蛋白質(zhì)組學(xué)Proteomics課件

1、Proteomics 蛋白質(zhì)組學(xué),何劍為 ,“Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of their localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately, their function.” -Stan Fields in Science, 2001.,什么是蛋白質(zhì)組學(xué),Genomics,Transcriptomics,Proteom

2、ics,什么是蛋白質(zhì)組學(xué),基因組學(xué),研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問(wèn)。用于概括涉及基因作圖、測(cè)序和整個(gè)基因組功能分析（后基因組學(xué)）的遺傳學(xué)分支。,轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。,不是十萬(wàn)個(gè),Cataloguing Proteomics Protein catalogue-what proteins are there in a cell, tissue,organelle, etc. Expression proteomics: analysis of differential protein expression Functional proteomics:

3、 posttranslational modifications protein-protein, protein-ligand interactions sequence-structure-function relationships,蛋白質(zhì)組學(xué)傳達(dá)了什么信息？,特定細(xì)胞組織中的任意時(shí)間存在的全部蛋白； 蛋白蛋白相互作用的大規(guī)模研究； 提供醫(yī)學(xué)診斷和預(yù)防的新途徑（例：體液蛋白質(zhì)分析）； 補(bǔ)充現(xiàn)有醫(yī)學(xué)技術(shù)，如：免疫蛋白質(zhì)組學(xué)，了解藥物的作用及副作用； 宏蛋白質(zhì)組學(xué)：鳥(niǎo)槍法分析微生物物種混合物。,尚未清楚？,低豐度、質(zhì)量大、極酸、堿性蛋白檢測(cè)樣品分級(jí)； 蛋白相互作用組不可能比較-藍(lán)綠溫和膠電泳

4、法； 無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)組變化-高倍率顯微鏡活細(xì)胞分析； 半定量； 產(chǎn)生普通型和標(biāo)準(zhǔn)型蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)； 需采用先進(jìn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析； 數(shù)據(jù)解釋仍是瓶頸問(wèn)題。,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),蛋白質(zhì)鑒定,比較蛋白質(zhì)組學(xué),質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的原理及具體流程,雙向凝膠電泳,初分離技術(shù)-SDS-Page, antibody column, PF2D,LC-MS/MS,2DE-MALDI-TOF/TOF 雙向差異凝膠電泳(DIGE),同位素標(biāo)記技術(shù),數(shù)據(jù)分析軟件 (Sequest, X!tandem, TPP),數(shù)據(jù)驗(yàn)證,無(wú)標(biāo)記定量技術(shù),Quantitative Proteomics,Gel-based MS-bas

5、ed,Gel Based Techniques,1D Gel Analysis,1D Gel Analysis,Strengths: Simple In expensive sample prep Membrane proteins High MW proteins (100 kDa),Limitations: Limited resolution Low MW Proteins (7kDa) Not Quantitative,Principle of 2-D Gel Electrophoresis,First dimension: according to the isoelectric p

6、oint (isoelectric focusing) Second dimension: separation according to molecular weight (SDS gel electrophoresis),2D Gel Analysis No Labeling,Difference Gel Electrophoresis (DIGE),Strengths/Limitations of2D-DIGE Gels,Strengths Superb resolving power Quantitative comparisons of 2000 proteins on one ge

7、l Simplified comparison between gels Highly reproducible Detect post-translational modifications,Limitations 130,000 Da Strongly hydrophobic Highly basic proteins Difficult to automate Multiple proteins per spot Quantify but not identify,基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定,Mass Spectrometry BasedTechniques,質(zhì)譜分析,高質(zhì)量精確性和高分辨率；

8、 蛋白質(zhì)鑒定：肽質(zhì)量指紋譜和肽段碎片； 定量分析：發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物，而且可以研究?jī)?nèi)外因微擾引起的蛋白質(zhì)組的內(nèi)在變化； 蛋白質(zhì)表征方面：蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對(duì)細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)過(guò)程起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。,MS 概述,離子化 質(zhì)量分析 儀器,質(zhì)譜儀框圖,Ion separation,Detector,Output,Sample Inlet,電子轟擊電離 Electron Impact Ionization, EI 化學(xué)離子化 Chemical Ionization, CI 場(chǎng)電離，場(chǎng)解吸 Field Ionization FD, Field Desorption FD 快原子轟擊 Fast Atom Bomb

9、ardment, FAB 基質(zhì)輔助激光解析電離 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI 電噴霧電離 Electrospray Ionization, ESI 大氣壓化學(xué)電離 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI 表面增強(qiáng)激光解吸電離 Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization, SELDI,離子化的方法,MALDI可使熱敏感或不揮發(fā)的化合物由固相直接得到 離子。待測(cè)物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物 與基質(zhì)成為晶體或

