【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）乳中乳果糖測定方法的優(yōu)化及其在乳品質(zhì)量評定中的應(yīng)用動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)碩士論文終稿

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 乳中乳果糖測定方法的優(yōu)化及其在乳品質(zhì)量評定中的應(yīng)用 I 摘 要 本研究 在優(yōu)化 法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討 了 乳果糖在液態(tài)乳不同加工條件 下的變化規(guī)律 。 試驗(yàn)一 本試驗(yàn)以快速穩(wěn)定的檢測乳中 乳果糖 含量 為目的， 采用析因?qū)嶒?yàn) 在 11285法的基礎(chǔ)上 ， 將其中的乳果糖水解步驟條件 修改為培養(yǎng)時(shí)間 1h、培養(yǎng)溫度 50 、 半乳糖苷酶添加量 300U。新方法 平均回收率為 與 法（ 11285定結(jié)果差異不顯著 (P= 比 的測定周期縮短 9小時(shí)，并顯著降低微生物污染的幾率。 試驗(yàn)二 研究不同殺菌溫度、殺菌時(shí)間及復(fù)原乳添加量對 巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳中 乳果糖含量的影響。 結(jié)果表明： 在 巴氏殺菌條件下，牛乳中的乳果糖含量隨著殺菌溫度 （ 85、 90、 95、 100 ） 和殺菌時(shí)間 （ 15s、 30s、 45s、 75s、 90s） 的升高 呈線性上升趨勢（ 且 殺菌溫度對乳果糖值的影響大于殺菌時(shí)間對它的影響。復(fù)原乳 （ 85 ， 15s） 添加比例 （ 2%、 5%、 10%、 20%） 與乳果糖含量呈正相關(guān)（ 2 ； 在 菌條件下， 牛乳中的乳果糖含量隨著殺菌溫度（ 137142 ）和殺菌時(shí)間（ 2s、 5s、 15s）的升高 呈 曲線 上升趨勢 （ 。可根據(jù) 菌乳 中的 復(fù)原乳 （ 139 ，4s） 添加比例 （ 10%、 20%、 30%） 與乳果糖含量呈負(fù)相關(guān) （ 。 試驗(yàn) 三 研究 4種商業(yè) 19 2 條件下儲(chǔ)存 2個(gè)月間的乳果糖含量變化情況。結(jié)果表明： 菌乳中乳果糖含量在貨架前期 （ 42d 以前） 相對穩(wěn)定，后期隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長而增高 (P 具體增高幅度與生產(chǎn)工藝有關(guān)。 關(guān)鍵詞 乳果糖 ， 牛乳 ， 巴氏殺菌， 菌 ， 酶法 on SO in to of in A of in by SO to 0 h 00 in of 90；（ W：待測 菌乳樣品中每 100g 蛋白質(zhì)中所含糠氨酸的毫克數(shù)； t：待測 菌乳貯存天數(shù)） b） 當(dāng) 菌結(jié)束時(shí)乳每 100g 蛋白質(zhì)中糠氨酸含量為 140190，乳果糖含量（ ）與糠氨酸含量（每 100值小于 2。 農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 糠氨酸在儲(chǔ)存期間變化較劇烈。 ， 1990；， 1992； ， 2000； ， 1994 乳果糖 可用于區(qū)別乳品的熱處理程度，還可作為鑒定 菌乳是否含有復(fù)原乳 歐盟規(guī)定巴氏殺菌 乳中乳果糖的含量應(yīng)該低于 50， 1993）和 1992）對區(qū)分 菌乳和二次滅菌乳做了規(guī)定： 00 農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 酶法測定方法較煩瑣。 ， 1996； ， 2000； ， 2003 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 果糖的生成與結(jié)構(gòu) 乳果糖（ 4名半乳糖苷果糖、 1 4 半乳糖苷果糖、乳酮糖（ 含有一分子半乳糖和一分子果糖。