新城疫病毒抑制肝星狀細胞活化的初步研究.doc

新城疫病毒抑制肝星狀細胞活化的初步研究李亞琳渭南師范學院化學與生命科學學院陜西渭南714099摘要：目的探討新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）在活化肝星狀細胞（Hepaticstellatecell,HSC）中的復制對HSC的活化增殖以及細胞生物學功能的影響。方法用不同滴度的NDV溶瘤株Italien（NDV-Italien）感染經transforminggrowthfactor-1(TGF-1)刺激活化的人肝星狀細胞系LX-2，MTT法檢測NDV對細胞增殖率的影響。免疫熒光顯微鏡技術檢測活化標志物-SMA的表達變化。結果NDV的感染抑制了LX-2細胞的增殖，細胞增殖率和病毒滴度呈負相關。與未刺激組相比，NDV在TGF-1刺激的LX-2細胞中的增殖抑制率提高，LX-2細胞的活化標志物-SMA的表達顯著性下調。結論NDV在活化LX-2細胞中的復制具有抑制細胞增殖和HSC活化的作用。關鍵詞：新城疫病毒；肝星狀細胞；TGF-1ApreliminarystudyofNewcastlediseasevirusrepressingtheavtivationofhepaticstellatecellYalinLiCollegeofChemistryandLifeScience,WeinanTeacherUniversity,Weinan,Shaanxi,China,714099Abstract:AimToexploretheinfluenceofNDVreplicationonLX-2cellsonthecellviabilityandbehaviorofcellularbiology.MethodsTransforminggrowthfactor-1(TGF-1)-stimulatedLX-2cellswereinfectedbydifferenttitresofoncolyticNDV-Italien,theproliferationrateofLX-2cellswasdetectedbyMTTassay.Immunofluorescenttechniquewasusedtodetecttheexpressionofactivationmarkers-SMAinLX-2cells.ResultsNDVinfectioninLX-2cellsrepressedthecellproliferationinadose-dependentmanner.Comparedwithcontrol,thegrowthinhibitionrateofactivatedLX-2cellswasincreased,theexpressionofactivationmarkers-SMAofLX-2cellsweredown-regulateddramaticlly.ConclusionThereplicationofNDVinactivatedLX-2cellsrepressesthecellproliferationandattenuatedtheactivationofLX-2cells.Keywords:Newcastlediseasevirus；hepaticstellatecell；TGF-1基金項目：陜西省教育廳資助項目（新城疫病毒抑制肝星狀細胞活化的體內外研究），（項目編號：009JK427）；渭南師范學院基金資助項目（新城疫病毒抑制小鼠肝纖維化的機制研究），（項目編號：10YKZ054）作者單位：714000陜西省渭南市，渭南師范學院作者簡介:李亞琳，女，博士，副教授，主要從事腫瘤生物治療研究Email：；通訊地址：陜西省渭南市朝陽路西段渭南師范學院化學與生命科學學院，聯(lián)系電話：2133096，手機星狀細胞（HSC）活化是肝纖維化發(fā)生的主要原因，而肝纖維化是肝癌前病變的重要病理階段。免疫組化研究顯示，肝癌合并肝硬化中活化的HSC數量顯著增高，而肝癌細胞分泌的細胞因子也具有促進HSC活化并增殖的作用1；活化HSC和癌變細胞的相互作用會進一步加重肝癌合并肝硬化程度。因此著眼于活化HSC的靶向治療是抑制肝纖維化，改善肝癌狀況的一個新的研究熱點。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是單股負鏈RNA病毒，屬副粘病毒科。由于多數RNA病毒具有天然地在腫瘤細胞選擇性復制的特點，近年來用這類病毒作為新型運載工具在腫瘤基因治療方面引起了人們的關注2，3。而我們前期的實驗已經證明了NDV也能夠在活化的HSC中復制?；谶@個研究基礎，本研究通過測定細胞增殖以及-SMA的表達，證明了NDV在活化的HSC中的復制對HSC的增殖以及活化標志蛋白-SMA的表達的抑制作用，從而為以肝星狀細胞為靶點的肝癌合并肝纖維化治療提供實驗依據。1材料1.1細胞與病毒人肝星狀細胞系LX-2，美國MountSinai醫(yī)學院ScottL.Friedman教授饋贈；溶瘤株NDV-Italien由德國癌癥研究中心VolkerSchirrmacher教授饋贈。1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基購于美國Hycolon；新生牛血清購于中國杭州四季青公司；重組人TGF-1購于以色列PeproTechAsia；鼠抗人-SMA一抗購于英國Abcam；羊抗鼠偶聯(lián)AlexaFluor594IgG二抗購于美國Invitrogen。