10、半晶體，用一定波長(zhǎng)的脈沖式激光進(jìn)行 照射時(shí)，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子 和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。,MALDI適用于生物大分子，如肽類，核酸類化合物,可得到分子離子峰，無(wú)明顯碎片峰。此電離方式特別適合于飛行時(shí)間質(zhì)譜議。,基質(zhì)輔助激光解析電離Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI),主要應(yīng)用于高效液相色譜HPLC與質(zhì)譜儀的聯(lián)用。從霧化器套管的毛細(xì)管端噴出的帶電液滴，隨著溶劑的不斷快速蒸發(fā)，液滴迅速變小，表面電荷密度不斷增大。由于電荷間的排斥作用，就會(huì)排出溶劑分子，得到樣品的準(zhǔn)分子離子。通常小分子得到帶單電荷的準(zhǔn)分子

11、離子，而大分子則得到多種多電荷離子，檢測(cè)質(zhì)量可提高幾十倍，通常無(wú)碎片離子峰，只有整體分子的峰，有利于生物大分子的質(zhì)譜測(cè)定。,電噴霧電離ElectroSpray Ionization(ESI),樣品流經(jīng)被施加高壓的噴霧針液滴表面聚集大量相同電荷由于靜電排斥作用， 分裂成大量電荷的小液滴通過(guò)對(duì)流熱氣體時(shí)，溶劑蒸發(fā)，小液滴進(jìn)一步變小 表面電荷密度增加當(dāng)達(dá)到瑞利極限時(shí)，液滴分裂、縮小反復(fù)進(jìn)行只剩下帶 電分析物分子單電荷和多電荷的混合物因?yàn)橐砸簯B(tài)形式引入可與液相色譜儀（LC）連用。,扇形磁場(chǎng)質(zhì)量分析器 Magnetic sector 飛行時(shí)間 Time Of Fight, TOF 四極桿 Quadrup

12、ole 離子阱 Ion traps 傅里葉變換離子回旋共振 Fourier transform ion cyclotron resonance， FTICR,質(zhì)量分析器,根據(jù)離子質(zhì)荷比進(jìn)行分離,儀器,目前，有多種離子源、質(zhì)量分析器、離子碎裂裝置的組合方式。 MALDI-TOF (最便宜); MALDI-TOF/TOF; ESI-三重四級(jí)桿； ESI-離子阱； ESI-四級(jí)桿（Q）-TOF; ESI-Q-離子阱； ESI-MALDI-線性離子阱（LTQ）; FT-ICR（造價(jià)最貴）,質(zhì)譜儀的主要技術(shù)指標(biāo),質(zhì)量范圍： 指質(zhì)譜議所檢測(cè)的單電荷離子的質(zhì)荷比范圍,分辨率（R）：分辨率是質(zhì)譜議分開(kāi)相鄰兩離

13、子質(zhì)量的能力。,質(zhì)量精確度： 定義了生物分析物質(zhì)量的測(cè)量值與實(shí)際分子 量的接近程度（用百萬(wàn)分率表示，ppm） 掃描速度: 離子檢測(cè)速度即質(zhì)譜儀獲取數(shù)據(jù)的速度,電場(chǎng)加速后 zV=(1/2)m2 (z-電荷；V-電壓 m-質(zhì)量；-速度),掃描B/V來(lái)獲得質(zhì)譜圖,質(zhì)量分析器使用扇型磁場(chǎng)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便；分辨率低,扇形磁場(chǎng)質(zhì)量分析器(Magnetic sector),磁場(chǎng)中 Bz = m2/r (B-磁場(chǎng)強(qiáng)度； r-半徑) m/z=B2r2/2V,飛行時(shí)間質(zhì)譜議(time of flight,TOF) 用一個(gè)脈沖將離子源中的離子瞬間引出，經(jīng)加速電壓加速，它們具有相同的動(dòng)能進(jìn)入漂移管，質(zhì)荷比小的離子

14、具有最快的速度因而首先到達(dá)檢測(cè)器，質(zhì)荷比大的離子則最后到達(dá)檢測(cè)器。,質(zhì)荷比范圍非常寬，適合于生物大分子，靈敏度高，適合作第二級(jí)， 速度快，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；分辨率隨質(zhì)荷比的增加而降低,TOF分析器,MALDI-TOF MS示意圖。由MALDI離子源產(chǎn)生的離子經(jīng)過(guò)柵極加速，以一定的速度 進(jìn)入無(wú)場(chǎng)飛行管。飛行速度是離子質(zhì)量的函數(shù)，如采用線性檢測(cè)器，可利用檢測(cè)器 測(cè)定離子的飛行時(shí)間。離子反射器可充當(dāng)“電子反射鏡”的作用，使離子轉(zhuǎn)向并以重 聚焦的方式進(jìn)入第二個(gè)檢測(cè)器。,四極桿質(zhì)量分析器（Quadrupole Mass Analyzer）,由四跟平行的棒狀電極組成而得名。相對(duì)的兩個(gè)電極組成一對(duì)，兩對(duì)都帶有射頻電