它是在牛乳熱處理過程中，乳糖在酪蛋白的游離氨基集團(tuán)的催化條件下堿基異構(gòu)化而形成的一種合成雙糖(1984； ， 1986)。乳果糖與乳糖是同分異構(gòu)體，兩者的 結(jié)構(gòu)式 見圖 1 圖 1果糖與乳糖的結(jié)構(gòu)式 he of 1958 年首先發(fā)現(xiàn)牛乳中存在乳果糖，并指出乳果糖是由 運(yùn)而形成的，并可以由乳果糖苷賴氨酸的 排反應(yīng)生成。 1960）在 55 下貯存脫脂乳粉 21 天后檢測乳果糖、甘油醛、塔格糖和酸性產(chǎn)物。他們發(fā)現(xiàn)游離乳果糖在堿性條件下 降解產(chǎn)生，這種降解反應(yīng)是在乳蛋白中游離氨基催化下進(jìn)行。 隨后的研究表明乳果糖的形成主要有兩個(gè)條件： 運(yùn)和 排反應(yīng)。 乳中乳果糖含量的測定方法 由于乳果糖可以 作為衡量牛乳熱處理效應(yīng)的指標(biāo)，國 內(nèi)外關(guān)于測定牛乳中乳果糖含量的方法也逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前檢測乳果糖含量 存在 的主要問題是：牛乳中乳糖含量很高（約 4%）而乳果糖含量很低 （ ，在測定乳果糖時(shí)高含量的乳糖會(huì)對其產(chǎn)生干擾。因此不同 的 測定方法針對這一問題提出了不同的解決方案（表 1從表中可以看出各種方法均有各自的缺點(diǎn)，其中 法是目前較成熟且應(yīng)用廣泛的一種方法，它被國際標(biāo)準(zhǔn)化組織 （ 2004 年列為標(biāo)準(zhǔn)方法，我國的農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)巴氏殺菌乳和 菌乳中復(fù)原乳的鑒定中也規(guī)定使用該方法測定液態(tài)乳中乳果糖的含量。但 酶 法也有一定的缺點(diǎn) ， 需要 進(jìn)一步 的改進(jìn)。 乳果糖 乳糖 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 表 1果糖的各種測定方法 o f an is in 方法 原理 檢出限 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 資料來源 法 用 半乳糖苷酶 將牛乳樣品中的乳糖和乳果糖分別水解為葡萄糖和果糖，通過添加葡萄糖氧化酶除去葡萄糖，從而降低測定干擾，然后將所產(chǎn)生的果糖在磷酸葡糖異構(gòu)酶作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖 6磷酸，利用己糖激酶和葡萄糖 6磷酸脫氫酶水解葡萄糖 6磷酸，產(chǎn)生定量的 過測定 340吸光值可以準(zhǔn)確測定牛乳樣品中乳果糖的含量 1 測定準(zhǔn)確，檢出限低（ 1）、穩(wěn)定性和可靠性強(qiáng) 成本 高；測定時(shí)間長，；檢測樣品具有局限性；操作過程中易受微生物污染而造成乳果糖測定值偏低。 1285效液相色譜法 利用沉淀劑沉淀牛乳中的蛋白質(zhì)和脂肪，然后利用高效液相色譜測定濾液中乳果糖的含量。示差檢測器（噪音水平 510色譜柱：87（ 30保護(hù)柱：陽離子柱和陰離子柱；洗脫液： 水（ 并用 氣；流動(dòng)相流速 標(biāo)法定量。 2001500 操作簡 便、測定周期短 由于乳糖和乳果糖為同分異構(gòu)體，二者出峰時(shí)間十分相近，各種乳制品中乳糖的量遠(yuǎn)大于乳果糖的量，使乳果糖峰容易包含在乳糖峰之內(nèi)，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。 11868:1997 氣相色譜法 沉淀牛乳中的蛋白質(zhì)和脂肪，然后過濾，使用 基 譜條件為： 色譜柱：30m壁涂層為 子固定相為 50聯(lián)二苯和 50二甲基硅氧烷；進(jìn)樣器溫度 300 ；氫火焰離子檢測器溫度 300 ；色譜柱溫度：程序升溫 175 (2 3 (3進(jìn)樣體積： 1 2L。 