普通可食用堅(jiān)果種子的抗氧化和抗增殖活性.ppt

,常見(jiàn)可食用堅(jiān)果的抗氧化和抗增殖活性,目錄,一、研究進(jìn)展 二、研究目的 三、研究?jī)?nèi)容 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 五、實(shí)驗(yàn)總結(jié) 六、展望,一、研究進(jìn)展,堅(jiān)果是不飽和脂肪酸，蛋白質(zhì)，纖維，微量營(yíng)養(yǎng)素，維生素，和植物化學(xué)物質(zhì)豐富的來(lái)源，不同的堅(jiān)果含量水平不同。 堅(jiān)果是植物化學(xué)物質(zhì)的一個(gè)很好的來(lái)源的，包括酚類(lèi)（丹寧酸，鞣花酸，和姜黃素），黃酮（木犀草素，槲皮素，楊梅素，山柰酚，和白藜蘆醇），大豆異黃酮（木黃酮和大豆黃酮），萜類(lèi)化合物和維生素e 。,一、研究進(jìn)展,堅(jiān)果對(duì)人類(lèi)健康的作用： 1、有利的脂肪酸： a-亞麻酸抗心律失常，飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸有利于葡萄糖和胰島素動(dòng)態(tài)平衡 2、抗氧化活性 3、修復(fù)dna損傷 4、減少腫瘤的引發(fā)或促進(jìn)細(xì)胞的調(diào)控分化和增 殖 5、免疫學(xué)活性的調(diào)控和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié),二、研究目的,堅(jiān)果中成分的潛在作用機(jī)制可能是在對(duì)癌癥的預(yù)防還沒(méi)有完全被研究出來(lái)。 到目前為止，關(guān)于堅(jiān)果的研究被大部分重點(diǎn)放到了脂質(zhì)方面。 很少的研究被集中到了堅(jiān)果的植物化學(xué)物質(zhì)上，甚至很少注意到堅(jiān)果的抗氧化性和抗增殖活性。,三、研究?jī)?nèi)容,（1）確定總酚的形態(tài)，包括堅(jiān)果中可溶性游離酚和結(jié)合酚 （2）測(cè)定總抗氧化活性 （3）評(píng)價(jià)堅(jiān)果的抗增殖活性對(duì)人類(lèi)肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的作用 （4）探討抗氧化性或抗增殖活性和總酚和類(lèi)黃酮含量的相關(guān)性,四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,材料：（+）-兒茶素，亞硝酸鈉，福林 - 喬卡梯奧試劑（fcr）， 鹽酸，胰高血糖素，氫化可的松，胰島素，和kmba，氯化鋁，氫氧化鈉，甲醇和丙酮，沒(méi)食子酸，2,20 - 偶氮-異丁基脒（abap） 九常食用堅(jiān)果(杏仁、巴西堅(jiān)果、腰果、榛子、澳洲堅(jiān)果、山核桃、松子、開(kāi)心果和胡桃) 和花生,提取流程圖,方法,1、游離水溶性植物化合物的提取 25g堅(jiān)果+200g 80%預(yù)凍丙酮（1:8 w/w） 混勻攪拌5min均質(zhì)5min抽濾45濃縮50%甲醇/水50ml正己烷除脂離心10min去正己烷層除脂兩次45濃縮超純水定容至10ml分裝至2ml離心管-40儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?方法,2、植物化學(xué)物質(zhì)結(jié)合物的提取 取10g殘?jiān)涞?，密?40ml4mol/l naoh消化1h濃鹽酸中和至中性取10ml溶液過(guò)硅膠柱（1:2 v/w） 200ml 20%甲醇/乙酸乙酯洗脫洗脫液在45濃縮至干超純水定容至10ml分裝至2ml離心管-40儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?方法,3、總酚含量測(cè)定：folin-ciocalteu比色法 所有提取物與蒸餾水以比例1:10稀釋?zhuān)ㄖ贫](méi)食子酸0.0-800.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)） folin-ciocalteu試劑氧化碳酸鈉中和 常溫下反應(yīng)90min后 760nm測(cè)吸光度，與已知的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較。