瘢痕疙瘩真皮-表皮連接區(qū)結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)學(xué)變化.doc

瘢痕疙瘩真皮-表皮連接區(qū)結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)學(xué)變化作者：姜篤銀陳璧賈赤宇董茂龍徐明達(dá)【關(guān)鍵詞】瘢痕疙瘩關(guān)鍵詞:瘢痕疙瘩；基底膜；免疫組織化學(xué)；組織形態(tài)學(xué)摘要:目的觀察瘢痕疙瘩（Ks）真皮表皮連接（DEJ）區(qū)結(jié)構(gòu)變化.方法對瘢痕疙瘩浸潤部、增生部和老化部及其正常皮膚（NS）標(biāo)本，采用組織學(xué)、免疫組化laminin，vWF標(biāo)記和DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀察.結(jié)果DEJ區(qū)laminin和基底膜厚度、真皮乳頭密度和乳頭間孔穴密度，表皮內(nèi)面基底細(xì)胞質(zhì)膜皺襞密度、孔穴密度及其粘附細(xì)胞密度（EACD），真皮乳頭層微血管密度（MVD）等指標(biāo)，各組均有顯著的病理改變.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:浸潤部>；增生部>；老化部或（和）正常皮膚（t，P<；0.050.01）.除真皮乳頭和基底細(xì)胞質(zhì)膜皺襞密度外，MVD或EACD與其他指標(biāo)的均數(shù)間呈明顯正相關(guān)（t，P<；0.050.001，r=0.3720.681）.結(jié)論Ks不同部位DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)有顯著不同的病理改變，可能與真皮乳頭的微血管增生和阻塞及免疫細(xì)胞向表皮內(nèi)大量浸潤有關(guān).Keywords:keloid；basementmembrane；immunohis-tochemistry；histomorphologyAbstract:AIMToobservetheconstructionchangeofder-mal-epidermisjunction（DEJ）inkeloids（Ks）.METHODSHistology，immunohistochemicallabeling（lamininandvWF）andscanningelectronicmicroscopewereappliedtoinvestigatetheinvasivingzone，proliferativezone，agedzoneofkeloidsandnormalskinspecimen.RESULTSThereweremarkedpathologicalchangesinlamininofDEJ，thicknessofbasalmembrane，dermalpapilladensity，holedensityinpapillas，folddensityofbasalcytoplasmicmembrane，holedensityandadherencecelldensity，microvesseldensityinpapillalayerofdermal，invasivingzone>；proliferativezone>；agedzoneandNS（t，P<；0.050.01），exceptdermalpapillaandfolddensityofbasalcytoplasmicmembrane，suchindexesasMVDandEACDarepositivelyrelatedtoeachother（tr，P<；0.050.001，r=0.3720.681）.CONCLUSIONMarked-lydifferentpathologicalchangeofDEJappearedindifferentzoneofkeloids，andthatmayberelatedtoproliferationandocclusionofmicrovesselindermalpapillalayerandinfiltra-tionofimmunecellsinepidermis.0引言瘢痕疙瘩（keloids，Ks）是易感個(gè)體皮膚外傷愈合等后在水平和垂直兩個(gè)方向上結(jié)締組織過度增生而形成的真皮良性腫瘤.