KOH涂片鏡檢法診斷真菌性角膜炎的意義.doc

KOH涂片鏡檢法診斷真菌性角膜炎的意義作者：楊莉萍，黃文明，樊翌明，李瑞莊【關(guān)鍵詞】KOH涂片【摘要】目的:探討KOH涂片鏡檢法對(duì)真菌性角膜炎的診斷意義，了解湛江地區(qū)真菌性角膜炎的病原學(xué)。方法:取102例真菌性角膜炎患者的角膜潰瘍標(biāo)本，作KOH涂片鏡檢、真菌培養(yǎng)及菌種鑒定。結(jié)果:KOH涂片鏡檢法和真菌培養(yǎng)法的陽(yáng)性率分別為97.1（99/102）、94.9（93/98），二者的真菌檢出率差異無顯著性（P>；0.05）。93份培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，共分離出18屬33種真菌，其中鐮刀菌屬、彎孢霉屬和曲霉屬真菌分別占36.6%、27.9%、7.5%。結(jié)論:KOH涂片鏡檢法是早期診斷本病的簡(jiǎn)單、有效方法。鐮刀菌和彎孢霉是湛江地區(qū)真菌性角膜炎的主要致病菌?！娟P(guān)鍵詞】角膜炎；真菌；培養(yǎng)【Abstract】Objective:ToinvestigatethediagnosticvalueofpotassiumhydroxidebasedsmearassayformycotickeratitisandthepathogenicspectruminZhanjiangarea.Methods:Thecornealscrapingsfrom102patientswithfungalkeratitisweresubjectedto10%KOHbasedsmearbeforemicroscopicobservation,fungalcultureandstrainidentification.Results:ThepositiveratesoffungalinfectionoffungalkeratitisdetectedbyKOHbasedsmearandfungalculturewere97.1%(99/102)and94.9%(93/98),respectively,andtherewasnosignificantdifferenceinthefungaldetectionefficiencybetweenthetwomethods(P>；0.05).Thepathogenicfungibelongedto18genusand33species；ofwhich,Fusarium,CurvulariaandAspergillusaccountedfor36.6%,27.9%and7.5%,respectively.Conclusion:TheKOHbasedsmearissimpleandeffectiveintheearlydiagnosisoffungalkeratitis.FusariumandCurvulariaarethepredominantpathogensofmycotickeratitisinZhanjiangdistrict.【Keywords】keratitis；fungus；culture真菌性角膜炎的患病率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)，其致病菌迄今已多達(dá)70種1。真菌性角膜炎的處置不當(dāng)將導(dǎo)致角膜穿孔、失明甚至眼球摘除，而治療的成功和視力的恢復(fù)取決于早期、快速、正確的診斷。雖然KOH涂片鏡檢法目前仍是發(fā)展中國(guó)家快速診斷真菌性角膜炎的主要檢測(cè)方法，但國(guó)內(nèi)有關(guān)其對(duì)本病的診斷意義的報(bào)道少見26。本文分析了我院2003年10月2005年12月間診治的102例真菌性角膜炎的真菌學(xué)檢查結(jié)果，旨在了解KOH涂片鏡檢法對(duì)真菌性角膜炎的診斷意義。1資料與方法1.1病例資料102例患者中，男71例，女31例，年齡685歲（平均48.7歲），病程360d（平均13.9d）；均為單眼患病，其中右眼55例，左眼47例；農(nóng)民89例，工人9例，學(xué)生4例。58例有明確的眼外傷史，引起外傷的異物為谷?；蚬葔m（20例）、可疑塵埃（20例）、泥土（5例）、木屑（4例）、甘蔗葉（3例）、焊屑（2例）、水泥粉（1例）、竹片（1例）、橘葉（1例）、草刺傷（1例）。1.2標(biāo)本采集1%的卡因行患眼表面麻醉，2min后在無菌操作下用手術(shù)刀刮取角膜潰瘍組織，置于含少量滅菌生理鹽水的無菌離心管中送檢。1.3KOH涂片鏡檢用無菌白金耳挑取適量送檢的角膜潰瘍組織置于載玻片上，涂片時(shí)盡量將角膜組織薄層鋪開，加1滴10%KOH液，蓋上蓋玻片，顯微鏡下查找真菌。1.4真菌培養(yǎng)將余下的角膜潰瘍組織接種于2支沙氏培養(yǎng)基（SDA）試管斜面上，27培養(yǎng)23周，觀察有無真菌生長(zhǎng)。1.5菌種鑒定2支SDA試管中均有真菌生長(zhǎng)，且菌落形態(tài)一致者，初步確定其為致病菌。取其菌落移種于葡萄糖馬鈴薯瓊脂（PDA）或察氏培養(yǎng)基平皿上，27培養(yǎng)2周，觀察其生長(zhǎng)形態(tài)及速度；同時(shí)將菌落移種于PDA或察氏培養(yǎng)基行微量培養(yǎng)，每天鏡下觀察真菌菌絲和分生孢子生長(zhǎng)情況。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、生長(zhǎng)速度及有無液體滲出，以及菌落涂片和微量培養(yǎng)鏡下菌絲顏色、形態(tài)和分生孢子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及產(chǎn)孢方式等特點(diǎn)，進(jìn)行菌種鑒定78。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)。2結(jié)果102份角膜潰瘍標(biāo)本中均檢出真菌，其中4份因缺乏標(biāo)本而未作真菌培養(yǎng)。KOH涂片鏡檢102份，其中陽(yáng)性99份（97.1），陰性3份（2.9）；真菌培養(yǎng)98份，其中陽(yáng)性93份（94.9），陰性5份（5.1）（表1）。在KOH涂片鏡檢陰性的3份標(biāo)本中，真菌培養(yǎng)分離出面包串珠霉菌、頂套菌和叢生菌各1例。