【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）混合陽(yáng)離子交聯(lián)劑甲基丙烯酸海藻酸鹽微球的構(gòu)建及其性能研究

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 I 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 1 前 言 軟骨在全身骨骼的功能活動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用，承擔(dān)機(jī)械負(fù)荷后不容易發(fā)生永久變形 1。然而關(guān)節(jié)軟骨損傷也是臨床上常見(jiàn)的問(wèn)題，并且一旦損傷，自我修復(fù)能力較差 2?；颊叱?huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)反復(fù)疼痛、活動(dòng)受限等，嚴(yán)重影響人們的生活。口腔頜面部常見(jiàn)的顳下頜關(guān)節(jié)紊亂?。?展到后期，出現(xiàn)關(guān)節(jié)器質(zhì)性破壞，關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，關(guān)節(jié)盤(pán)穿孔、破裂等嚴(yán)重影響下頜的運(yùn)動(dòng)，對(duì)患者的心理，生理都造成巨大的影響 3。當(dāng)前，治療軟骨損傷的主要方法有：刺激 關(guān)節(jié)自身修復(fù)和再生；軟骨、骨膜和軟骨細(xì)胞的移植；組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷 4等。 然而無(wú)論是軟骨細(xì)胞移植還是組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，都需要大量的軟骨細(xì)胞。自體軟骨細(xì)胞是最為理想的種子細(xì)胞，但自體軟骨取材受限制，增殖能力差，體外培養(yǎng)易去分化、失去原有的表型 5。怎樣才能使軟骨細(xì)胞在體外大量增殖且能夠保持原有的表型，是一個(gè)需要解決的問(wèn)題。 隨著生物學(xué)的發(fā)展，設(shè)計(jì)和發(fā)展模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的物理、化學(xué)結(jié)構(gòu)的三維（ 3D）細(xì)胞培養(yǎng)逐漸被人們認(rèn)識(shí) 6，海藻酸鹽水凝膠由于其良好的生物相容性 ,長(zhǎng)期以來(lái)都被當(dāng)做三維（ D）細(xì)胞培養(yǎng)的良好支架材料。 等首次利用海藻酸鹽凝膠小球作為支架培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在小球中能夠維持球形形態(tài)。后續(xù)又有大量學(xué)者對(duì)軟骨細(xì)胞在海藻酸鹽凝膠小球中的三維（ 3D）培養(yǎng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞能維持細(xì)胞的表型，分泌功能性細(xì)胞外基質(zhì)，但是存在的問(wèn)題是，細(xì)胞在藻酸鹽凝膠小球中生長(zhǎng)，雖然能夠維持良好的表型，但是細(xì)胞的增殖不好，連續(xù)四周培養(yǎng)，僅有少量增殖 8。 目前， 為 使 海藻酸鹽水凝膠 能更好的應(yīng)用于組織工程支架材料 領(lǐng)域 ,對(duì) 它的 改性 研究 主要集中在 ： 強(qiáng)度和滲透性兩個(gè) 方面。細(xì)胞能夠感應(yīng)細(xì)胞外基底的強(qiáng)度 9，基底強(qiáng)度能夠影響細(xì)胞的表型和增殖 10對(duì)于細(xì)胞的三維（ 3D）培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)是一個(gè)關(guān)鍵因素，材料對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲透性，直接關(guān)系到材料中細(xì)胞的增殖和生存 14目前提高強(qiáng)度的方法基本都是增加水凝膠的交聯(lián)密度，這樣在提高強(qiáng)度的同時(shí)帶來(lái)了凝膠滲透性的下降。 5等將甲基丙烯酸引入藻酸鹽長(zhǎng)鏈，利用甲基丙烯酸中雙鍵聚合的反應(yīng)，在不增加交聯(lián)密度的情況下增加海藻酸鹽的強(qiáng)度，最后結(jié)果顯示，材料強(qiáng)度增加，滲透性下降約 10%。 