,方法,4、總黃酮含量的測(cè)定 取0.25ml的提取物稀釋10倍0.075ml 5%亞硝酸鈉反應(yīng)5min0.15ml10%氯化鋁反應(yīng)6min 0.5ml1mol/l氫氧化鈉加蒸餾水至3ml在510nm用mrx ii dynex分光光度計(jì)測(cè)定該混合物的吸光度 黃酮的含量通過(guò)兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較得到，平行測(cè)定三次，結(jié)果用（每一百克堅(jiān)果中兒茶素當(dāng)量） 標(biāo)準(zhǔn)差表示。,tosc法：總氧自由基清除能力檢測(cè)法,5、總抗氧化能力的測(cè)定 tosc原理： abap產(chǎn)生的自由基與kmba(-keto- methiolbutyric acid)作用可氧化產(chǎn)生乙烯,抗氧化劑的存在可與kmba競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合自由基,從而減少乙烯 的產(chǎn)量,最后通過(guò)乙烯的減少程度來(lái)衡量抗氧化能 力的強(qiáng)弱。,mts比色法,6、提取物抑制hepg2和caco-2細(xì)胞的測(cè)試 用hepg2 和 caco-2癌細(xì)胞模型來(lái)評(píng)價(jià)堅(jiān)果提取物的抗增殖活性。 抗癌癥細(xì)胞增殖活性是用mts比色實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定的。 hepg2細(xì)胞在williams medium e上培養(yǎng)，caco-2細(xì)胞在dmem上培養(yǎng),五、實(shí)驗(yàn)總結(jié),酚含量的比較,胡桃含有最高可溶性游離酚含量，依次是山核桃，花生，開(kāi)心果，腰果， 杏仁，巴西堅(jiān)果，松子和澳洲堅(jiān)果，榛子。 胡桃和榛子含量之間有59倍的差距。 澳洲堅(jiān)果是結(jié)合酚類(lèi)化合物含量最高的，其次是花生，榛子，胡桃，山核桃，開(kāi)心果，腰果，杏仁，巴西堅(jiān)果，松子。 澳洲堅(jiān)果和最的松子含量之間有4倍的差異,2019/7/15,黃酮含量的比較,2019/7/15,山核桃含有最高的可溶性游離黃酮量，其次是胡桃，花生，開(kāi)心果，腰果，杏仁，巴西堅(jiān)果，榛子，松子，和澳洲堅(jiān)果。 胡桃含有最高的結(jié)合黃酮量，其次是澳洲堅(jiān)果，榛子，巴西堅(jiān)果，山核桃，開(kāi)心果，杏仁，花生，松子，腰果。,抗氧化活性的比較,胡桃有最大的抗氧化活性，其次是山核桃，花生，開(kāi)心果，腰果，杏仁，巴西堅(jiān)果，松子，澳洲堅(jiān)果，和榛子。,2019/7/15,酚類(lèi)物質(zhì)的含量和總抗氧化活性之間存在正相關(guān)關(guān)系。 堅(jiān)果中酚類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物組成了具有總抗氧化能力的部份，這表明植物化學(xué)物質(zhì)和其協(xié)同作用可能是造成其強(qiáng)大的抗氧化活性的原因。,hepg2細(xì)胞和caco-2細(xì)胞抗增殖活性,2019/7/15,胡桃，山核桃和花生的水溶性游離提取物對(duì)細(xì)胞增殖抑制呈劑量依賴(lài)性的關(guān)系； 這10個(gè)樣品的抗增殖活性在hepg2細(xì)胞和caco-2細(xì)胞上有所不同。 總的來(lái)說(shuō)，這10個(gè)樣品抑制caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞增殖比抑制肝癌hepg2細(xì)胞增殖有更大的能力。,對(duì)hepg2 和caco-2抑制的比較,通過(guò)堅(jiān)果提取物抑制癌細(xì)胞的增殖能力能夠部分地解釋是由于提取物的總酚的作用，這表明一個(gè)特殊的酚類(lèi)化合物或堅(jiān)果類(lèi)的酚類(lèi)是負(fù)責(zé)其抗增殖活性的。 特別的酚類(lèi)化合物與其他化合物在發(fā)揮抗增殖活性的作用中可能是充當(dāng)相加地，協(xié)同作用地，和/或拮抗作用。,酚類(lèi)，抗氧化活性，抗增殖活性之間的關(guān)系,酚類(lèi)，抗氧化活性，抗增殖活性之間的關(guān)系,堅(jiān)果總酚含量的可溶性游離酚類(lèi)和總的抗氧化活性以及可溶性游離黃酮含量和總的抗氧化活性之間有直接的關(guān)系。 用可溶性游離酚/黃酮含量和中值有效劑量（ec50）與hepg2和caco-2細(xì)胞增殖的抑制作比較，肝癌細(xì)胞增殖的抑制和可溶性游離酚含量和可溶性游離黃酮含量之間存在弱相關(guān)性。 在所測(cè)試的堅(jiān)果總抗氧化活性和hepg2細(xì)胞的抗增殖活性之間沒(méi)有顯著線(xiàn)性關(guān)系