組織學(xué)上瘢痕疙瘩與增生性瘢痕相似，均呈現(xiàn)纖維細(xì)胞增生和膠原大量沉積.由于具有侵襲性生長的特性，因而又賦予它與一般增生性瘢痕不同的臨床表現(xiàn)和病理過程，即典型的瘢痕疙瘩由外向內(nèi)可分為浸潤部、增生部和老化部1.瘢痕疙瘩上述3個(gè)不同部位是由正常皮膚逐漸發(fā)展而成的.有關(guān)瘢痕疙瘩的真皮-表皮連接（dermal-epi-dermisjunction，DEJ）區(qū)結(jié)構(gòu)的病理改變未見文獻(xiàn)報(bào)道.為此，我們收集瘢痕疙瘩不同部位標(biāo)本，通過組織學(xué)、Laminin（LN）和vonWillerbrandfactor（vWF）免疫組化標(biāo)記和掃描電鏡（SEM）觀察，探討瘢痕疙瘩DEJ區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化及其發(fā)生機(jī)制.1對象和方法1.1對象瘢痕疙瘩標(biāo)本均取自我院門診和住院手術(shù)患者23（男9，女14）例，年齡245歲.其中胸骨柄區(qū)9份，面頸部2份，肩三角肌和上背部7份，耳垂部5份.瘢痕疙瘩標(biāo)本取材分成中央凹陷的老化部15份；表面潮紅隆起的增生部23份及其與正常皮膚交界的浸潤部13份；留邊緣正常皮膚（NS）10份為對照.除電鏡標(biāo)本外，新鮮標(biāo)本用40g・；L-1多聚甲醛緩沖液固定，石蠟包埋.1.2方法1.2.1組織學(xué)觀察連續(xù)5m組織切片，分別作HE，PAS染色，觀察DEJ區(qū)乳頭、皮釘和基底膜（BM）結(jié)構(gòu).用目鏡尺測微器測定各標(biāo)本5個(gè)不同部位的BM厚度（m）和乳頭密度（個(gè)/mm2），取均值.1.2.2免疫組化染色和觀察5m石蠟切片撈于APES膠包被的載玻片上.常規(guī)設(shè)PBS和山羊血清代替第一抗體的陰性對照.所有標(biāo)本采用SP（kit，福建Maxim公司）方法作鼠抗人LNIgG（福建Maxim公司）和兔抗人vWFIgG（DAKO）免疫組化標(biāo)記，DAB顯示棕黃色陽性信號，分別定位于BM和微血管內(nèi)皮細(xì)胞（mVEC）胞質(zhì)，背景淡黃或無色.觀察:乳頭淺層mVEC增殖水平及血管結(jié)構(gòu)（BM和管腔）；DEJ區(qū)BM結(jié)構(gòu)；高倍鏡（400）下采用目鏡網(wǎng)格測微器（5/25）觀察10份標(biāo)本的各5個(gè)單位面積內(nèi)微血管與網(wǎng)格交叉點(diǎn)數(shù)的平均數(shù)，以此代表微血管密度（MVD，交叉點(diǎn)數(shù)/mm2）；測定DEJ區(qū)LN和BM各5點(diǎn)的厚度（m），取均值.1.2.3SEM樣本制作2和觀察每組各5塊新鮮組織，修成1.0cm1.0cm0.3cm大小，PBS（pH7.4）沖洗后入1.25g・；L-1dispase（日本）消化液內(nèi)424h，小心分離表皮和真皮，直接置入40mL・；L-1戊二醛-多聚甲醛液內(nèi)固定，按常規(guī)方法3制成SEM樣本，JSMT-200掃描電鏡觀察.采用SEM上的標(biāo)示尺計(jì)算單位面積（mm2）內(nèi)真皮表面乳頭密度（DPD）、真皮孔穴密度（DHD），表皮內(nèi)面的波紋狀皺襞密度、表皮孔穴密度（EHD）及其表皮粘附細(xì)胞密度（EACD）的平均數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:各組計(jì)量資料t檢驗(yàn)，微血管密度和粘附細(xì)胞密度與KsDEJ區(qū)結(jié)構(gòu)相關(guān)的指標(biāo)之間作單因素相關(guān)分析和r值和t檢驗(yàn).2結(jié)果2.1光鏡觀察正常皮膚組表皮各層細(xì)胞分化良好，層次清楚，基底細(xì)胞均勻排列于鋸齒狀BM上，乳頭和皮釘或腺嵴的縱軸與表皮垂直，大小對稱，分布規(guī)律，BM粗細(xì)均勻、連續(xù).