6等 研究不同陽(yáng) 離子對(duì)于海藻酸鹽水凝膠的影響，蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 2 發(fā)現(xiàn)高 片段的藻酸鹽，對(duì)于不同的陽(yáng)離子 成的凝膠的強(qiáng)度還有滲透性不一樣 . 童粵生 17等研究了混合 種離子作為陽(yáng)離子交聯(lián)劑，形成的藻酸鹽水凝膠的性能，發(fā)現(xiàn)滲透性較好，能夠使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)自由通透，但是對(duì)于凝膠的強(qiáng)度并沒(méi)有進(jìn)行直接的數(shù)據(jù)測(cè)量，通過(guò) 48振蕩破損率來(lái)大體反應(yīng)其強(qiáng)度，結(jié)果顯示強(qiáng)度 增 高并不明顯，低于 10%。所以本實(shí)驗(yàn)中我們假設(shè)把 合作為陽(yáng)離子交聯(lián)劑，與經(jīng)過(guò)甲基丙烯酸改性的海藻酸鹽反應(yīng)，生成的水凝膠，既 具有高的強(qiáng)度同時(shí)又能維持其滲透性不下降，并將改進(jìn)后的海藻酸鹽水凝膠用于培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，使軟骨細(xì)胞能夠在體外獲得 更 好的生存條件。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 3 文獻(xiàn)回顧 一，海藻酸鹽的理化特性 海藻酸鹽是一種從海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻中提取的天然多糖高分子化合物，是由一 與 依靠 1,4一糖苷鍵連接，并由不同 中 單元在 18如（圖 1）。 19， 水溶液中海藻酸鹽的彈性按照 20。 于某一海藻酸鹽，分子結(jié)構(gòu)中的 的比例以及它們的排列順序會(huì)決定該鹽的性質(zhì)。海藻酸鹽的分子量變化范圍較大在50間。海藻酸鹽水溶液為較粘稠的溶液，其粘滯性與分子量相關(guān)。海藻酸鈉水溶液很容易和 某些二價(jià)陽(yáng)離子以離子交聯(lián)的方式形成水凝膠。在海藻酸鈉水溶液中加入 、 二價(jià)陽(yáng)離子后， a+會(huì)與二價(jià)陽(yáng)離子發(fā)生交換反應(yīng)，形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。研究表明 16 海藻酸鈉的作用力比 ， 能夠與海藻酸鈉的 外海藻酸鈉還可以和己二酸二酰肼、賴氨酸、聚乙二醇 成穩(wěn)定的共價(jià)交聯(lián)水凝膠。在實(shí)際應(yīng)用中較少使用共價(jià)交聯(lián)來(lái)形成海藻酸鈉水凝膠，因?yàn)楣矁r(jià)交聯(lián)劑通常具有一定的毒性。 圖 1 海藻酸鹽的基本結(jié)構(gòu) 單元 海藻酸鈉與二價(jià)陽(yáng)離子（如 交聯(lián)的原理，海藻酸鈉與 成海藻酸鈣水凝膠，電子顯微鏡觀察為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被稱(chēng)為“蛋格”樣結(jié)構(gòu)21機(jī)理如下： 1個(gè) 與海藻酸鈉分子鏈中的兩個(gè) 過(guò) 4個(gè)配位鍵形成“蛋格”結(jié)構(gòu)， 其中 2）。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 4 圖 2 海藻酸鈉凝膠的“蛋格”結(jié)構(gòu) 二，海藻酸鹽水凝膠在軟骨組織工程中的應(yīng)用 目前，軟骨組織工程的研究?jī)?nèi)容主要集中在以下三個(gè)方面即種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞體外培養(yǎng)的環(huán)境和條件。其中支架材料的研究一直都是軟骨組織工程的研究熱點(diǎn)。支架就是 3織細(xì)胞都存在于一定的 3 因此，在軟骨組織工程中，構(gòu)建一種適合細(xì)胞生長(zhǎng)的支架材料成為組織工程的研究 熱點(diǎn)。 在組織工程領(lǐng)域，現(xiàn)有的支架材料分為四類(lèi)：金屬、陶瓷、聚合物和復(fù)合材料 23。其中聚合物由于高度的可塑性而被廣泛的關(guān)注。聚合物材料又分為天然和合成兩種。