50100 操作簡便、測定周期短；適用于檢測蔗糖含量比較高的乳制品中的乳果糖含量 由于乳糖和乳果糖為同分異構(gòu)體，二者的出峰時(shí)間十分相近，加之各種乳制品中乳糖的量遠(yuǎn)大于乳果糖的量，使乳果糖峰容易包含在乳糖峰之內(nèi)，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。 005 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 8 方法 原理 檢出限 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 資料來源 離子色譜法 00 離子色譜儀配以 度泵， 化學(xué)檢測器帶金工作薄層電化學(xué)檢測池；參比 電極為 譜條件為： 250離柱， 20護(hù)柱，脈沖安培檢測； 操作簡便、測定周期短；靈敏度高 離子色譜儀的普及程度限制了該種方法的推廣 曾文芳等， 2006 微分 法 利用 半乳糖苷酶分解乳中乳糖與乳果糖為葡萄糖和果糖，己糖激酶分解葡萄糖和果糖產(chǎn)生 H ，通過 化反應(yīng)測出被分解乳果糖的量。然后通過對 號(hào)和乳果糖溶液信號(hào)之間線性相關(guān)分析，求得回歸方程，從而計(jì)算出 乳果糖的含量。 L 測定周期短；靈敏度高 尚處在各自試驗(yàn)室研究階段，并且操作較為繁瑣并沒有得到大范圍的推廣 ， 2003 色法 用 半乳糖苷酶分解乳中乳果糖為果糖和半乳糖，在有四甲基偶氮唑鹽（ 在時(shí)，果糖進(jìn)一步被果糖脫氫酶水解后與吩嗪甲硫酸酯（ 生反應(yīng)，溶液中產(chǎn)生帶有顏色的 物質(zhì)利用分光光度計(jì)在 570件下可定量檢測。 10 測定周期短；靈敏度高 操作較為繁瑣；不能測定本身含有果糖的牛乳樣品。 ， 2000 安培電流計(jì)法 利用 半乳糖苷酶將乳果糖水解為果糖后，果糖在鐵氰化鉀e(介導(dǎo)下被固化的果糖脫氫酶水解反應(yīng)生成 5此過程中將 N)63 轉(zhuǎn)變?yōu)?N)64 ,后者再得到電子轉(zhuǎn)化為N)63 ，在該過程中采用 參比電極可定量測定氧化產(chǎn)生的電流，從而推出樣品中乳果糖的含量 測定周期短；靈敏度高 尚處在各自試驗(yàn)室研究階段，并且操作較為繁瑣并沒有得到大范圍的推廣 1996 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 9 乳熱處理過程中乳果糖的生成規(guī)律研究 鮮牛乳中的乳果糖含量 研究表明，生鮮牛乳中乳果糖的含量很低，在 之間 （ ,1994； 1996） 。 氏殺菌乳中乳果糖的變化規(guī)律 目前國外對巴氏殺菌乳中乳果糖含量隨具體熱處理程度變化情況的研究較少，只將其作為區(qū)分巴氏殺菌乳和 菌乳的辨別指標(biāo)。從表 1可看出，在研究早期，由于檢測方法靈敏度的局限性并未檢出巴氏殺菌乳中含有乳果糖。隨著新的、更加靈敏的檢測方法的陸續(xù)涌現(xiàn)，這一問題得到了解決。巴氏殺菌乳中乳果糖含量范圍分布在 間，而高溫巴氏殺菌乳中的乳果糖含量范圍為 58， 巴氏殺菌乳中的乳果糖含量低于高溫巴氏殺菌乳的乳果糖含量。 隨著生產(chǎn)工藝的不同，巴氏殺菌乳中的乳果糖含量也有所差別。而從 （ 1995）和 （ 2006）的試驗(yàn)可以看出巴氏殺菌乳中的乳果糖 會(huì)隨加工溫度和時(shí)間的增高而增高，但乳果糖在巴氏殺菌乳中隨溫度和時(shí)間的具體變化規(guī)律目前尚不清楚。 表 1氏殺菌乳中乳果糖的含量范圍 h e o f in p 巴氏殺菌乳類型 熱處理工藝 （溫度 /時(shí)間） 乳果糖含量 （ ） 資料來源 巴氏殺菌乳 檢出 1984 巴氏殺菌 50/15檢出 ， 1995 巴氏殺菌 60/15檢出 巴氏殺菌 70/15檢出 巴氏殺菌 70/603 巴氏殺菌 80/15檢出 巴氏殺菌 80/602 巴氏殺菌 90/157 巴氏殺菌 97/1540 巴氏殺菌乳 ， 1999 高溫巴氏殺菌乳 氏殺菌乳 .5 ， 2004 高溫巴氏殺菌乳 8 高溫巴氏殺菌乳 85/30s 50 ， 2000 巴氏殺菌乳 ， 2005 巴氏殺菌乳 74 /30s 15 ， 2006 高溫巴氏殺菌乳 85 /30s 31 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 10 菌乳 中乳果糖的變化規(guī)律 目前針對 在 菌乳中乳果糖含量檢測 的 報(bào)道較多， 但 乳果糖隨熱處理溫度和時(shí)間的變化規(guī)律的研究較少（表 1 菌乳中乳果糖含量為 50 ， 其中 直接 20 , 間接 菌乳中乳果糖含量為 。 