2方法2.1MTT檢測NDV感染對LX-2細胞增殖的影響LX-2細胞以5103cells/孔接種在96孔板中培養(yǎng)24h,然后換以0.5%小牛血清的DMEM饑餓24h。然后用2ng/ml的TGF-1（W/V,用含2%NBCS的DMEM配制）刺激LX-2細胞24h，以不同滴度的NDV感染細胞，細胞培養(yǎng)24h后，MTT法檢測NDV對細胞增殖的影響。2.2免疫熒光檢測NDV感染后-SMA在LX-2細胞中的表達LX-2細胞以1105cells/孔接種在6孔板中（預鋪蓋玻片）。培養(yǎng)24h后，用NDV-Italien（1:400稀釋）感染細胞。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，進行-SMA的免疫熒光檢測，步驟如下：PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10min；0.1%的TritonX-100(用PBS配)滲透5min；PBST（含0.2%Tween-20的PBS）洗2次后，用5%的羊血清室溫封閉20min；直接加入鼠抗人-SMA一抗（1:50稀釋），37孵育1h；PBST洗3次后，加入偶聯(lián)AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗（1:800稀釋），37避光孵育30min；PBST洗2次后，用DAPI(1:5,000稀釋)染核2min；PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察-SMA在細胞中的表達。2.5統(tǒng)計分析數據用三個獨立樣本的均數標準差來表示(xs)，用獨立t檢驗（independentStudentsst-test）來分析不同組之間的差異顯著性，顯著性界限定為P0.05（雙尾）。所有結果通過SPSS統(tǒng)計學軟件來完成。3結果3.1NDV抑制LX-2細胞的增殖LX-2細胞會隨著傳代培養(yǎng)而自發(fā)活化4。為了考查NDV對LX-2細胞的增殖影響，試驗用不同稀釋濃度的NDV-Italien感染傳代到第5代的LX-2細胞以及用2ng/mlTGF-1刺激活化的LX-2細胞，并用MTT方法檢測NDV對兩組細胞增殖影響。如圖1所示，LX-2細胞無論是在未刺激狀態(tài)還是刺激后的活化狀態(tài)，NDV均可以抑制細胞的增殖（A），且具有劑量依賴性。但是NDV對2ng/mlTGF-1刺激活化細胞的增殖抑制率更高（B），與未刺激組相比具有顯著性差異（P0.05）。ThedilutionofNDVThedilutionofNDV圖1NDV對LX-2細胞生長的抑制作用。LX-2細胞經2ng/mlTGF-1預刺激后，再用NDV-Italien感染24h。MTT檢測細胞在490nm時的吸光度值（A），并計算細胞的生長抑制率（B）。數據為三次獨立檢測的平均值(xs)。Figure1TheproliferationofLX-2CellswasinhibitedbyNDV.LX-2cellswerepretreatedwith2ng/mlTGF-1,theninfectedwithNDV-Italienfor24h.CellproliferationwasdetectedusingMTTassayatwavelengthof490nm(A)andcellgrowthinhibitionratewascalculated(B).Datarepresentthemeansoftriplicate.3.2NDV抑制LX-2細胞的-SMA表達試驗用NDV-Italien感染傳代到第5代的LX-2細胞，免疫熒光法檢測細胞中-SMA的表達。結果顯示，在NDV感染前，LX-2細胞中有較強的-SMA表達（圖2A）；而NDV感染后，細胞中-SMA的表達明顯消失（圖2B）。圖2LX-2細胞中-SMA的表達。LX-2細胞接種在6孔板中培養(yǎng)24h，用NDV-Italien感染細胞。24h后，細胞被固定、滲透，羊血清封閉后加入鼠抗人-SMA一抗，37孵育1h。加入偶聯(lián)AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗，37孵育30min。用DAPI染核后，熒光顯微鏡觀察-SMA的表達。NDV感染前（A）；NDV感染后（B）。（放大倍數400）Figure2Theexpressionof-SMAinLX-2cells.LX-2cellswereinoculatedin96-wellplatesandculturedfor24hfollowedbyinfectionwithNDV-Italien.After24h,thecellswerefixed,permeabilized,blockedbygoatserumandincubatedwithmouseanti-human-SMAantibodyat37for1h.ThensectionswereincubatedwithAlexaFlour594goatanti-mouseIgGsecondaryantibodyfor30minat37C.AfterstainedthenucleuswithDAPI,-SMAexpressionwerevisualizedunderafluorescencemicroscope.BeforeNDVinfection(A)；AfterNDVinfection(B).(Magnification400)4討論活化HSC高表達-SMA，所以-SMA已經被用作判斷HSC活化以及纖維化發(fā)展的標志5。