主要包括：聚乙烯醇 、 多肽 、 氧化乙烯等合成材料以及海藻酸鹽 、 殼聚糖 、 膠原 、 明膠 、 透明質(zhì)酸等天然材料 24。合成材料能成規(guī)模生產(chǎn)，容易調(diào)控所制備水凝膠的微結(jié)構(gòu)、降解速率 、 力學(xué)性能等，但最大的不足之處就是缺乏細(xì)胞識(shí)別信號(hào)。天然材料具有特異的細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，但通常來(lái)源不足且性能存在差異。 在天然材料中，海藻酸鹽價(jià)格低廉 、 來(lái)源豐富。 海藻酸鹽的親水性及帶負(fù)電荷能 很好的模擬軟骨細(xì)胞外基質(zhì) 25。藻酸鈣凝膠小球 的 表面以及內(nèi)部孔隙，可以讓細(xì)胞進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)交換。在藻酸鈣凝膠小球中培養(yǎng)軟骨 細(xì)胞 ，能夠保持細(xì)胞的球形形態(tài)，這對(duì)軟骨細(xì)胞的表型維持非常重要 26。 其次，海藻酸鹽良好的生物相容性，水溶液可以和二價(jià)陽(yáng)離子作用形成凝膠小球 ， 在凝膠小球中的軟骨細(xì)胞可以通過(guò) 合劑從小球中釋放出來(lái) 27等特性，都 使其具備了細(xì)胞 3酸鈣在 1989年首先被 等應(yīng)用于組織工程研究，隨后 8等將海藻酸鈣復(fù)合上軟骨細(xì)胞并在裸鼠皮下成功構(gòu)建出了透蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 5 明軟骨組織， 楊偉東 29等將藻酸鈣與骨髓基質(zhì) 干 細(xì)胞復(fù)合用注射方式已在裸鼠皮下成功構(gòu)建出組織工程骨，在無(wú)免疫動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)海藻酸鈣是一種良好的支架材料。 藻酸鈣雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但也存在組成成份不穩(wěn)定 ,體內(nèi)難以降解，體內(nèi)吸收差 ,機(jī)械強(qiáng)度低等 30缺點(diǎn)。 長(zhǎng)期增殖發(fā)展。 1等利用海藻酸鈣復(fù)合軟骨細(xì)胞，修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損時(shí)，發(fā)現(xiàn)大約 20%的植入體被纖維組織所取代，認(rèn)為藻酸鈣作為細(xì)胞外支架材料其機(jī)械強(qiáng)度有待提高。任利玲 8等在藻酸鈣凝膠小球中培養(yǎng)軟骨細(xì)胞 ，發(fā)現(xiàn)在海藻酸鹽凝膠小球中培養(yǎng)軟骨細(xì)胞能維持其表型，軟骨細(xì)胞能不斷分泌功能性細(xì)胞外基質(zhì)，再次證實(shí)以海藻酸鹽水凝膠作為軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)基質(zhì)是可行的，但是連續(xù) 4周培養(yǎng)，細(xì)胞僅有少量增殖。怎樣才能克服以上的缺點(diǎn)，讓海藻酸鹽這種擁有諸多優(yōu)點(diǎn)的組織工程支架材料，在組織工程支架材料領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用，是學(xué)者們一直研究的重點(diǎn)。 三，海藻酸鹽水凝膠的改性研究 針對(duì)海藻酸鹽水凝膠的 機(jī)械 強(qiáng)度不足，學(xué)者們做了大量的改性研究。通過(guò)增加聚合物溶液的濃度或者增加陽(yáng)離子交聯(lián)劑如 濃度來(lái)增加凝膠的剛度是以前研究較多的。但是研究發(fā) 現(xiàn)隨著聚合物溶液的濃度增加，必然會(huì)引起交聯(lián)密度的上升，凝膠表面孔隙率和孔徑的下降，這樣即使強(qiáng)度提高了，對(duì)于細(xì)胞的生存卻不理想 32。因?yàn)楹Ｔ逅猁}微球包埋細(xì)胞作為細(xì)胞生長(zhǎng)的支架材料，細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需從周?chē)囵B(yǎng)基中獲得，藻酸鹽凝膠的多孔結(jié)構(gòu)，其表面有很多孔隙，這是交聯(lián)形成的特有的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，也是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝廢物進(jìn)出的通道。