盡管直接 菌溫度為 150 ，而間接 有 140 ，但由于間接 過預(yù)熱、冷卻的強(qiáng)度大，是非瞬時(shí)滅菌過程，受熱損害更大，因此 直接加熱法 菌乳的乳果糖含量 比間接加熱法 菌乳低 。 表 1菌乳中乳果糖的含量范圍 h e o f HT 菌乳類型 熱處理工藝 （溫度 /時(shí)間） 乳果糖含量 （ ） 資料來源 菌乳 00 510 ， 1983 菌乳 0 720 1984 直接 菌乳 ， 1994 間接 菌乳 接 菌乳 39998 間接 菌乳 48277 直接 菌乳 65 ， 2004 間接 菌乳 41 直接 菌乳 150 /4s 12010 ， 2000 間接 菌乳 140 /3s 25015 間接 菌乳 140 /10s 45624 菌乳 ， 2005 直接 菌乳 140 /2s 144， 2006 間接 菌乳 137 /4s 400 乳果糖與復(fù)原乳的關(guān)系 “復(fù)原乳 ”又稱 “還原乳 ”（ 指煉乳或 /和全脂乳粉與水勾兌成的原料乳。市場上常見的復(fù)原乳通常是由工業(yè)乳粉制成的。乳粉和煉乳的生產(chǎn)過程中的濃縮和干燥階段熱處理強(qiáng)度均低于 保持法滅菌工藝的熱處理強(qiáng)度，處理溫度相對比較溫和，因此乳果糖的形成比較少。 近幾年國內(nèi)外對復(fù)原乳中的乳果糖含量進(jìn)行了研究。 （ 1994）研究結(jié) 果表明，復(fù)原乳中乳果糖的含量在 之間，而 （ 2005）利用氣相色譜法測定復(fù)原乳中的乳果糖含量為 。 （ 1995）研究表明由于牛乳干燥過程中的熱處理溫度相對超高溫滅菌工藝溫和，乳果糖的形成比較少。因此含有復(fù)原乳的 菌乳中乳果糖含量小于直接由生鮮牛乳生產(chǎn)的 菌乳中的乳果糖含量。目前我國已經(jīng)將乳果糖作為測中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 11 定 菌乳中是否含有復(fù)原乳的指標(biāo)之一，但是，巴氏殺菌乳中乳果糖含量與復(fù)原乳間的關(guān)系以及 復(fù)原乳在巴氏殺菌乳和 菌乳中添加比例與乳果糖含量的關(guān)系尚不清楚。 菌乳在儲(chǔ)存期間的乳果糖變化規(guī)律 由于 有些 菌乳的貨架期長達(dá) 180d 以上，因此 菌乳中的乳果糖在整個(gè)儲(chǔ)存期間的變化情況值得研究。國外研究表明，貯存條件（儲(chǔ)存溫度和時(shí)間）對 菌乳中乳果糖的含量有影響，但由于各自國家 菌乳的生產(chǎn)工藝千差萬別，其研究結(jié)果不盡相同。 1984） 的研究指出，牛乳中乳果糖含量隨儲(chǔ)存期變化的趨勢受牛乳中乳果糖含量的多少而決定，他的研究表明 菌乳儲(chǔ)存 6 個(gè)月后，乳果糖含量保持不變，而保持法滅 菌乳在儲(chǔ)存 40 天后乳果糖含量逐漸增高。他在 1987 年的研究進(jìn)一步表明不同加工工藝的 菌乳在室溫、黑暗條件下儲(chǔ)存 70 天后的乳果糖變化趨勢不同，既有逐漸增加的也有保持不變。 ， 1994 證明 菌乳在 22 和 30 下分別貯藏 90 天后， 乳果糖 增加量分別為204 和 9510。 （ 1995）利用乳果糖作為反應(yīng)乳糖異構(gòu)化和初級(jí)美拉德反應(yīng)的指標(biāo)，來評價(jià)牛乳中殺菌過程的過度熱處理。他對保持法滅菌乳樣品在 4 、 23 、 35 溫度條件下每儲(chǔ)存 60天的乳果糖含量進(jìn)行 了測定，結(jié)果表明乳果糖異構(gòu)化反應(yīng)僅在 35 有發(fā)生：每儲(chǔ)存 60 天，滅菌乳中乳果糖增加 129。 （ 2005）將 菌乳在室溫條件下（ 20）儲(chǔ)存了 24 星期 ,結(jié)果表明 間接 微小的浮動(dòng)。 (2006)采用 1997 酶法研究了儲(chǔ)存時(shí)間對牛乳中乳果糖含量的影響，結(jié)果表明乳果糖異構(gòu)化反應(yīng)在 25 和 35 均能發(fā)生。 目前我國對此研究尚屬空白。 果糖在乳品質(zhì)量評價(jià)中的應(yīng)用 國際奶業(yè)聯(lián)合會(huì)（ 歐盟（ 規(guī)定乳果糖為區(qū)別 菌乳和保持法滅菌乳的參數(shù)，并相繼出臺(tái)了對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。此外歐盟（ 規(guī)定巴氏殺菌乳中乳果糖含量應(yīng)低于 50 ， 菌乳中乳果糖含量低于 600 。德國更將歐盟限制的 菌乳中乳果糖含量降到 400。 我國于 2005 年出臺(tái)的農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 939氏殺菌乳和 菌乳中復(fù)原乳的鑒定中也規(guī)定 菌乳中乳果糖含量應(yīng)低于 600，并將其作為判定 菌乳中是否含有復(fù)原乳的指標(biāo)之一。該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：若 菌乳中糠氨酸 含量在 140 到 190mg/白質(zhì)時(shí)，用乳果糖與糠氨酸的比值來判定是否含復(fù)原乳。若乳果糖 /糠氨酸含量比值 2 時(shí)則判定含有復(fù)原乳，反之亦然。這是因?yàn)槿榉壑锌钒彼岷慷荚?200mg/白質(zhì)以上，而乳果糖含量很低（ 50，按 制 成復(fù)原乳計(jì)算）。在 110 150 乳果糖異構(gòu)化程度是梅拉德反應(yīng)的 3 4 倍。但在貯存期間梅拉德反應(yīng)的程度大于乳糖異構(gòu)化（ 993）。如果 菌乳中摻入復(fù)原乳，則糠氨酸含量增加，而乳果糖含量下降，所以乳果糖 /糠氨酸含量比值降低。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 12 在的問題和有待進(jìn)一步深入研 究的領(lǐng)域 綜上所述，盡管國外對牛乳中的乳果糖含量作了大量的研究工作，但仍然存在如下問題： 1） 從國內(nèi)外研究技術(shù)來看，現(xiàn)有的 酶法測定 乳果糖效率較低，限制了其推廣，迫切需要有高效、低成本和抗干擾的替代方法； 2）乳果糖在牛乳熱處理時(shí)間和溫度的條件下的具體變化規(guī)律并不清楚； 3）復(fù)原乳在 巴氏殺菌乳和 菌乳中添加比例與乳果糖含量的關(guān)系尚待研究； 4）乳果糖在儲(chǔ)存期間的變化規(guī)律目前我國研究尚屬空白。 究目的和意義 由于液態(tài)乳質(zhì)量和復(fù)原乳問題，我國已經(jīng)開始通過測定乳品中乳果糖的含量來進(jìn)行液態(tài)乳質(zhì)量評價(jià)。但目前 乳 果糖測定 方法的缺點(diǎn)限制了其推廣，迫切需要有高效、低成本和抗干擾的替代方法。本研究通過對乳果糖測定方法的優(yōu)化，探討乳果糖在不同加工條件 下 的變化規(guī)律，進(jìn)而建立評價(jià)牛乳熱處理效應(yīng)的體系指標(biāo)， 并 為乳品企業(yè)質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 乳果糖酶法測定方法的優(yōu)化 13 第二章 乳果糖 酶法 測定方法的優(yōu)化 法具有準(zhǔn)確度高、檢出限低的優(yōu)點(diǎn)。但該方法也具有明顯的缺點(diǎn)：利用 半乳糖苷酶水解乳果糖是該方法的關(guān)鍵步驟， 該步驟中的 培養(yǎng)溫度為 40 （ 1285而該溫度正是微生物適宜生長的溫度。牛奶中絕大多數(shù)微生物都屬于中溫微生物，其最適生長溫 度一般在20 45 之間。在采用 法對牛乳中乳果糖含量進(jìn)行測定時(shí)發(fā)現(xiàn)若試驗(yàn)器皿的潔凈度不高，或試驗(yàn)環(huán)境中微生物較多，極易產(chǎn)生微生物污染而造成乳果糖測定值偏低；此外該步驟中培養(yǎng)時(shí)間規(guī)定為 10h 以上，也造成整個(gè)測定周期過長，不利于 該 方法的推廣和大批量測定。 