15、壓（RF）和直流電壓（DC），只是極性相反。四極濾質(zhì)器在質(zhì)量選擇的穩(wěn)定模型下運(yùn)作：在一定RF和DC下，僅一種m/z值的離子能通過(guò)濾質(zhì)器。通過(guò)RF和DC的振幅的不斷改變，四極桿按一定順序選擇某些m/z值的離子依次通過(guò)濾質(zhì)器并達(dá)到監(jiān)測(cè)器，而其它m/z值離子將從過(guò)濾器中去除,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易操作，價(jià)格便宜，不用磁場(chǎng)，真空度較低，定量能 力強(qiáng)；分辨率不高，速度較慢，對(duì)高質(zhì)量離子有質(zhì)量歧視,質(zhì)量分析,通過(guò)質(zhì)荷比的差異將帶電分子分離。 質(zhì)量分析器：四級(jí)桿,離子阱（ion trap） 離子阱與四極桿質(zhì)量分析器的原理類似，因此也稱為四極離子阱（quadrupole ion trap）,由桿和圓環(huán)形的電極（環(huán)形排

16、列）組成電多極。離子均儲(chǔ)存在離子阱中，通過(guò)增加射頻電壓最高值，離子按m/z值不斷增加的順序排出并進(jìn)入監(jiān)測(cè)器，即質(zhì)量-選擇不穩(wěn)定型模式，m/z值與電壓相匹配的離子被排出。,性價(jià)比較高，維護(hù)方便，靈敏度高，質(zhì)量范圍大，可實(shí)現(xiàn)多極時(shí)間上的串聯(lián)質(zhì)譜；一次性能在離子阱中儲(chǔ)存的離子總數(shù)有限，定量能力有限,離子阱分析器,一種能長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存或捕集帶電分子或離子的裝置。,離子阱分析器它是由環(huán)型電極和上、下兩個(gè)端蓋電極構(gòu)成的三維四極場(chǎng)。 原理：將離子儲(chǔ)存在阱里，然后改變電場(chǎng)按不同質(zhì)荷比將離子推出阱外進(jìn)行檢測(cè),傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜議 （Fourier transform ion cyclotron resona

17、nce, FT-ICR） 在ICR中,離子在磁場(chǎng)中的旋轉(zhuǎn)頻率與其m/z的比值是成反比。若施加一射頻場(chǎng)，使其頻率等于某m/z離子的回旋頻率，則離子就會(huì)吸收能量而激發(fā)，即稱之離子回旋共振。離子會(huì)在ICR中以某一特定的頻率運(yùn)動(dòng)，并因此產(chǎn)生能被檢測(cè)板（電極）檢測(cè)到的電流。由于離子頻率與m/z是成比例的，被記錄下來(lái)的信號(hào)繼而從時(shí)間轉(zhuǎn)換為頻域（傅立葉轉(zhuǎn)換，F(xiàn)T）最終計(jì)算得到離子的m/z。,分辨率極高，可達(dá)1106，且不導(dǎo)致靈敏度下降，可實(shí)現(xiàn)多極時(shí)間上的串聯(lián)質(zhì)譜，靈敏度高、質(zhì)量范圍寬、性能可靠；維護(hù)費(fèi)用高，速度不快,混合物中的蛋白質(zhì)成分鑒定 翻譯后修飾的鑒定(PTM)，如磷酸化、甲基化、糖基化 蛋白質(zhì)相互作

18、用關(guān)系 蛋白質(zhì)水平表達(dá)的定量分析,質(zhì)譜能夠告訴我們什么?,基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)流程,PPT綱要,蛋白質(zhì)鑒定,比較蛋白質(zhì)組學(xué),質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的原理及具體流程,雙向凝膠電泳,初分離技術(shù)-SDS-Page, antibody column, PF2D,LC-MS/MS,2DE-MALDI-TOF/TOF 雙向差異凝膠電泳(DIGE),同位素標(biāo)記技術(shù),數(shù)據(jù)分析軟件 (Sequest, X!tandem, TPP),數(shù)據(jù)驗(yàn)證,無(wú)標(biāo)記定量技術(shù),基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定方法,一級(jí)質(zhì)譜儀 (Mass Spectrometry) 肽指紋圖譜 (Peptide Mass Fingerprinting) 串聯(lián)質(zhì)譜儀

