于形狀不規(guī)則及濃度分布不均勻的斑點(diǎn)。,42,散射參數(shù)的選擇,由于吸光度與斑點(diǎn)中組分的量不成線性，即不遵守比耳定律，故校正曲線成彎曲狀，需要將其校正為直線。 曲線校正是將散射參數(shù)和處理

12、方法存入計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)根據(jù)適當(dāng)?shù)男拚绦?，自?dòng)進(jìn)行校正給出符合一定線性關(guān)系的數(shù)值，從而得到一定線性的定量工作曲線 硅膠薄層板一般選，氧化鋁薄層板選。,43,薄層色譜掃描法的定量分析,外標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法 歸一化法,44,外標(biāo)兩點(diǎn)法定量,45,七、薄層色譜的應(yīng)用及實(shí)例,廣泛應(yīng)用于各種天然和合成有機(jī)物的分離和鑒定，有時(shí)也可用于小量物質(zhì)的精制。 藥品質(zhì)量監(jiān)控，可用于測(cè)定藥物的純度和檢查降解產(chǎn)物。 在生產(chǎn)上可用于判斷反應(yīng)終點(diǎn)，監(jiān)視反應(yīng)過(guò)程。 對(duì)中藥和中成藥，薄層色譜鑒別應(yīng)用廣泛，可鑒別有效成分，進(jìn)一步進(jìn)行含量測(cè)定。,46,實(shí)例,判斷合成反應(yīng)進(jìn)行的程度鹽酸普魯卡因合成過(guò)程 藥品的鑒別和純度檢查硫酸長(zhǎng)春堿的雜質(zhì)檢查 天然藥物的鑒別和定量測(cè)定六應(yīng)丸中有效成分的定性和定量,47,第三節(jié) 紙色譜法,一、分離原理 紙色譜法（paper chromatography）是以紙為載體的平面色譜法。紙色譜法分離原理屬于分配色譜的范疇。與薄層色譜相同，紙色譜