而在HSC活化以及肝纖維化過程中，TGF-1無疑是一個重要的調節(jié)因子，是HSC活化的一個關鍵因素6。TGF-1能夠促進HSC由星狀的靜止狀態(tài)轉型為成肌纖維細胞樣的活化狀態(tài)，誘導HSC活化并產生過量的ECM進而形成肝纖維化7,8。HSC活化以及肝纖維化的發(fā)生與肝癌發(fā)生也有密切的關系。國內幾個報道均用免疫組化證明了肝癌組織中活化的HSC明顯高于正常組織9,10；體外實驗證明HSC在肝癌的血管生成中起主要作用11。有文獻報道大鼠的肝癌細胞能促進HSC的募集和活化12；而肝臟損傷后病變的肝細胞也能誘導HSC的活化13。因此，肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，活化的肝星狀細胞和病變的肝細胞相互作用，共同促進腫瘤發(fā)生進程，而靶向HSC的抗纖維化治療也成為阻止肝癌發(fā)生的有效途徑之一14,15。我們以前的實驗也證明了TGF-1具有促進HSC活化作用，并且用不同方法證實了NDV能夠在活化LX-2細胞中高效復制。本試驗通過進一步的研究工作探討NDV在活化LX-2細胞中的復制對細胞的增殖以及活化功能的影響，證明了NDV在活化HSC中的復制能夠抑制該細胞的增殖及活化，并降低細胞內一些活化相關基因的表達。MTT方法證明，LX-2細胞無論是否被TGF-1預刺激，NDV均劑量依賴性地抑制細胞的增殖。TGF-1刺激后，細胞在490nm的吸光度值和計算所得的生長抑制率總體高于未刺激組，說明TGF-1的刺激誘導了LX-2細胞的增殖，促進細胞的活化。而當NDV感染后，其在TGF-1刺激活化的LX-2細胞的復制率更高，從而對細胞生長抑制率也比為刺激組高。這個結果表明NDV更容易在刺激活化的細胞中復制而引起更高的細胞死亡率，即NDV的復制效率越高，對細胞的生長抑制率也越高，對細胞活化的抑制也更加有效。為了證明NDV的復制能夠抑制HSC的活化，本試驗檢測了NDV感染對LX-2細胞中的-SMA表達的影響。同預期結果一樣，NDV感染后-SMA表達明顯消失。說明NDV的復制確實很大程度地降低了LX-2的活化程度。NDV能在活化HSC中相對高效地復制，進而抑制細胞的活化功能。以上實驗數據表明：NDV在活化HSC中的復制，能夠抑制HSC的增殖以及活化相關蛋白的表達，很大程度地抑制了HSC的活化功能。該結果為將NDV進一步用于抑制肝纖維化以及肝癌治療提供一定的試驗基礎。參考文獻：1NhieuJT,BrochriouI,PrauxAM,etal.Myofibroblastsandhepatocellularcarcinoma:aninvivoandinvitrostudyJ.JHepatol,1998,29:120-128.2BianH,FournierP,PeetersB,etal.Tumor-targetedgenetransferinvivoviarecombinantNewcastlediseasevirusmodifiedbyabispecificfusionproteinJ.IntJOncology,2005,27(9):377-384.3BianH,FournierP,MoormannR,etal.SelectivegenetransfertotumorcellsbyrecombinantNewcastleDiseaseVirusviaabispecificfusionproteinJ.IntJOncol,2005,26(3):431-439.4XuL,HuiAY,AlbanisE,etal.Humanhepaticstellatecellline,LX-1andLX-2:newtoolsforanalysishepaticfibrosisJ.Gut,2005,54:142-151.5AkpolatN,YahsiS,GodekmerdanA,etal.Thevalueof-SMAintheevaluationofhepaticfibrosisseverityinhepatitisBinfectionandcirrhosisdevelopment:ahistopathologicalandimmunohistochemicalstudyJ.Histopathology,2005,47:276-280.6ChangXM,ChangY,JiaA.Effectsofinterferon-alphaonexpressionofhepaticstellatecellandtransforminggrowthfactor-beta1andalpha-smoothmuscleactininratswithhepaticfibrosisJ.WorldJGastroenterol,2005,11:2634-2636.7BreitkopfK,GodoyP,CiuclanL,etal.TGF-/smadsignalingintheinjuredliverJ.ZGastroenterol,2006,44:57-66.8BreitkopfK,HaasS,WiercinskaE,etal.Anti-TGF-betastrategiesforthetreatmentofchronicliverdiseaseJ.AlcoholClinExpRes,2005,29:121S-31S.9呂麗,王莉芬,王麗麗,等.肝星狀細胞、肝細胞生長因子與肝癌相關性研究J.肝臟,2005,10:213-214.10王偉,官陽,楊木蘭,等.活化肝星狀細胞與肝細胞肝癌發(fā)生及轉移的相關性J.臨床與實驗病理學雜志,2007,23:492-494.11JungJO,GwakGY,LimYS,etal.Roleofhepatic