19、(Tandem Mass Spectrometry) 圖譜比對(duì) (Spectral alignment) 從頭測(cè)序 (de novo sequencing) 統(tǒng)計(jì)分析 (Statistical validation),蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensional protein identification technology，MudPIT) 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MS/MS or MS2: Tandem Mass Spectrometry）,Peptide Mass Fingerprinting (PMF),PMF如何產(chǎn)生,Protein A acedfhsakdfqea sdfpkivtme

20、eewe ndadnfekqwfe Protein B acekdfhsadfqea sdfpkivtmeeewe nkdadnfeqwfe Protein C acedfhsadfqeka sdfpkivtmeeewe ndakdnfeqwfe,Sequence Mass (M+H) Tryptic Fragments,4842.05 4842.05 4842.05,acedfhsak dfgeasdfpk ivtmeeewendadnfek gwfe acek dfhsadfgeasdfpk ivtmeeewenk dadnfeqwfe acedfhsadfgek asdfpk ivtme

21、eewendak dnfegwfe,PMF如何產(chǎn)生,Protein A acedfhsakdfqea sdfpkivtmeeewe ndadnfekqwfe Protein B acekdfhsadfqea sdfpkivtmeeewe nkdadnfeqwfe Protein C acedfhsadfqeka sdfpkivtmeeewe ndakdnfeqwfe,Sequence Mass (M+H) Mass Spectrum,4842.05 4842.05 4842.05,構(gòu)建理論上PMF數(shù)據(jù)庫(kù),Protein A acedfhsakdfqea sdfpkivtmeeewe ndadn

22、fekqwfe Protein B acekdfhsadfqea sdfpkivtmeeewe nkdadnfeqwfe Protein C acedfhsadfqeka sdfpkivtmeeewe ndakdnfeqwfe,Sequence DB Calc. Tryptic Frags Mass List,acedfhsak dfgeasdfpk ivtmeeewendadnfek gwfe acek dfhsadfgeasdfpk ivtmeeewenk dadnfeqwfe acedfhsadfgek asdfpk ivtmeeewendak dnfegwfe,1007.4251 (A

23、-1) 1112.4894 (A-2) 2098.8909 (A-3) 538.2296 (A-4) 450.2017 (B-1) 1740.7500 (B-2) 1407.6462 (B-3) 1300.5116 (B-4) 1526.6211 (C-1) 664.3300 (C-2) 1593.7101 (C-3) 1114.4416 (C-4),實(shí)驗(yàn) (MALDI) Spectrum,m/z,Abundance,實(shí)驗(yàn)譜圖 vs. 理論譜圖,Query Masses Database Mass List Results,450.2017 (B) 538.2296 (A) 664.3300

24、(C) 1007.4251 (A) 1112.4894 (A) 1114.4416 (C) 1300.5116 (B) 1407.6462 (B) 1526.6211 (C) 1593.7101 (C) 1740.7501 (B) 2098.8909 (A),450.2201 538.2296 698.3100 1007.5391 1199.4916 2098.9909,2 Unknown masses 1 hit on B 3 hits on A Conclude the query protein is A,基于PMF鑒定蛋白質(zhì),實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜圖譜 蛋白酶或酶切位點(diǎn) 已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) 修飾位點(diǎn)及

25、基團(tuán)質(zhì)量 圖譜匹配質(zhì)量判斷 質(zhì)量誤差閾值(100 ppm = 1000.0 0.1 Da) 常用軟件(Prowl, ProFound, Mascot, PepIdent) 預(yù)測(cè)蛋白PI和質(zhì)量，預(yù)判蛋白在膠內(nèi)位置,Challenge 1:質(zhì)量非唯一性,Gly + Gly = 114.043 - Asn = 114.043 Ala + Gly = 128.059 - Gln = 128.059 - Lys = 128.095 Gly + Val = 156.090 - Arg = 156.101 Ala + Asp = Glu + Gly = 186.064 Trp = 186.079 Ser +

26、 Val = 186.100 - Trp = 186.079 u Leu = Ile = 113.084,Challenge 2:酶切不完全,Protein A acedfhsakdfqea sdfpkivtmeeewe ndadnfekqwfe,Sequence Tryptic Fragments (no missed cleavage),acedfhsak (1007.4251) dfgeasdfpk (1183.5266) ivtmeeewendadnfek (2098.8909) gwfe (538.2296),Tryptic Fragments (1 missed cleavage)

27、,acedfhsak (1007.4251) dfgeasdfpk (1183.5266) ivtmeeewendadnfek (2098.8909) gwfe (538.2296) acedfhsakdfgeasdfpk (2171.9338) ivtmeeewendadnfekgwfe (2689.1398) dfgeasdfpkivtmeeewendadnfek (3263.2997),PMF鑒定法優(yōu)缺點(diǎn),使用2DE-MALDI-TOF，費(fèi)用低廉,所鑒定蛋白質(zhì)序列必須已知 不適用于3種蛋白以上的混合物 敏感性不夠，肽段缺失導(dǎo)致沒(méi)有結(jié)果 精確性不高 2DE中只有大約40%的點(diǎn)能得到鑒定,常

