瘢痕疙瘩真皮-表皮連接區(qū)結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)學(xué)變化.doc_第1頁
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瘢痕疙瘩真皮-表皮連接區(qū)結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)學(xué)變化作者:姜篤銀陳璧賈赤宇董茂龍徐明達(dá)【關(guān)鍵詞】瘢痕疙瘩關(guān)鍵詞:瘢痕疙瘩;基底膜;免疫組織化學(xué);組織形態(tài)學(xué)摘要:目的觀察瘢痕疙瘩(Ks)真皮表皮連接(DEJ)區(qū)結(jié)構(gòu)變化.方法對瘢痕疙瘩浸潤部、增生部和老化部及其正常皮膚(NS)標(biāo)本,采用組織學(xué)、免疫組化laminin,vWF標(biāo)記和DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察.結(jié)果DEJ區(qū)laminin和基底膜厚度、真皮乳頭密度和乳頭間孔穴密度,表皮內(nèi)面基底細(xì)胞質(zhì)膜皺襞密度、孔穴密度及其粘附細(xì)胞密度(EACD),真皮乳頭層微血管密度(MVD)等指標(biāo),各組均有顯著的病理改變.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:浸潤部>;增生部>;老化部或(和)正常皮膚(t,P<;0.050.01).除真皮乳頭和基底細(xì)胞質(zhì)膜皺襞密度外,MVD或EACD與其他指標(biāo)的均數(shù)間呈明顯正相關(guān)(t,P<;0.050.001,r=0.3720.681).結(jié)論Ks不同部位DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)有顯著不同的病理改變,可能與真皮乳頭的微血管增生和阻塞及免疫細(xì)胞向表皮內(nèi)大量浸潤有關(guān).Keywords:keloid;basementmembrane;immunohis-tochemistry;histomorphologyAbstract:AIMToobservetheconstructionchangeofder-mal-epidermisjunction(DEJ)inkeloids(Ks).METHODSHistology,immunohistochemicallabeling(lamininandvWF)andscanningelectronicmicroscopewereappliedtoinvestigatetheinvasivingzone,proliferativezone,agedzoneofkeloidsandnormalskinspecimen.RESULTSThereweremarkedpathologicalchangesinlamininofDEJ,thicknessofbasalmembrane,dermalpapilladensity,holedensityinpapillas,folddensityofbasalcytoplasmicmembrane,holedensityandadherencecelldensity,microvesseldensityinpapillalayerofdermal,invasivingzone>;proliferativezone>;agedzoneandNS(t,P<;0.050.01),exceptdermalpapillaandfolddensityofbasalcytoplasmicmembrane,suchindexesasMVDandEACDarepositivelyrelatedtoeachother(tr,P<;0.050.001,r=0.3720.681).CONCLUSIONMarked-lydifferentpathologicalchangeofDEJappearedindifferentzoneofkeloids,andthatmayberelatedtoproliferationandocclusionofmicrovesselindermalpapillalayerandinfiltra-tionofimmunecellsinepidermis.0引言瘢痕疙瘩(keloids,Ks)是易感個(gè)體皮膚外傷愈合等后在水平和垂直兩個(gè)方向上結(jié)締組織過度增生而形成的真皮良性腫瘤.