真菌一般在34d內(nèi)開始生長(zhǎng)，但培養(yǎng)基需要保存46周。93份培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，共分離出18屬33種真菌，其中以鐮刀菌屬、彎孢霉屬和曲霉屬真菌多見（表2）。表198份角膜潰瘍標(biāo)本中KOH涂片鏡檢法與真菌培養(yǎng)法結(jié)果的比較表293例真菌性角膜炎的致病真菌分類3討論雖然臨床表現(xiàn)有助于真菌性角膜炎的診斷，但明確診斷依賴于實(shí)驗(yàn)室檢查，如角膜刮片或活檢標(biāo)本直接鏡檢、染色檢查、組織病理檢查、真菌培養(yǎng)、共焦顯微鏡和PCR技術(shù)23。盡管真菌直接鏡檢不能鑒別感染的菌種，但其是快速診斷真菌性角膜炎的重要方法。以真菌培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，KOH涂片鏡檢法對(duì)真菌性角膜炎的敏感度為72.291，Gram染色為31.698.0，Giemsa染色為27.085.0，calcofluorwhite（CFW）染色為80.090.0，PAS染色為91.0，六胺鹽染色為56.089.0，乳酚棉藍(lán)（lactophenolcottonblue）染色為70.080.0，吖啶橙染色為65.023。共焦顯微鏡檢查和PCR技術(shù)盡管在本病的診斷中已顯示出良好的應(yīng)用前景，但還有許多問題需進(jìn)一步研究。KOH涂片鏡檢法診斷真菌性角膜炎的敏感性為81.2，特異性為83.84；其與真菌培養(yǎng)法結(jié)果的陽(yáng)性一致率為82.090.05。本文結(jié)果顯示KOH涂片鏡檢法對(duì)真菌的檢出率高達(dá)97.1，其與真菌培養(yǎng)法的檢出率差異無顯著性。因此，KOH涂片鏡檢法具有簡(jiǎn)單、快捷、價(jià)廉、結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，可作為早期診斷真菌性角膜炎的主要方法。高倍鏡下見到無色透明的菌絲可初步考慮為絲狀真菌感染，而見到無色、折光性強(qiáng)、大小不一的孢子則考慮為酵母菌感染。由于真菌具有向角膜組織內(nèi)生長(zhǎng)的特性，故在取材時(shí)要先擦除表面的壞死組織，再用刀片反復(fù)刮取角膜潰瘍底部和邊緣組織。另外，在涂片時(shí)要盡量將角膜組織薄層鋪開，這樣可更清晰地顯示真菌菌絲和孢子。由于真菌培養(yǎng)可提高病原體的檢出率、鑒定菌種和進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，故其目前仍是診斷真菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”23，5。雖然改良SDA培養(yǎng)基足以分離出各種不同的眼部真菌，但最好聯(lián)合應(yīng)用固體和液體培養(yǎng)基分別在37、2530環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)2。Rosa等9用改良SDA培養(yǎng)基進(jìn)行真菌性角膜炎患者的角膜刮片培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)陽(yáng)性率為90，2d、3d和1周內(nèi)的陽(yáng)性率分別為54.0、83.0、97.0。病例的選擇是影響真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率的主要因素，如化膿性角膜炎的陽(yáng)性率為20.050.0，真菌性角膜炎為50.080.05，本文則高達(dá)94.9。在本組病例中，有3例患者作直接鏡檢陰性，但真菌培養(yǎng)陽(yáng)性。因此，對(duì)于可疑的真菌性角膜炎患者，均需同時(shí)作KOH涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)與鑒定，有條件者還應(yīng)作藥敏試驗(yàn)，從而避免漏診和指導(dǎo)治療。雖然真菌性角膜炎的致病菌存在明顯的地域性差異，但其種類在過去的20a中并未發(fā)生明顯的變化3。絲狀真菌和暗色真菌（彎孢霉屬、離蠕孢屬）是其主要致病菌，而酵母和酵母樣真菌較少見2。Gopinathan等6總結(jié)了印度南部1352例真菌性角膜炎患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬、曲霉屬和彎孢霉屬分別占37.2、30.7、2.8。國(guó)內(nèi)調(diào)查顯示：華北地區(qū)和鄭州地區(qū)真菌性角膜炎的致病菌屬相同，依次為鐮刀菌屬、曲霉屬和青霉屬；華南地區(qū)在19751986年期間的主要致病菌依次為曲霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬，而19891997年期間則變?yōu)殓牭毒鷮佟⑶箤俸蛷濇呙箤?0。本組病例的主要致病菌依次為鐮刀菌屬、彎孢霉屬和曲霉屬，鐮刀菌屬中以茄病鐮刀菌最多見。雖然湛江地區(qū)在地理位置上與廣州較接近，但本文所見的彎孢霉屬明顯多于宋書華等5的報(bào)道，而曲霉菌屬較少見。參考文獻(xiàn):1王麗婭，孫聲桃，張?jiān)虑?，?河南地區(qū)真菌性角膜病致病菌種調(diào)查J.中國(guó)實(shí)用眼科雜志，2003，21（3）：224225.2THOMASPA.CurrentperspectivesonophthalmicmycosesJ.ClinMicrobiolRev,2003,16(4):730797.3SRINIVASANM.FungalkeratitisJ.CurrOpinOphthalmol,2004,15(4):321327.4SHARMAS,SILVERBERGM,MEHTAP,etal.Earlydiagnosisofmycotickeratitis:predictivevalueofpotassiumhydroxidepreparationJ.IndianJOphthalmol,1998,46(1):3135.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