酶水解反應(yīng)完全程度受溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶量和 的影響。為了盡量縮短培養(yǎng)時(shí)間，減少測定周期，本試驗(yàn)根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的原理：升高培養(yǎng)溫度和加大酶的添加量可加速酶的反應(yīng)速度而對水解條件進(jìn)行優(yōu)化，從而建立出一種快速 檢測乳果糖的 方法。 料與方法 驗(yàn) 內(nèi)容 驗(yàn)一 半乳糖苷酶 的篩選 通過對兩種 半乳糖苷酶 的篩選和用量確定，選出最適宜乳果糖測定的 半乳糖苷酶 ； 驗(yàn)二 乳果糖水解步驟各條件對水解率的影響 探討培養(yǎng)溫度對乳果糖水解步驟的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步確定乳果糖水解步驟的酶添加量與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系，確定優(yōu)化條件，從而建立快速測定乳果糖含量 的方法 。 驗(yàn)三 回收率的測定 在新鮮生乳中添加不同濃度（ 5 600）的乳果糖標(biāo)準(zhǔn)液，采用乳果糖快速酶法進(jìn)行乳果糖標(biāo)準(zhǔn)的回收率測定，檢測 該 方法的可靠性。 驗(yàn)四 快速酶法與 法比較研究。 對市場上采購的 菌乳進(jìn)行快速酶法與 法對比試驗(yàn)，采用配對樣品 t 檢驗(yàn)對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。并研究試驗(yàn)環(huán)境對兩種方法的影響。 驗(yàn)五 快速酶法在乳中乳果糖含量檢測中的應(yīng)用。 采用快速酶法對市場上購買的不同種類牛乳和自己制備的不同加工工藝的牛乳樣品進(jìn)行測定，探討該方法的應(yīng)用。 料來源 試驗(yàn) 一至 試驗(yàn) 五的 牛乳樣品來源見表 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 乳果糖酶法測定方法的優(yōu)化 14 表 2測樣品來源 he of 樣品名稱 熱處理工藝 (溫度 /時(shí)間 ) 樣品 數(shù)量 樣品來源 試驗(yàn) 生鮮牛乳 11 中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)牛場 試驗(yàn)三及試驗(yàn)五 巴氏殺菌乳 巴氏殺菌 25 超市隨機(jī)購買的商業(yè)牛乳 試驗(yàn)五 85 15S 4 自己制備：生鮮牛乳經(jīng) 65 ， 15S 預(yù)熱、均質(zhì)后，在 85 的水浴鍋中加熱 15S 菌乳 超高溫滅菌 74 超市隨機(jī)購買的商業(yè)牛乳 試驗(yàn)一、試驗(yàn)二、試驗(yàn)四及試驗(yàn)五 137 5S 3 自己制備： 采用 型加工設(shè)備按照不同加工溫度和加工時(shí)間加工生產(chǎn) 138 2S 3 139 5S 3 140 5S 3 141 2S 3 142 15S 3 奶粉 3 市場上購買的工業(yè)奶粉。測定時(shí)按照總固形物為 12配制成復(fù)原乳 試驗(yàn)五 要試劑 半乳糖苷酶 ( 5635 ；5160)；葡萄糖氧化酶 ( 9180)；過氧化氫酶 (C 0630) ；己糖激酶葡萄糖 酸脫氫酶 (s E. C. 8629 )；磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 (C 2688)；其他試劑均為分析純。 要儀器 紫外 /可見光分光光度計(jì) 司）；生化培養(yǎng)箱 9050 劑配制 沖液 A ( ( 2O)和 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 乳果糖酶法測定方法的優(yōu)化 15 溶解于 80中，用 1 氫氧化鈉溶液調(diào)整 20 ）稀釋到 100勻。 