組織學(xué)上瘢痕疙瘩與增生性瘢痕相似,均呈現(xiàn)纖維細(xì)胞增生和膠原大量沉積.由于具有侵襲性生長的特性,因而又賦予它與一般增生性瘢痕不同的臨床表現(xiàn)和病理過程,即典型的瘢痕疙瘩由外向內(nèi)可分為浸潤部、增生部和老化部1.瘢痕疙瘩上述3個(gè)不同部位是由正常皮膚逐漸發(fā)展而成的.有關(guān)瘢痕疙瘩的真皮-表皮連接(dermal-epi-dermisjunction,DEJ)區(qū)結(jié)構(gòu)的病理改變未見文獻(xiàn)報(bào)道.為此,我們收集瘢痕疙瘩不同部位標(biāo)本,通過組織學(xué)、Laminin(LN)和vonWillerbrandfactor(vWF)免疫組化標(biāo)記和掃描電鏡(SEM)觀察,探討瘢痕疙瘩DEJ區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化及其發(fā)生機(jī)制.1對象和方法1.1對象瘢痕疙瘩標(biāo)本均取自我院門診和住院手術(shù)患者23(男9,女14)例,年齡245歲.其中胸骨柄區(qū)9份,面頸部2份,肩三角肌和上背部7份,耳垂部5份.瘢痕疙瘩標(biāo)本取材分成中央凹陷的老化部15份;表面潮紅隆起的增生部23份及其與正常皮膚交界的浸潤部13份;留邊緣正常皮膚(NS)10份為對照.除電鏡標(biāo)本外,新鮮標(biāo)本用40g・;L-1多聚甲醛緩沖液固定,石蠟包埋.1.2方法1.2.1組織學(xué)觀察連續(xù)5m組織切片,分別作HE,PAS染色,觀察DEJ區(qū)乳頭、皮釘和基底膜(BM)結(jié)構(gòu).用目鏡尺測微器測定各標(biāo)本5個(gè)不同部位的BM厚度(m)和乳頭密度(個(gè)/mm2),取均值.1.2.2免疫組化染色和觀察5m石蠟切片撈于APES膠包被的載玻片上.常規(guī)設(shè)PBS和山羊血清代替第一抗體的陰性對照.所有標(biāo)本采用SP(kit,福建Maxim公司)方法作鼠抗人LNIgG(福建Maxim公司)和兔抗人vWFIgG(DAKO)免疫組化標(biāo)記,DAB顯示棕黃色陽性信號,分別定位于BM和微血管內(nèi)皮細(xì)胞(mVEC)胞質(zhì),背景淡黃或無色.觀察:乳頭淺層mVEC增殖水平及血管結(jié)構(gòu)(BM和管腔);DEJ區(qū)BM結(jié)構(gòu);高倍鏡(400)下采用目鏡網(wǎng)格測微器(5/25)觀察10份標(biāo)本的各5個(gè)單位面積內(nèi)微血管與網(wǎng)格交叉點(diǎn)數(shù)的平均數(shù),以此代表微血管密度(MVD,交叉點(diǎn)數(shù)/mm2);測定DEJ區(qū)LN和BM各5點(diǎn)的厚度(m),取均值.1.2.3SEM樣本制作2和觀察每組各5塊新鮮組織,修成1.0cm1.0cm0.3cm大小,PBS(pH7.4)沖洗后入1.25g・;L-1dispase(日本)消化液內(nèi)424h,小心分離表皮和真皮,直接置入40mL・;L-1戊二醛-多聚甲醛液內(nèi)固定,按常規(guī)方法3制成SEM樣本,JSMT-200掃描電鏡觀察.采用SEM上的標(biāo)示尺計(jì)算單位面積(mm2)內(nèi)真皮表面乳頭密度(DPD)、真皮孔穴密度(DHD),表皮內(nèi)面的波紋狀皺襞密度、表皮孔穴密度(EHD)及其表皮粘附細(xì)胞密度(EACD)的平均數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:各組計(jì)量資料t檢驗(yàn),微血管密度和粘附細(xì)胞密度與KsDEJ區(qū)結(jié)構(gòu)相關(guān)的指標(biāo)之間作單因素相關(guān)分析和r值和t檢驗(yàn).2結(jié)果2.1光鏡觀察正常皮膚組表皮各層細(xì)胞分化良好,層次清楚,基底細(xì)胞均勻排列于鋸齒狀BM上,乳頭和皮釘或腺嵴的縱軸與表皮垂直,大小對稱,分布規(guī)律,BM粗細(xì)均勻、連續(xù).