所以一旦孔隙率減 小 ，孔徑減小，那么營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入小球的通道便受阻，同時(shí)細(xì)胞的代謝產(chǎn)物也不能 很好 排出，這樣細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和活性便會(huì)受到影響。所以理想的支架材料應(yīng)該是既具有較高的機(jī)械 強(qiáng)度， 又 具有良好的滲透性。如何對(duì)海藻酸鹽進(jìn)行改性，使 得在剛度提高的同時(shí)能控制其滲透 性 的降低，是長(zhǎng)期以來(lái)研究的難點(diǎn)。 目前，海藻酸鹽水凝膠作為組織工程中培養(yǎng)細(xì)胞的支架材料的改性研究有 ： 王華明，曹 陽(yáng) 33等將海藻酸鈉溶液滴入殼聚糖和氯化鈣的混合溶液反應(yīng)合成海藻酸鈣殼聚糖 (合水凝膠材料 。 S34等用海藻酸鹽和殼聚糖形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來(lái)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。以上兩個(gè)研究發(fā)現(xiàn)用殼聚糖對(duì)藻酸鹽水凝膠進(jìn)行改性后，形成的 面形成更多網(wǎng)格，內(nèi)部呈多孔結(jié)構(gòu)，孔隙間貫通性高，材料 的可塑性增加，含水率增加，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但是凝膠的強(qiáng)度降低 。 童粵生 17等以氯化鈣和氯化鋇混合鹽溶液為交蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 6 聯(lián)劑，制備海藻酸鹽微囊 。 研究表明：以 ： 為 7： 3作為混合交聯(lián)劑制備的微囊力學(xué)強(qiáng)度提高而且對(duì)于大分子物質(zhì)的通透性較好 ,但是強(qiáng)度提高并不明顯 。 通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，把傳統(tǒng)的陽(yáng)離子交聯(lián)劑 成了混合陽(yáng)離子交聯(lián)劑 這為以后學(xué)者們的研究開(kāi)拓了思路。 16 等研究表明改變陽(yáng)離子交聯(lián)劑的種類(lèi)，分別用 為陽(yáng)離子交聯(lián)劑形成的凝膠在性質(zhì)上存在很大差異， 對(duì)于高 為交聯(lián)劑，生成的 凝膠小球：體積小，強(qiáng)度高，孔徑??； 為交聯(lián)劑，生成的 凝膠小球：體積大，強(qiáng)度低，孔徑大 ，對(duì)于高 作用與高 其原因在于 與藻酸鹽的 與藻酸鹽的 片段連接 ， 所以導(dǎo)致了以上小球性質(zhì)的不同 。 2010年 5等首次把甲基丙烯酸鹽引入海藻酸鹽改性的材料中，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)化學(xué)交聯(lián)甲基丙烯酸藻酸鹽和聚二甲基丙烯酸形成凝膠，在提高藻酸鹽凝膠強(qiáng)度的時(shí)候能夠減弱對(duì)其滲透率的影響，但是這種 方法較復(fù)雜。 2011年 5等制作出甲基丙烯酸藻酸鹽凝膠微球，并在光催化劑 結(jié)果 下降約 10%。 2011年 36等研究把甲基丙烯酸藻酸鹽凝膠微球的光交聯(lián)劑換成 后用其形成的凝膠培養(yǎng)牛軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)牛軟骨細(xì)胞的生存能力大于 85%，通過(guò)改變光交聯(lián)劑的種類(lèi)對(duì) 時(shí)也證明了 綜上，我們 假設(shè)若把 合作為陽(yáng)離子交聯(lián)劑 與甲基丙烯酸海藻酸鹽作用，形成凝膠 ， 陽(yáng)離子交聯(lián)劑與 海藻酸鹽的 G、 M、 論是高 片段的藻酸鹽，混合陽(yáng)離子都能兼顧其強(qiáng)度的提高和滲透性的不降低，同時(shí)甲基丙烯酸海藻酸鹽的強(qiáng)度也高于海藻酸鹽，所以既能提高海藻酸鹽水凝膠的強(qiáng)度又不至于使其滲透性大幅下降。在本實(shí)驗(yàn)中我們采 用不同比例的氯化鋇和氯化鈣的混合鹽溶液作為陽(yáng)離子交聯(lián)劑，制備甲基丙烯酸海藻酸鹽凝膠小球，比較了不同比例的 混合溶液作為陽(yáng)離子交聯(lián)劑制作的凝膠小球的壓縮模量和滲透性 ， 以期其能更好的應(yīng)用于組織工程支架材料領(lǐng)域。