28、用的質(zhì)量紋算法,現(xiàn)在試驗(yàn)中可用的算法有： Mascot: Profound: /cgi-bin/Profound Expasy tools: http:/www.expasy.ch/tools/ PeptideSearch: http:/mac-mann6.embl-heidelberg.de,PMF中的問(wèn)題,第一個(gè)問(wèn)題：質(zhì)量相近的多肽怎么處理？ 在現(xiàn)實(shí)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中，多肽的數(shù)量是很龐大的。這里面難保不會(huì)有質(zhì)量非常相近的多肽。這樣，就造成了質(zhì)譜圖上的一個(gè)峰可能匹配不止一個(gè)多肽，于是我們就難以知曉這張質(zhì)譜圖究竟代表哪個(gè)蛋白。,質(zhì)量相近的多肽,

29、Peak m/z: 1019.08,解決方案,第一個(gè)解決的辦法是限制用來(lái)搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)。比如，你如果做的試驗(yàn)用的是小白鼠的組織，那么你可以只在鼠類的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，這樣就可以減低出現(xiàn)這種情況的可能性。 第二個(gè)解決的辦法是要求必須有多個(gè)多肽和數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配，才做出最后的蛋白質(zhì)鑒定。,多匹配,DFPIANGER 1019.09,EPISVSSQQMLK 1347.56,VLDALDSIK 974.13,Carbonic anhydrase II,SHHWGYGKHBGPZHWHKDFPIANGERQSPVNIDTKAVVQDPALKPLALVYGEATSRRMVN NGHSFNVEYDDSQDKAVLK

30、DGPLTGTYRLVQFHFHWGSSBBQGSEHTVDRKKYAAELHLV HWNTKYGDFGTAAQQPDGLAVVGVFLKVGDANPALQKVLDALDSIKTKGKSTDFPNFDPG SLLPNVLDYWTYPGSLTTPPLLESVTWIVLKEPISVSSQQMLKFRTLNFNAEGEPELLML ANWRPAQPLKNRQVRGFPK,多匹配可以大大降低隨機(jī)匹配的概率,從而增加結(jié)果的可信度,長(zhǎng)蛋白和短蛋白,第二個(gè)問(wèn)題：長(zhǎng)蛋白可能會(huì)更容易的被匹配。 因?yàn)殚L(zhǎng)蛋白里的多肽數(shù)目較多，即以概率來(lái)算，匹配上的幾率也會(huì)比較大。 質(zhì)量紋算法必須考慮這個(gè)問(wèn)題，給短蛋白一定的補(bǔ)償。,

31、多個(gè)蛋白的情況,第三個(gè)問(wèn)題就是在一張質(zhì)譜圖中可能有多個(gè)蛋白存在。 通常，MALDI-TOF是與雙向電泳連接使用。雙向電泳的一個(gè)電泳點(diǎn)上可能有2-3個(gè)蛋白，這樣就增加了鑒定的難度。 由于無(wú)法預(yù)知一個(gè)電泳點(diǎn)上有多少蛋白質(zhì)，PMF的效果可能會(huì)受到很大的影響。,多肽質(zhì)量紋：小結(jié),質(zhì)量紋算法是用一級(jí)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法。 質(zhì)量紋算法比較簡(jiǎn)單，一般使用較簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)模型，速度一般較快。 質(zhì)量紋算法的效果受到很多方面的限制，首先是儀器精度的限制，其次是樣品中可能有多個(gè)蛋白的限制。這使得質(zhì)量紋算法不是理想的分析復(fù)雜混合物中蛋白成分的方法。,基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定方法,一級(jí)質(zhì)譜儀 (Mass Spectromet

32、ry) 肽指紋圖譜 (Peptide Mass Fingerprinting) 串聯(lián)質(zhì)譜儀 (Tandem Mass Spectrometry) 圖譜比對(duì) (Spectral alignment) 從頭測(cè)序 (de novo sequencing) 統(tǒng)計(jì)分析 (Statistical validation),蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程,利用二級(jí)質(zhì)譜圖,我們剛才談到了，多肽質(zhì)量紋有其先天的不足。其中，最糟糕的是它不能處理多個(gè)蛋白的混合物。 如果我們能夠處理混合物，就可以減少很多用于純化上的時(shí)間和精力。 那么，怎么才能從混合物中鑒定蛋白呢？這就要用到二級(jí)質(zhì)譜。,串聯(lián)質(zhì)譜,蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)