沖液 B 稱取 乙醇胺鹽酸鹽 N(和 酸鎂 (解于80中。用 1L 氫氧化鈉溶液調(diào)整 20 ），稀釋到 100勻。 沖液 C 將 沖液 B 用水稀釋到 100勻。 半乳糖苷酶懸浮液 以 300mg/度保存于 L 硫酸銨溶液 (活性為 10U/37 ）。 萄糖氧化酶懸浮液 將 20230U 37 ）的葡萄糖氧化酶溶于 1，該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。 氧化氫酶 懸浮液 保存于 20mg/溶液中， 65000IU/25 ，以過氧化氫為底物）。 糖激酶 葡萄糖 浮液 保存在 硫酸銨溶液。 2mg/140U/25 ；以葡萄糖和 底物）；mg/140U/25 ；以葡萄糖 6 酸葡萄糖異構(gòu)酶 (浮液 保存于 硫酸銨溶液中。磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 2mg/350IU/25；以果糖 液 50 50酸氫鈉溶于 1中。 10于 1。 果糖測定方法 乳果糖測定方法采用 法 （ 11285。只在乳果糖水解步驟中的 半乳糖苷酶 來源、半乳糖苷酶 添加量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度的條件有所不同。 品制備： 移取 測 乳 樣于 100量瓶，用蒸餾水定容，搖勻。 品純化： 取 制備的樣品 50角瓶中，依次加入 度為 150 g/L 的亞鐵氰化鉀 (e()溶液、 度為 300g/L 的硫酸鋅（ 液和 沖液 A。每加一次試劑后要充分搖勻，全部加完后靜置沉降 30濾。棄去最初的幾滴濾液，收集純化好的試樣溶液。稱為樣品的 “澄清液 ”。 果糖的水解： 取樣品澄清液 10量瓶中，加入 100l（ 300U）的 半乳糖苷酶 懸浮液，搖勻、加蓋，在 50 下培養(yǎng) 1 小時(shí)。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 乳果糖酶法測定方法的優(yōu)化 16 萄糖氧化步驟： 在 養(yǎng)好的試樣中，依次加入 沖液 C、 100l 葡萄糖氧化酶懸浮液、 1 滴正辛醇、 氫氧化鈉溶液、 5030%）和 100加一種試劑要搖勻，全部加完后，在 40 水浴或烘箱中培養(yǎng) 3h。冷卻后用蒸餾水定容至 10濾，棄去開始的幾滴濾液，收集氧化后的試樣溶液。稱為 “待測濾液 ”。 白試樣： 每個(gè)樣品都要做空白測定?？瞻自嚇硬襟E同 是在 驟中省去加 半乳糖苷酶 懸浮液。 色測定：以下測定步驟按表 2 表 2色步驟所添加試劑順序 ce i n 步驟 空白 樣品 比色皿中依次加入： 緩沖溶液 B 液 液 測濾液 餾水 勻，靜置 5入 浮液 20l 20l 混勻，靜置 10 340 入 浮液 20l 20l 混勻， 15測 吸光度 ：（ 1）以上反應(yīng)在同一比色皿中進(jìn)行。 （ 2）如果加 1樣濾液吸光度超過 適當(dāng)減少待測濾液體積，增加水體積，保持最后總體積為 果計(jì)算 樣品吸光值差值 空白吸光值差值 品凈吸光值差值 果糖含量 C（ ）： 0g / ）（乳果糖含量 式中： 乳果糖的摩爾質(zhì)量（ 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 乳果糖酶法測定方法的優(yōu)化 17 340摩爾吸光度（ 比色皿中液體總體積（ 比色皿中加入的濾液體積（ 1 d比色皿的光徑（ 1 V乳樣總體積（ 50 據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)處理采用 有數(shù)據(jù)采用最小二乘均數(shù) 重比較利用 對比試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用可量資料兩樣本平均數(shù)配對法 T 檢驗(yàn)。 果與討論 半乳糖苷酶的篩選及其用量的確定 圖 2同半乳糖苷酶及其添加水平對乳果糖測定的影響 （ 米曲霉源， 大腸桿菌源） of of 2004 年出臺(tái)的酶法測定牛乳中乳果糖的方法中明確規(guī)定乳果糖水解步驟的 半乳糖苷酶 為大腸桿菌（ E. 源。