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KOH涂片鏡檢法診斷真菌性角膜炎的意義作者:楊莉萍,黃文明,樊翌明,李瑞莊【關(guān)鍵詞】KOH涂片【摘要】目的:探討KOH涂片鏡檢法對(duì)真菌性角膜炎的診斷意義,了解湛江地區(qū)真菌性角膜炎的病原學(xué)。方法:取102例真菌性角膜炎患者的角膜潰瘍標(biāo)本,作KOH涂片鏡檢、真菌培養(yǎng)及菌種鑒定。結(jié)果:KOH涂片鏡檢法和真菌培養(yǎng)法的陽(yáng)性率分別為97.1(99/102)、94.9(93/98),二者的真菌檢出率差異無顯著性(P>;0.05)。93份培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中,共分離出18屬33種真菌,其中鐮刀菌屬、彎孢霉屬和曲霉屬真菌分別占36.6%、27.9%、7.5%。結(jié)論:KOH涂片鏡檢法是早期診斷本病的簡(jiǎn)單、有效方法。鐮刀菌和彎孢霉是湛江地區(qū)真菌性角膜炎的主要致病菌?!娟P(guān)鍵詞】角膜炎;真菌;培養(yǎng)【Abstract】Objective:ToinvestigatethediagnosticvalueofpotassiumhydroxidebasedsmearassayformycotickeratitisandthepathogenicspectruminZhanjiangarea.Methods:Thecornealscrapingsfrom102patientswithfungalkeratitisweresubjectedto10%KOHbasedsmearbeforemicroscopicobservation,fungalcultureandstrainidentification.Results:ThepositiveratesoffungalinfectionoffungalkeratitisdetectedbyKOHbasedsmearandfungalculturewere97.1%(99/102)and94.9%(93/98),respectively,andtherewasnosignificantdifferenceinthefungaldetectionefficiencybetweenthetwomethods(P>;0.05).Thepathogenicfungibelongedto18genusand33species;ofwhich,Fusarium,CurvulariaandAspergillusaccountedfor36.6%,27.9%and7.5%,respectively.Conclusion:TheKOHbasedsmearissimpleandeffectiveintheearlydiagnosisoffungalkeratitis.FusariumandCurvulariaarethepredominantpathogensofmycotickeratitisinZhanjiangdistrict.【Keywords】keratitis;fungus;culture真菌性角膜炎的患病率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì),其致病菌迄今已多達(dá)70種1。真菌性角膜炎的處置不當(dāng)將導(dǎo)致角膜穿孔、失明甚至眼球摘除,而治療的成功和視力的恢復(fù)取決于早期、快速、正確的診斷。雖然KOH涂片鏡檢法目前仍是發(fā)展中國(guó)家快速診斷真菌性角膜炎的主要檢測(cè)方法,但國(guó)內(nèi)有關(guān)其對(duì)本病的診斷意義的報(bào)道少見26。本文分析了我院2003年10月2005年12月間診治的102例真菌性角膜炎的真菌學(xué)檢查結(jié)果,旨在了解KOH涂片鏡檢法對(duì)真菌性角膜炎的診斷意義。1資料與方法1.1病例資料102例患者中,男71例,女31例,年齡685歲(平均48.7歲),病程360d(平均13.9d);均為單眼患病,其中右眼55例,左眼47例;農(nóng)民89例,工人9例,學(xué)生4例。58例有明確的眼外傷史,引起外傷的異物為谷?;蚬葔m(20例)、可疑塵埃(20例)、泥土(5例)、木屑(4例)、甘蔗葉(3例)、焊屑(2例)、水泥粉(1例)、竹片(1例)、橘葉(1例)、草刺傷(1例)。1.2標(biāo)本采集1%的卡因行患眼表面麻醉,2min后在無菌操作下用手術(shù)刀刮取角膜潰瘍組織,置于含少量滅菌生理鹽水的無菌離心管中送檢。1.3KOH涂片鏡檢用無菌白金耳挑取適量送檢的角膜潰瘍組織置于載玻片上,涂片時(shí)盡量將角膜組織薄層鋪開,加1滴10%KOH液,蓋上蓋玻片,顯微鏡下查找真菌。1.4真菌培養(yǎng)將余下的角膜潰瘍組織接種于2支沙氏培養(yǎng)基(SDA)試管斜面上,27培養(yǎng)23周,觀察有無真菌生長(zhǎng)。1.5菌種鑒定2支SDA試管中均有真菌生長(zhǎng),且菌落形態(tài)一致者,初步確定其為致病菌。取其菌落移種于葡萄糖馬鈴薯瓊脂(PDA)或察氏培養(yǎng)基平皿上,27培養(yǎng)2周,觀察其生長(zhǎng)形態(tài)及速度;同時(shí)將菌落移種于PDA或察氏培養(yǎng)基行微量培養(yǎng),每天鏡下觀察真菌菌絲和分生孢子生長(zhǎng)情況。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、生長(zhǎng)速度及有無液體滲出,以及菌落涂片和微量培養(yǎng)鏡下菌絲顏色、形態(tài)和分生孢子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及產(chǎn)孢方式等特點(diǎn),進(jìn)行菌種鑒定78。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)。2結(jié)果102份角膜潰瘍標(biāo)本中均檢出真菌,其中4份因缺乏標(biāo)本而未作真菌培養(yǎng)。KOH涂片鏡檢102份,其中陽(yáng)性99份(97.1),陰性3份(2.9);真菌培養(yǎng)98份,其中陽(yáng)性93份(94.9),陰性5份(5.1)(表1)。