33、流程,CID,CID，即Collision-induced Dissociation，是通過(guò)撞擊使得多肽的肽鍵斷裂的過(guò)程。 在做二級(jí)質(zhì)譜的試驗(yàn)時(shí)，質(zhì)譜儀選擇一級(jí)質(zhì)譜中的一個(gè)峰，也就是對(duì)應(yīng)質(zhì)荷比的這些離子，讓這些離子高速撞擊質(zhì)譜儀中的惰性氣體，使其肽鍵斷裂，這就是CID。,二級(jí)質(zhì)譜圖,在一級(jí)質(zhì)譜圖中，選擇其中的一個(gè)峰，對(duì)其進(jìn)行CID過(guò)程，就得到一張二級(jí)質(zhì)譜圖。 這里的假設(shè)是一級(jí)質(zhì)譜中的一個(gè)峰就對(duì)應(yīng)了一個(gè)多肽，實(shí)際情況可能并不是這樣。 對(duì)于一張一級(jí)質(zhì)譜圖，可以選擇多個(gè)峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的操作。這樣就可以適應(yīng)一張質(zhì)譜圖里有多個(gè)蛋白的情況。,典型二級(jí)質(zhì)譜圖,m/z:質(zhì)量電荷比,APNDFNLK,蛋白質(zhì)組學(xué)

34、串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程,蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程,肽鍵及其斷裂,m/z:質(zhì)量電荷比,蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程,一些常見(jiàn)的特殊情況,除了普通的肽鍵斷裂以外，還經(jīng)常有一些特殊的情況。 Neutral loss: 某些酸性氨基酸可能會(huì)在CID中丟失一個(gè)水分子（H2O），而堿性氨基酸會(huì)在CID中丟失一個(gè)氨分子（NH3）。 翻譯后修飾：有時(shí)，二級(jí)質(zhì)譜中需要考慮某些氨基酸可能被修飾（磷酸化、糖基化等），這些修飾可能改變殘基的分子量。,肽鍵斷裂的說(shuō)明,CID中，肽鍵的斷裂方式有非常多的可能性。關(guān)于具體的斷裂方式，可以去查詢生物化學(xué)方面的書(shū)籍。這些問(wèn)題超過(guò)了本課程的范圍。 通常，我們只考慮b系列和y

35、系列。原因是我們使用的電壓較低，其他系列的離子不易產(chǎn)生。 但實(shí)際上，如果能夠清楚的知道我們究竟需要考慮什么樣的斷裂方式，對(duì)搜索算法的設(shè)計(jì)會(huì)有很大的幫助。,蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程,IPI:IPI00000005.1|VEGA:OTTHUMP00000013879 Tax_Id=9606 Gene_Symbol=NRAS GTPase NRas precursorMTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPMVLVG

36、NKCDLPTRTVDTKQAHELAKSYGIPFIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQYRMKKLNSSDDGTQGCMGLPCVVMIPI:IPI00000006.1|VEGA:OTTHUMP00000162769;OTTHUMP00000166055 Tax_Id=9606 Gene_Symbol=HRAS GTPase HRas precursorMTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVG

37、NKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQHKLRKLNPPDESGPGCMSCKCVLS,Name of the sequence Sequence,Example (open with notepad):,Database format (.fasta),http:/www.ebi.ac.uk/IPI/,蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程,蛋白質(zhì)組學(xué)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程,68000*50 理論圖譜,3000 實(shí)驗(yàn)圖譜,VS,蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件,16 Nodes in-house Linux Cluster, 32 Xeon CPU,

38、 14.5TB storage server,高性能集群計(jì)算機(jī)(HPC),Hangzhou National software center, 512 CPU,蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件,基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定方法,一級(jí)質(zhì)譜儀 (Mass Spectrometry) 肽指紋圖譜 (Peptide Mass Fingerprinting) 串聯(lián)質(zhì)譜儀 (Tandem Mass Spectrometry) 圖譜比對(duì) (Spectral alignment) 從頭測(cè)序 (de novo sequencing) 統(tǒng)計(jì)分析 (Statistical validation),De-novo Sequencing,

39、這種通過(guò)殘基來(lái)鑒定多肽的方法被稱為De-novo Sequencing。 當(dāng)我們擁有近乎完美的二級(jí)質(zhì)譜圖時(shí)，我們可以采用這種De-novo Sequencing的辦法。 但是，實(shí)際情況中，我們并沒(méi)有完美的二級(jí)質(zhì)譜圖，而一點(diǎn)點(diǎn)的不完美，帶來(lái)的誤差是驚人的。,氨基酸質(zhì)量表,組合數(shù)(估計(jì)值）,Database Searching,對(duì)于一張不完美的質(zhì)譜圖，有這么多的組合可以生成之。但是，幸運(yùn)的是，我們還有這個(gè)蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)。 雖然組合有那么多，但是在這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的限制之下，組合數(shù)就大大的減少了。 所以我們可以從數(shù)據(jù)庫(kù)里搜索最好的匹配質(zhì)譜圖的多肽，這樣就有了二級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索算法。,數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的基礎(chǔ),數(shù)