但 （ 1996）， （ 2003）均 指出在乳糖存在的情況下， E. 半乳糖苷酶 對乳果糖的水解活力僅為乳糖的 6%，米曲霉源的 半乳糖苷酶對乳果糖的水解活力則為乳糖的 210%。本試驗(yàn)也通過比較這兩種酶的不同添加量（ 5 U、 5U、 50U、 75U、 150U、 200U、 300U）對乳果糖水解的影響發(fā)現(xiàn)（見圖 2在 準(zhǔn)推薦的反應(yīng)條件下，米曲霉源的 半乳糖苷酶具有更高的乳果糖水解效率：添加量為 50U 時(shí)乳果糖便中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 乳果糖酶法測定方法的優(yōu)化 18 可完全水解，然而依照 準(zhǔn)推薦每樣品添加 75U 大腸桿菌源的 半 乳糖苷酶的方法所得結(jié)果顯著偏低（ l 和 l， P這也說明 薦的標(biāo)準(zhǔn)方法中 半乳糖苷酶的添加量有可能導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。目前，米曲霉源的 半乳糖苷酶的價(jià)格約為 大 腸桿菌源的 1/10 倍，選用米曲霉源的 半乳糖苷酶還可顯著降低 測定 成本。因此，以下試驗(yàn)均選用米曲酶源的 半乳糖苷酶。 果糖水解步驟各條件對水解率的影響 養(yǎng)溫度對乳果糖水解步驟的影響 （ 1986）研究表明在相同條件下，乳果糖水解步驟的培養(yǎng)溫度 40 與 50 無顯著差異。 1978）也證明多種 半乳糖苷酶 對乳糖水解作用的最適宜溫度為 43 53 ，較低溫度會(huì)影響果糖的生成。 （ 2000）試驗(yàn)表明 半乳糖苷酶 在 65 、培養(yǎng)時(shí)間5加量為 30U、水解液 為 條件下就可以水解完全，該試驗(yàn)同時(shí)證明溫度越高，乳果糖完全水解所用的培養(yǎng)時(shí)間越短。本試驗(yàn)（見表 2明在水解液 為 情況下，65 的培養(yǎng)溫度是及其不合適的， 65 最低與 30 、 40 、 50 都有顯著差異（ P懷疑65 的溫度使米曲霉源的 半乳 糖苷酶 失活。而 50 時(shí)乳果糖含量最高且與 40 無顯著差異，同時(shí)可從表中看出隨著溫度升高，乳果糖含量呈上升趨勢。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)原理：升高溫度會(huì)使酶反應(yīng)速率提高。因此，本實(shí)驗(yàn)選用培養(yǎng)溫度 50 后，繼續(xù)進(jìn)行了酶添加量與培養(yǎng)時(shí)間的析因?qū)嶒?yàn)，尋找二者間的互作關(guān)系。 表 2養(yǎng)溫度對乳果糖水解程度的影響 on of by 養(yǎng)溫度（ ） 30 40 50 65 乳果糖（ ） ：同行數(shù)據(jù)右肩標(biāo)有不同小寫字母者為差異達(dá)到顯著水平 (P 定溫度下，培養(yǎng)時(shí)間與酶添加量對乳果糖水解步驟的影響 乳果糖水解步驟的進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)采取 54 析因試驗(yàn)，各因子的水平見表 2果見表 2 表 2素與水平 he of 目 培養(yǎng)時(shí)間 (h) 酶添加量 (U) 培養(yǎng)溫度 ( ) 1 5 50 2 1 150 50 3 4 300 50 4 7 600 50 5 10 50 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第二章 乳果糖酶法測定方法的優(yōu)化 19 表 2因子對實(shí)驗(yàn)處理組乳果糖濃度的影響 he of on of 養(yǎng)時(shí)間 酶添加量 顯著性水平 培養(yǎng)時(shí)間 酶添加量 兩者交互 乳果糖（ ） 1 注：同 列 數(shù)據(jù)右肩標(biāo)有不同大寫字母者為差異達(dá)到極顯著水平 (P 表 2定酶添加量 300U 下，不同培養(yǎng)時(shí)間的乳果糖含量變化 he of in by 00U in 養(yǎng)時(shí)間（ h） 4 7 10 乳果糖（ ）