浸潤部:表皮明顯增厚(有1320層表皮細(xì)胞),細(xì)密的基底細(xì)胞紊亂地排列于增厚、斷裂、松散或分層的BM上,部分BM已與基底細(xì)胞分離,散落于乳頭基質(zhì)中,傾斜的乳頭和皮釘增寬變淺,乳頭數(shù)量減少,乳頭內(nèi)血管BM增厚、阻塞.增生部組:表皮變薄,細(xì)胞分化差,DEJ區(qū)BM粗細(xì)不均,于乳頭和皮釘交界處明顯增厚、分層,有斷裂現(xiàn)象(Fig1),乳頭或皮釘明顯減少.老化部組:表皮變薄,乳頭和皮釘近乎消失,BM變薄、呈斷續(xù)狀.各組光鏡下真皮乳頭密度(個(gè)/mm2)為:NS(6.60.5)>;浸潤部(4.00.5)>;增生部(1.80.4)>;老化部(0.40.1)(t,P<;0.001),各組BM厚度(m)依次為:浸潤部(2.90.5)>;增生部(2.30.3)>;老化部(1.50.2)和NS(1.60.2)(t,P<;0.01).2.2免疫組化觀察2.2.1正常皮膚LN分布于含BM的部位,以DEJ區(qū)BM顯色最強(qiáng),于表皮基底細(xì)胞底部呈線狀均勻著色,位于皮膚附件周圍和mVEC底部及LN較纖細(xì).上述各部位的LN,在疤痕疙瘩均有不同程度的病理改變,非BM部位的膠原組織內(nèi)也有團(tuán)索狀輕度著色.浸潤部:DEJ區(qū)LN粗細(xì)不均,于真皮側(cè)著色,有裂隙或間斷、疏松或分層和剝脫等表現(xiàn).LN增粗部位多見于乳頭和皮釘交界部位,乳頭內(nèi)毛細(xì)血管BM增厚、閉塞或改建.萎縮或退變的皮膚附件周圍LN染色弱或消失;增生部:DEJ區(qū)LN平直,粗細(xì)不均,厚度較浸潤部下降,但真皮組織內(nèi)非特定部位LN著色明顯增強(qiáng);老化部:LN呈點(diǎn)線狀著色不均,殘留在極少數(shù)正常皮膚附件的外周,LN著色與正常皮膚相近.各組LN厚度(m)依次為:浸潤部(1.80.4)>;增生部(1.20.2)>;NS(0.90.1)和老化部(0.70.2)(t,P<;0.01).2.2.2正常皮膚vWF乳頭層微血管粗細(xì)相近、分布規(guī)律,由乳頭層呈垂直走向終止于乳頭內(nèi);浸潤部:淺層微血管擴(kuò)張、分布不規(guī)律,乳頭內(nèi)mVEC向管腔內(nèi)外增生,毛細(xì)血管大多閉塞或改建,微血管數(shù)量和密度均明顯增加;增生部:淺層微血管高度擴(kuò)張,多數(shù)因mVEC增生紊亂或管壁扭曲致管腔梗塞,其血管內(nèi)外均可見mVEC,乳頭部位的毛細(xì)血管密度降低或消失;老化部:微血管數(shù)量、密度和病理改變均明顯減少.NS,浸潤部,增生部和老化部乳頭層MVD值(xs)依次為:30248,41693,37261和28141.統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)結(jié)果為浸潤部>;增生部(P<;0.05)>;NS和老化部(P<;0.001).2.3SEM觀察2.3.1正常皮膚真皮表面結(jié)構(gòu)乳頭大小均勻、排列整齊,呈圓柱狀,高聳垂直,頂端鈍圓,表面有波紋狀BM覆蓋;乳頭之間的峽谷區(qū)也覆蓋著網(wǎng)狀的BM(Fig2),其間有直徑530m的孔穴,散在分布,未見BM覆蓋;浸潤部:乳頭排列尚均勻,但乳頭逐漸萎縮變小、傾斜或倒伏,皺縮的乳頭呈葉片樣卷曲(Fig3),增寬的乳頭間區(qū)域BM粗細(xì)不均、分布少量的無BM覆蓋的孔穴,直徑約5.0120m,偶見汗腺管突出于此;增生部:乳頭枯萎、稀少,完全倒伏于真皮表面,乳頭間孔穴數(shù)量較浸潤部少;老化部:典型的乳頭幾乎消失,真皮表面平坦,孔穴大小和數(shù)量明顯降低.各組真皮表面乳頭密度和真皮乳頭間孔穴密度比較,結(jié)果(Tab1)分別為:正常皮膚>;浸潤部>;增生部>;老化部(t,P<;0.001);浸潤部>;增生部(t,P<;0.05)>;老化部>;NS(t,P<;0.001).