40、據(jù)庫(kù)搜索的基礎(chǔ)很簡(jiǎn)單，就是理論質(zhì)譜圖和試驗(yàn)質(zhì)譜圖之間的一個(gè)比對(duì)。 我們剛才討論了CID的過(guò)程，所以我們知道了殘基產(chǎn)生的規(guī)律，那么，利用這些規(guī)律，我們可以對(duì)每個(gè)多肽產(chǎn)生一張理論的質(zhì)譜圖，用來(lái)和試驗(yàn)質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)，對(duì)它們“相似”的程度做一個(gè)評(píng)分，分?jǐn)?shù)最高的多肽，我們就認(rèn)為它是試驗(yàn)質(zhì)譜圖代表的多肽。,理論質(zhì)譜圖和試驗(yàn)質(zhì)譜圖,圖譜峰之間的質(zhì)量差對(duì)應(yīng)相應(yīng)氨基酸殘基質(zhì)量,s,s,s,e,e,e,e,e,e,e,e,q,q,q,u,u,u,n,n,n,e,c,c,c,基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定方法,數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 VS de novo預(yù)測(cè),de novo,AVGELTK,Database Search,數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 VS

41、 de novo預(yù)測(cè),Advantage: 用于檢測(cè)未知蛋白序列和不確定PTM 無(wú)需掃描蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，速度較快 Disadvantage: 對(duì)質(zhì)譜圖譜質(zhì)量要求比較高 正確性不高,de novo預(yù)測(cè)的正確性,肽段序列完全正確的少于30%,基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定方法,一級(jí)質(zhì)譜儀 (Mass Spectrometry) 肽指紋圖譜 (Peptide Mass Fingerprinting) 串聯(lián)質(zhì)譜儀 (Tandem Mass Spectrometry) 圖譜比對(duì) (Spectral alignment) 從頭測(cè)序 (de novo sequencing) 統(tǒng)計(jì)分析 (Statistical valida

42、tion),不同軟件有不同判定標(biāo)準(zhǔn),9%,19%,7%,34%,5%,4%,22%,Mascot,Each search engine identifies about the same number of spectra,But the overlap is surprisingly small. Different search engines match different spectra.,SEQUEST,X!tandem,不同軟件有不同判定標(biāo)準(zhǔn),如何進(jìn)行可靠性的統(tǒng)計(jì)分析,TPP（Trans-Proteomic Pipeline）,teomecenter.

43、org/TPP.php,蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析流程,定量蛋白質(zhì)組學(xué),代謝標(biāo)記,假設(shè)來(lái)寫(xiě)一兩本書(shū),Stable Isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC),細(xì)胞培養(yǎng)液中去除天然精氨酸和賴氨酸 替代以輕重同位素標(biāo)記的精氨酸和賴氨酸(13C6, 15N4 Arginine and13C6 Lysine) 或其他氨基酸； 使用去除游離氨基酸的血清,體內(nèi)標(biāo)記，更徹底高效 無(wú)需化學(xué)標(biāo)記物 無(wú)需親和純化 在細(xì)胞培養(yǎng)的同時(shí)完成標(biāo)記,優(yōu)勢(shì):,細(xì)胞中Leu-d3豐度改變,Doubling time of the cells is 24 hrs

44、. Peptide = VAPEEHPVLLTEAPLNPK,SILAC,Media no Lys and Arg FCS dialyzed to remove free amino acid,Heavy Lys, Arg or both,Unmodified amino acid,3,化學(xué)標(biāo)記,Isotope Coded Affinity Tags (ICAT),Biotin tag,Linker (d0 or d8),Thiol specific reactive group,ICAT Reagents:,Heavy reagent: d8-ICAT (X=deuterium) Norma

45、l reagent: d0-ICAT (X=hydrogen),S,N,N,O,N,O,O,O,N,I,O,O,Han, D.K., Eng, J., Zhou, H. and Aebersold, R. (2001) Quantitative profiling of differentiation-induced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nat Biotechnol, 19, 946-951.,Combine and proteolyze,Affinity se

46、paration,Quantitation and protein identification,ICAT-labeled cysteines,550,560,570,580,m/z,0,100,200,400,600,800,m/z,0,100,NH2-EACDPLR-COOH,Light,Heavy,Mixture 2,Mixture 1,Optional fractionation,Protein Quantification & Identification,Ion exchange,LC-MS/MS,Enrich for membrane proteins Or Isolate Pr