在KOH涂片鏡檢陰性的3份標(biāo)本中,真菌培養(yǎng)分離出面包串珠霉菌、頂套菌和叢生菌各1例。真菌一般在34d內(nèi)開始生長(zhǎng),但培養(yǎng)基需要保存46周。93份培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中,共分離出18屬33種真菌,其中以鐮刀菌屬、彎孢霉屬和曲霉屬真菌多見(表2)。表198份角膜潰瘍標(biāo)本中KOH涂片鏡檢法與真菌培養(yǎng)法結(jié)果的比較表293例真菌性角膜炎的致病真菌分類3討論雖然臨床表現(xiàn)有助于真菌性角膜炎的診斷,但明確診斷依賴于實(shí)驗(yàn)室檢查,如角膜刮片或活檢標(biāo)本直接鏡檢、染色檢查、組織病理檢查、真菌培養(yǎng)、共焦顯微鏡和PCR技術(shù)23。盡管真菌直接鏡檢不能鑒別感染的菌種,但其是快速診斷真菌性角膜炎的重要方法。以真菌培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn),KOH涂片鏡檢法對(duì)真菌性角膜炎的敏感度為72.291,Gram染色為31.698.0,Giemsa染色為27.085.0,calcofluorwhite(CFW)染色為80.090.0,PAS染色為91.0,六胺鹽染色為56.089.0,乳酚棉藍(lán)(lactophenolcottonblue)染色為70.080.0,吖啶橙染色為65.023。共焦顯微鏡檢查和PCR技術(shù)盡管在本病的診斷中已顯示出良好的應(yīng)用前景,但還有許多問題需進(jìn)一步研究。KOH涂片鏡檢法診斷真菌性角膜炎的敏感性為81.2,特異性為83.84;其與真菌培養(yǎng)法結(jié)果的陽(yáng)性一致率為82.090.05。本文結(jié)果顯示KOH涂片鏡檢法對(duì)真菌的檢出率高達(dá)97.1,其與真菌培養(yǎng)法的檢出率差異無顯著性。因此,KOH涂片鏡檢法具有簡(jiǎn)單、快捷、價(jià)廉、結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn),可作為早期診斷真菌性角膜炎的主要方法。高倍鏡下見到無色透明的菌絲可初步考慮為絲狀真菌感染,而見到無色、折光性強(qiáng)、大小不一的孢子則考慮為酵母菌感染。由于真菌具有向角膜組織內(nèi)生長(zhǎng)的特性,故在取材時(shí)要先擦除表面的壞死組織,再用刀片反復(fù)刮取角膜潰瘍底部和邊緣組織。另外,在涂片時(shí)要盡量將角膜組織薄層鋪開,這樣可更清晰地顯示真菌菌絲和孢子。由于真菌培養(yǎng)可提高病原體的檢出率、鑒定菌種和進(jìn)行藥敏試驗(yàn),故其目前仍是診斷真菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”23,5。雖然改良SDA培養(yǎng)基足以分離出各種不同的眼部真菌,但最好聯(lián)合應(yīng)用固體和液體培養(yǎng)基分別在37、2530環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)2。Rosa等9用改良SDA培養(yǎng)基進(jìn)行真菌性角膜炎患者的角膜刮片培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)陽(yáng)性率為90,2d、3d和1周內(nèi)的陽(yáng)性率分別為54.0、83.0、97.0。病例的選擇是影響真菌培養(yǎng)陽(yáng)性率的主要因素,如化膿性角膜炎的陽(yáng)性率為20.050.0,真菌性角膜炎為50.080.05,本文則高達(dá)94.9。在本組病例中,有3例患者作直接鏡檢陰性,但真菌培養(yǎng)陽(yáng)性。因此,對(duì)于可疑的真菌性角膜炎患者,均需同時(shí)作KOH涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)與鑒定,有條件者還應(yīng)作藥敏試驗(yàn),從而避免漏診和指導(dǎo)治療。雖然真菌性角膜炎的致病菌存在明顯的地域性差異,但其種類在過去的20a中并未發(fā)生明顯的變化3。絲狀真菌和暗色真菌(彎孢霉屬、離蠕孢屬)是其主要致病菌,而酵母和酵母樣真菌較少見2。Gopinathan等6總結(jié)了印度南部1352例真菌性角膜炎患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬、曲霉屬和彎孢霉屬分別占37.2、30.7、2.8。國(guó)內(nèi)調(diào)查顯示:華北地區(qū)和鄭州地區(qū)真菌性角膜炎的致病菌屬相同,依次為鐮刀菌屬、曲霉屬和青霉屬;華南地區(qū)在19751986年期間的主要致病菌依次為曲霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬,而19891997年期間則變?yōu)殓牭毒鷮佟⑶箤俸蛷濇呙箤?0。本組病例的主要致病菌依次為鐮刀菌屬、彎孢霉屬和曲霉屬,鐮刀菌屬中以茄病鐮刀菌最多見。雖然湛江地區(qū)在地理位置上與廣州較接近,但本文所見的彎孢霉屬明顯多于宋書華等5的報(bào)道,而曲霉菌屬較少見。參考文獻(xiàn):1王麗婭,孫聲桃,張?jiān)虑?,?河南地區(qū)真菌性角膜病致病菌種調(diào)查J.中國(guó)實(shí)用眼科雜志,2003,21(3):224225.2THOMASPA.CurrentperspectivesonophthalmicmycosesJ.ClinMicrobiolRev,2003,16(4):730797.3SRINIVASANM.FungalkeratitisJ.CurrOpinOphthalmol,2004,15(4):321327.4SHARMAS,SILVERBERGM,MEHTAP,etal.Earlydiagnosisofmycotickeratitis:predictivevalueofpotassiumhydroxidepreparationJ.IndianJOphthalmol,1998,46(1):3135.5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