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 7 第一部分 混合陽(yáng)離子交聯(lián)劑甲基丙烯酸海藻酸鹽微球的構(gòu)建及其性能研究 隨著海藻酸鹽在組織工程中的應(yīng)用增加，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)海藻酸鹽的強(qiáng)度不足，不能夠支持細(xì)胞長(zhǎng)期生存發(fā)展的需要 ， 并且研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的強(qiáng)度會(huì)影響細(xì)胞的表型、增殖 37 ， 所以學(xué)者們開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行強(qiáng)度改性。剛開(kāi)始的嘗試都是從增加聚合物的濃度、增加交聯(lián)劑陽(yáng)離子的濃度上入手的，最后發(fā)現(xiàn)強(qiáng)度雖然提高了，但在實(shí)際培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用中，細(xì)胞的活性還有增殖卻并沒(méi)有得到提升。又經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，海藻酸鹽水凝膠表面，在 成膠時(shí)形成的“蛋格”樣結(jié)構(gòu)的孔隙，會(huì)隨著交聯(lián)密度的增加而減小，而這些孔隙正是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入凝膠供應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的通道。所以人們便轉(zhuǎn)變思路，想尋找一種方法，既能提高海藻酸鹽水凝膠的強(qiáng)度， 又 不至于使其凝膠的孔隙減小。在這個(gè)過(guò)程中，有國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，不同的二價(jià)陽(yáng)離子和海藻酸鹽作用形成的水凝膠的強(qiáng)度，孔徑不同，提示我們可以改變陽(yáng)離子的種類(lèi)，來(lái)實(shí)現(xiàn)提高凝膠的強(qiáng)度 的同時(shí) 調(diào)控其孔徑。國(guó)內(nèi)又有人研究把陽(yáng)離子混合作為交聯(lián)劑，和海藻酸鹽作用形成水凝膠，發(fā)現(xiàn)混合陽(yáng)離子比單一陽(yáng)離子形成的凝膠的性能更好，為我們?cè)诨旌详?yáng)離子作為交聯(lián)劑上提 供了思路，但是只改變陽(yáng)離子，只能有限的改變凝膠的強(qiáng)度和孔隙。近年，國(guó)外學(xué)者又研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，把甲基丙烯酸引入海藻酸鹽，然后利用甲基丙烯酸上雙鍵的不穩(wěn)定性，通過(guò)光反應(yīng)或者熱反應(yīng)使雙鍵發(fā)生聚合， 從而 在分子量上改變海藻酸鹽的性能，使其形成的凝膠具有更高的強(qiáng)度 ， 此實(shí)驗(yàn)已經(jīng)獲得成功，但只是使用單一的陽(yáng)離子作為陽(yáng)離子交聯(lián)劑，沒(méi)有探討混合陽(yáng)離子的效果。因此，本研究利用混合陽(yáng)離子 為陽(yáng)離子交聯(lián)劑與甲基丙烯酸海藻酸鹽進(jìn)行成膠反應(yīng)，并對(duì)生成的凝膠做強(qiáng)度和滲透性的檢測(cè)，為其以后在組織工程支架材料的應(yīng)用中 ，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料及溶液配制 驗(yàn)材料及主要儀器 低粘度海藻酸鈉（ 國(guó)）；氯化鈣 (分析純 )；氯化鋇（分析純）；海生工）； 國(guó)）； 亞試劑 ）； 靈威）；熱引發(fā)劑 凍干燥機(jī) (核磁分析儀；萬(wàn)能材料測(cè)試儀 紫外分光光度計(jì)；透析袋； 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 8 驗(yàn)方法 基丙烯酸藻酸鹽 (制備 1）配置 l 緩沖液： 子量為 l，配置 250ml 沖液。 稱(chēng)取 末，加入 250三蒸水中，玻璃棒攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié) h=4保存，待用。 