47、otein Complexes,LC-MS/MS,Liquid Chromatography -Mass Spectrometry,分流器,LC-MS/MS,單次實(shí)驗(yàn)?zāi)芡瑫r(shí)掃描，鑒定并定量幾百個(gè)蛋白； 節(jié)省樣品準(zhǔn)備工作，相對(duì)二維電泳能節(jié)省時(shí)間和花費(fèi)； 具有更好的敏感性和精確性； 能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的高通量實(shí)驗(yàn)流程；,同位素標(biāo)記法定量,輕重同位素標(biāo)記的肽段在質(zhì)譜圖譜中會(huì)生成兩個(gè)信號(hào)峰 對(duì)肽段的定量是通過(guò)定量該肽段的單離子峰圖的豐度,M/Z,light,heavy,標(biāo)記物能與蛋白質(zhì)普遍結(jié)合 標(biāo)記效率要高 標(biāo)記物有很好的穩(wěn)定性 標(biāo)記物不能抑制樣品離子化和碎片化 輕重標(biāo)記物有一定的質(zhì)量差異 輕重標(biāo)記物能同時(shí)

48、從色譜柱上洗脫下來(lái),同位素標(biāo)記,沒(méi)有半胱氨酸 ICAT的反應(yīng)基團(tuán)不能連上半胱氨酸 蛋白修飾影響 基團(tuán)碎片化 只能兩兩比較,ICAT的不足之處,ITRAQ （isotope Tags for Relative and Absolute Quantitation） 可同時(shí)對(duì)四個(gè)樣品進(jìn)行標(biāo)記做定量分析，最近又推出可同時(shí)標(biāo)記8個(gè)樣本標(biāo)記的ITRAQ技術(shù)；該試劑分子有三個(gè)部分組成，報(bào)告基團(tuán)，用于定量，其分子量分別由114-117逐一增加；平衡基團(tuán)，用于平衡報(bào)告基團(tuán)帶來(lái)的分子量的差異；反應(yīng)基團(tuán)，與氨基酸的N末端反應(yīng)結(jié)合。前體肽段被二級(jí)質(zhì)譜選擇后被CID打碎，形成的b離子和y離子用于蛋白的定性，被打斷游離出

49、的報(bào)告基團(tuán)用于定量。,附表： 質(zhì)譜標(biāo)記定量數(shù)據(jù)分析軟件,單離子峰圖,LC-MS/MS,單離子峰圖,Fan Mo et al., BMC bioinfomatics, 2010,單離子峰圖定量,PPT綱要,蛋白質(zhì)鑒定,比較蛋白質(zhì)組學(xué),質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的原理及具體流程,雙向凝膠電泳,初分離技術(shù)-SDS-Page, antibody column, PF2D,LC-MS/MS,2DE-MALDI-TOF/TOF 雙向差異凝膠電泳(DIGE),同位素標(biāo)記技術(shù),數(shù)據(jù)分析軟件 (Sequest, X!tandem, TPP),數(shù)據(jù)驗(yàn)證,無(wú)標(biāo)記定量技術(shù),基于肽段的單離子峰強(qiáng)度的方法 基于蛋白的對(duì)應(yīng)肽段個(gè)數(shù)的方

50、法,1.峰信號(hào)的計(jì)算 2.峰信號(hào)濾噪處理 3.峰面積的計(jì)算以及差異定量 這個(gè)過(guò)程一般由計(jì)算機(jī)軟件來(lái)完成,Lable free,PPT綱要,蛋白質(zhì)鑒定,比較蛋白質(zhì)組學(xué),質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的原理及具體流程,雙向凝膠電泳,初分離技術(shù)-SDS-Page, antibody column, PF2D,LC-MS/MS,2DE-MALDI-TOF/TOF 雙向差異凝膠電泳(DIGE),同位素標(biāo)記技術(shù),數(shù)據(jù)分析軟件 (Sequest, X!tandem, TPP),數(shù)據(jù)驗(yàn)證,無(wú)標(biāo)記定量技術(shù),12種常見(jiàn)蛋白質(zhì)占血清蛋白的96,Albumin,IgA,IgG total,IgM,Transferrin,Fibrinogen,a2-Macroglobulin,a1-Antitrypsin,Haptoglobin,Apolipoproteins A-1 & A-II,a1-Acid Glycoprotein,血液蛋白質(zhì)組學(xué)分析的挑戰(zhàn) 血液蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)范圍極大 22種常見(jiàn)蛋白質(zhì)占血清蛋白的99，低豐度的蛋白質(zhì)會(huì)被由優(yōu)勢(shì)蛋白所掩蓋。而正是這些低豐度的蛋白能夠提供可能鑒別疾病的關(guān)鍵多維參數(shù)。,初分離-抗體柱,SDS-page LC-MS/MS,In-Gel t