圖1圖6略2.3.2正常皮膚表皮內(nèi)面結(jié)構(gòu)有與乳頭大小和外形相近、分布均勻的乳頭孔,基底細(xì)胞呈螺旋狀排列,其表面有與細(xì)胞排列方向平行一致的波紋狀皺襞(注:為基底細(xì)胞真皮側(cè)的質(zhì)膜皺褶),可見散在孔穴和與表皮相連的皮膚附件結(jié)構(gòu);浸潤部:與正常皮膚的移行部,乳頭孔外形和大小接近NS,孔內(nèi)有膜片狀結(jié)構(gòu)附著,向增生部移行部位的乳頭孔較正常小而淺,孔內(nèi)多有分層的膜片狀結(jié)構(gòu)(Fig4),與光鏡下(PAS特殊染色)所見增厚分層的LN結(jié)構(gòu)十分相似;膜表面有細(xì)顆粒狀結(jié)構(gòu)凸出,膜下呈松散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),與豐富的基底細(xì)胞膜皺襞相連接,皺襞常成雙并列伸向真皮側(cè),異常增厚和致密(Fig5),整個(gè)表皮內(nèi)面有密集的直徑約530m的細(xì)小孔穴,可見較多直徑約1012m球形和樹突狀細(xì)胞粘附(Fig4);增生部:乳頭孔逐漸減少、消失,細(xì)長的波紋狀皺襞平行排列,相間細(xì)小孔穴,其數(shù)量和粘附細(xì)胞均較浸潤部少.在浸潤部(多見)和增生部孔穴部位基底細(xì)胞表面可見大小均勻、直徑約0.5m的囊胞狀結(jié)構(gòu)(vesicularstructure)凸向孔穴,中央可見細(xì)小凹陷(Fig6);老化部:典型乳頭孔已完全消失,表面平坦,波紋狀皺襞稀少、分布不規(guī)律,孔穴變小、密度下降.統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)(Tab1),表皮內(nèi)面皺襞密度(EFD)依次為:浸潤部>;增生部(P<;0.001)>;老化部>;NS(P<;0.05),表皮內(nèi)面孔穴密度(EHD)依次為:浸潤部>;增生部>;老化部>;NS(P<;0.001).表皮內(nèi)面粘附細(xì)胞密度依次為:浸潤部>;增生部>;老化部>;NS(t,P<;0.001).表1瘢痕疙瘩各部位DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)密度比較略瘢痕疙瘩各部乳頭層(瘢痕淺層)MVD或EACD與DEJ區(qū)BM和LN厚度、DPD,DHD,EFD,EHD均數(shù)作單因素相關(guān)分析,r值和t檢驗(yàn)結(jié)果如Tab2,除DPD和EFD外,MVD或EACD與DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)病理改變呈明顯正相關(guān).表2瘢痕疙瘩EACD或MVD與DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)密度的相關(guān)性分析略3討論我們采用dispase分離表皮和真皮(或瘢痕)后,按常規(guī)制作顯示DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)的SEM樣本2,能非常清晰地顯示真皮表面和表皮內(nèi)面的細(xì)微結(jié)構(gòu),包括:真皮乳頭、乳頭間孔穴及其表面覆蓋的BM,表皮內(nèi)面的乳頭孔、孔間隆起區(qū)域(相當(dāng)于光鏡下皮釘部位)、表面孔穴及其表面粘附細(xì)胞和基底細(xì)胞質(zhì)膜形成的波紋狀皺襞.說明此方法是可靠的,能同時(shí)獲取DEJ區(qū)真皮和表皮連接的兩個(gè)層面上的信息資料.臨床和組織學(xué)將瘢痕疙瘩分為浸潤部、增生部和老化部3個(gè)不同部位1.光鏡和SEM水平觀察上述三者DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別:瘢痕疙瘩浸潤部組織形態(tài)學(xué)變化最為明顯,BM和LN表現(xiàn)增厚、分層、斷裂或與基底細(xì)胞剝離,真皮乳頭萎縮、倒伏和密度銳減,表皮內(nèi)面孔穴及其粘附細(xì)胞密度增加,基底細(xì)胞表面皺襞發(fā)達(dá)

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