浸潤部:表皮明顯增厚（有1320層表皮細(xì)胞），細(xì)密的基底細(xì)胞紊亂地排列于增厚、斷裂、松散或分層的BM上，部分BM已與基底細(xì)胞分離，散落于乳頭基質(zhì)中，傾斜的乳頭和皮釘增寬變淺，乳頭數(shù)量減少，乳頭內(nèi)血管BM增厚、阻塞.增生部組:表皮變薄，細(xì)胞分化差，DEJ區(qū)BM粗細(xì)不均，于乳頭和皮釘交界處明顯增厚、分層，有斷裂現(xiàn)象（Fig1），乳頭或皮釘明顯減少.老化部組:表皮變薄，乳頭和皮釘近乎消失，BM變薄、呈斷續(xù)狀.各組光鏡下真皮乳頭密度（個(gè)/mm2）為:NS（6.60.5）>；浸潤部（4.00.5）>；增生部（1.80.4）>；老化部（0.40.1）（t，P<；0.001），各組BM厚度（m）依次為:浸潤部（2.90.5）>；增生部（2.30.3）>；老化部（1.50.2）和NS（1.60.2）（t，P<；0.01）.2.2免疫組化觀察2.2.1正常皮膚LN分布于含BM的部位，以DEJ區(qū)BM顯色最強(qiáng)，于表皮基底細(xì)胞底部呈線狀均勻著色，位于皮膚附件周圍和mVEC底部及LN較纖細(xì).上述各部位的LN，在疤痕疙瘩均有不同程度的病理改變，非BM部位的膠原組織內(nèi)也有團(tuán)索狀輕度著色.浸潤部:DEJ區(qū)LN粗細(xì)不均，于真皮側(cè)著色，有裂隙或間斷、疏松或分層和剝脫等表現(xiàn).LN增粗部位多見于乳頭和皮釘交界部位，乳頭內(nèi)毛細(xì)血管BM增厚、閉塞或改建.萎縮或退變的皮膚附件周圍LN染色弱或消失；增生部:DEJ區(qū)LN平直，粗細(xì)不均，厚度較浸潤部下降，但真皮組織內(nèi)非特定部位LN著色明顯增強(qiáng)；老化部:LN呈點(diǎn)線狀著色不均，殘留在極少數(shù)正常皮膚附件的外周，LN著色與正常皮膚相近.各組LN厚度（m）依次為:浸潤部（1.80.4）>；增生部（1.20.2）>；NS（0.90.1）和老化部（0.70.2）（t，P<；0.01）.2.2.2正常皮膚vWF乳頭層微血管粗細(xì)相近、分布規(guī)律，由乳頭層呈垂直走向終止于乳頭內(nèi)；浸潤部:淺層微血管擴(kuò)張、分布不規(guī)律，乳頭內(nèi)mVEC向管腔內(nèi)外增生，毛細(xì)血管大多閉塞或改建，微血管數(shù)量和密度均明顯增加；增生部:淺層微血管高度擴(kuò)張，多數(shù)因mVEC增生紊亂或管壁扭曲致管腔梗塞，其血管內(nèi)外均可見mVEC，乳頭部位的毛細(xì)血管密度降低或消失；老化部:微血管數(shù)量、密度和病理改變均明顯減少.NS，浸潤部，增生部和老化部乳頭層MVD值（xs）依次為:30248，41693，37261和28141.統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)結(jié)果為浸潤部>；增生部（P<；0.05）>；NS和老化部（P<；0.001）.2.3SEM觀察2.3.1正常皮膚真皮表面結(jié)構(gòu)乳頭大小均勻、排列整齊，呈圓柱狀，高聳垂直，頂端鈍圓，表面有波紋狀BM覆蓋；乳頭之間的峽谷區(qū)也覆蓋著網(wǎng)狀的BM（Fig2），其間有直徑530m的孔穴，散在分布，未見BM覆蓋；浸潤部:乳頭排列尚均勻，但乳頭逐漸萎縮變小、傾斜或倒伏，皺縮的乳頭呈葉片樣卷曲（Fig3），增寬的乳頭間區(qū)域BM粗細(xì)不均、分布少量的無BM覆蓋的孔穴，直徑約5.0120m，偶見汗腺管突出于此；增生部:乳頭枯萎、稀少，完全倒伏于真皮表面，乳頭間孔穴數(shù)量較浸潤部少；老化部:典型的乳頭幾乎消失，真皮表面平坦，孔穴大小和數(shù)量明顯降低.各組真皮表面乳頭密度和真皮乳頭間孔穴密度比較，結(jié)果（Tab1）分別為:正常皮膚>；浸潤部>；增生部>；老化部（t，P<；0.001）；浸潤部>；增生部（t，P<；0.05）>；老化部>；NS（t，P<；0.001）.