生物化學與分子生物學課件：五年制 分子生物學技術(shù)（第八版）

1、常用分子生物學技術(shù)的原理及應(yīng)用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology,第二十章,第一節(jié),分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique,核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。,

2、一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理,（一）印跡技術(shù),利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。,用放射性核素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,（二）探針技術(shù),二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用,（一）DNA印跡 (Southern blotting),（二）RNA印跡 (Northern blotting),（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western blotting),用于基因組DN

3、A、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。,Southern印跡分析基本流程,其他： 斑點印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization) DNA點陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù) (DNA chip),斑點印跡 (dot blotting),放射自顯影照片,第二節(jié),PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用 The Principle and Application of PCR Technology,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、PCR技術(shù)的工作原理,PC

4、R的基本反應(yīng)步驟,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,模板DNA 特異性引物 耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR體系基本組成成分,利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段； 利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段； 利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。,二、PCR技術(shù)的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。,PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA

5、微量分析的最好方法。,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突變,將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度； 待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。,PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性 。,（四）DNA序列測定,（五）基因突變分析,逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。 RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),三、幾種重要的PCR衍生技

6、術(shù),原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內(nèi)進行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。 原位PCR方法彌補了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。,（二）原位PCR技術(shù),（三）實時PCR技術(shù),實時PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。,第三節(jié),基因文庫 Gene Library,基因組DNA文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫(cDNA library),

7、基因文庫(gene library),是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。,一、基因組DNA文庫,基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。,用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。,cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。,二、cDNA文庫,基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選,第四節(jié),生物芯片技術(shù) Biological Chip Technique,是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律

8、地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNA microarray)。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),基因芯片工作流程示意圖,第五節(jié),生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),酵母雙雜交 各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析

9、噬菌體顯示系統(tǒng)篩選,常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),標簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。,（一）標簽蛋白沉淀,標簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。,標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖,（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途,酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用,證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學推測。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。 將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。,電泳遷移率變動測定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gel shift assay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。,二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù),（一）電泳遷移率變動測定,EMSA (electrophoretic mobi