圖1圖6略2.3.2正常皮膚表皮內(nèi)面結(jié)構(gòu)有與乳頭大小和外形相近、分布均勻的乳頭孔，基底細(xì)胞呈螺旋狀排列，其表面有與細(xì)胞排列方向平行一致的波紋狀皺襞（注:為基底細(xì)胞真皮側(cè)的質(zhì)膜皺褶），可見散在孔穴和與表皮相連的皮膚附件結(jié)構(gòu)；浸潤部:與正常皮膚的移行部，乳頭孔外形和大小接近NS，孔內(nèi)有膜片狀結(jié)構(gòu)附著，向增生部移行部位的乳頭孔較正常小而淺，孔內(nèi)多有分層的膜片狀結(jié)構(gòu)（Fig4），與光鏡下（PAS特殊染色）所見增厚分層的LN結(jié)構(gòu)十分相似；膜表面有細(xì)顆粒狀結(jié)構(gòu)凸出，膜下呈松散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與豐富的基底細(xì)胞膜皺襞相連接，皺襞常成雙并列伸向真皮側(cè)，異常增厚和致密（Fig5），整個(gè)表皮內(nèi)面有密集的直徑約530m的細(xì)小孔穴，可見較多直徑約1012m球形和樹突狀細(xì)胞粘附（Fig4）；增生部:乳頭孔逐漸減少、消失，細(xì)長的波紋狀皺襞平行排列，相間細(xì)小孔穴，其數(shù)量和粘附細(xì)胞均較浸潤部少.在浸潤部（多見）和增生部孔穴部位基底細(xì)胞表面可見大小均勻、直徑約0.5m的囊胞狀結(jié)構(gòu)（vesicularstructure）凸向孔穴，中央可見細(xì)小凹陷（Fig6）；老化部:典型乳頭孔已完全消失，表面平坦，波紋狀皺襞稀少、分布不規(guī)律，孔穴變小、密度下降.統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)（Tab1），表皮內(nèi)面皺襞密度（EFD）依次為:浸潤部>；增生部（P<；0.001）>；老化部>；NS（P<；0.05），表皮內(nèi)面孔穴密度（EHD）依次為:浸潤部>；增生部>；老化部>；NS（P<；0.001）.表皮內(nèi)面粘附細(xì)胞密度依次為:浸潤部>；增生部>；老化部>；NS（t，P<；0.001）.表1瘢痕疙瘩各部位DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)密度比較略瘢痕疙瘩各部乳頭層（瘢痕淺層）MVD或EACD與DEJ區(qū)BM和LN厚度、DPD，DHD，EFD，EHD均數(shù)作單因素相關(guān)分析，r值和t檢驗(yàn)結(jié)果如Tab2，除DPD和EFD外，MVD或EACD與DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)病理改變呈明顯正相關(guān).表2瘢痕疙瘩EACD或MVD與DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)密度的相關(guān)性分析略3討論我們采用dispase分離表皮和真皮（或瘢痕）后，按常規(guī)制作顯示DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)的SEM樣本2，能非常清晰地顯示真皮表面和表皮內(nèi)面的細(xì)微結(jié)構(gòu)，包括:真皮乳頭、乳頭間孔穴及其表面覆蓋的BM，表皮內(nèi)面的乳頭孔、孔間隆起區(qū)域（相當(dāng)于光鏡下皮釘部位）、表面孔穴及其表面粘附細(xì)胞和基底細(xì)胞質(zhì)膜形成的波紋狀皺襞.說明此方法是可靠的，能同時(shí)獲取DEJ區(qū)真皮和表皮連接的兩個(gè)層面上的信息資料.臨床和組織學(xué)將瘢痕疙瘩分為浸潤部、增生部和老化部3個(gè)不同部位1.光鏡和SEM水平觀察上述三者DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別:瘢痕疙瘩浸潤部組織形態(tài)學(xué)變化最為明顯，BM和LN表現(xiàn)增厚、分層、斷裂或與基底細(xì)胞剝離，真皮乳頭萎縮、倒伏和密度銳減，表皮內(nèi)面孔穴及其粘附細(xì)胞密度增加，基底細(xì)胞表面皺襞發(fā)達(dá)