2）按照質(zhì)量體積比 1/100的濃度 ,把藻酸鹽溶解在 50ml 沖液導(dǎo)入圓底燒瓶中 ,加入 酸鹽粉末。放入磁子，在磁力攪拌機(jī)攪拌將約 酸鹽完全溶于 沖液。 3） 按照 15等的方法制作 攪拌均勻的海藻酸鹽溶液中，按照2： 2： 1 的比例，相繼加入 1 基二甲基胺丙基碳化二亞胺 ) 、 。其中 藻酸鹽的糖醛酸基團(tuán)的比例保持在 5/100 不變。因?yàn)樵逅猁}是大分子 ,分子量是一個(gè)大體的范圍 ,所以藻酸鹽分子量的確定我們采用算出它一個(gè) G 或 M 單元的分子量 ,然后算出 酸鹽中含有多少摩爾的 G 或 M 單元 ,也就確定了糖醛酸基團(tuán)的摩爾數(shù) ,最終確定 用量。一個(gè) G 或 75,所以 照 基團(tuán)的比例保持在 5/100 不變的比例需要加入的 0照 ： 2： 1的比例 ,需加入的 摩爾量依次為 :000以 用量依次為： ， 02366g。以上混合液依舊放在圓底燒瓶中，在磁力攪拌器上攪拌 19h， 194000的透析袋中，進(jìn)行透析，每 6水 (透析用的是蒸餾水 )透析 48小時(shí)，然后視透析完成的情況，若是覺(jué)得透析后透析袋里的水太多，可以把透析好的溶液在冷凍干燥的前一天取出來(lái)，放在燒瓶中，放入磁子，進(jìn)行攪拌蒸發(fā)，也可以先放在烘箱中溫度 30左右，烘 右，然后放在磁力攪拌機(jī)上進(jìn)行攪拌 、 蒸發(fā) ， 以便于第二天進(jìn)行冷凍干燥的效果。 4） 把透析好的溶液進(jìn)行冷凍干燥：取液氮，裝樣，每個(gè)樣都要貼上自己的標(biāo)簽，裝好樣后在液氮中冷凍，一定要全部?jī)龀杀?，放在冷凍干燥的機(jī)器上進(jìn)行抽真空，使得冰在低溫下升華揮發(fā)，需要時(shí)間為 24h，最后收集產(chǎn)物。 5） 對(duì)產(chǎn)物 中混有 核磁譜圖分析 39：取少量產(chǎn)物（ 放入核磁管，溶解于氘水中，用 300核磁檢測(cè)，最后對(duì)檢測(cè)結(jié)果做氫譜分析 ,通過(guò)氫譜分析看產(chǎn)物有沒(méi)有按預(yù)期結(jié)果引入需要引入的雙鍵基團(tuán)。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 9 合陽(yáng)離子凝膠小球的制備 1）配制二價(jià)陽(yáng)離子總濃度為 的氯化鈣和氯化鋇混合鹽溶液。 7： 3的混合陽(yáng)離子鹽溶液 的 配制：稱(chēng)取氯化鈣 化鋇 于 50蒸水中，在磁力攪拌器上攪拌 完全溶解，滴入幾滴稀鹽酸溶液，中 和生成的碳酸鋇沉淀最后調(diào)節(jié) 4保存，待用。 5： 5 的混合陽(yáng)離子鹽溶液配制：化鋇 0余步驟同上。 3：7 的混合陽(yáng)離子鹽溶液配制：稱(chēng)取氯化鈣 化鋇 于50蒸水中，其余步驟同上。 0： 10 的混合陽(yáng)離子鹽溶液配制：稱(chēng)取氯化鈣 0余步驟同上。 2） 按照質(zhì)量百分比 1/100 配置得到的產(chǎn)物 ( 混合溶液25照 11000 的質(zhì)量百分比添加熱引發(fā)劑。量筒量取 25餾水倒入燒杯中 ,然后用電子天平稱(chēng)取 產(chǎn)物 ( 放入磁子攪拌 ,使產(chǎn)物溶解 ,然后加入 熱反應(yīng)引發(fā)劑 (重結(jié)晶的 攪拌使溶解 以下簡(jiǎn)稱(chēng)溶液 A. 3）準(zhǔn)備一個(gè) 100圓底燒瓶 ,貼上標(biāo)簽 7： 3 加入 30 7： 3 的混合溶液。然后用成膠針頭， 5滴滴入 5溶液 A,形成凝膠小球。油 浴加熱使熱反應(yīng)發(fā)生 ,溫度為 80 ,反應(yīng)時(shí)間為 5 小時(shí) 收集產(chǎn)物凝膠小球 ,收集方法為用濾布過(guò)濾 ,產(chǎn)物小球用蒸餾水沖洗兩次 ,然后把小球轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中 ,30蒸餾水孵浴，待用。用此方法分別制作 5： 7、 3： 7 組的凝膠小球。制作出的小球直徑大約為 2 驗(yàn)分組 1)對(duì)照組：稱(chēng)取海藻酸鹽 1g，溶于 100磁力攪拌器上攪拌 制成 質(zhì)量百分比 1/100的 海藻酸鹽溶液，以下稱(chēng)為溶液 B，待用。取 30 0： 10 的混合陽(yáng)離子鹽溶液 放在一個(gè)100后用成膠針頭， 5針管，逐滴滴入 5溶液 B，生成凝膠小球，反應(yīng)時(shí)間 1小時(shí)，收集方法同上面的小球收集方法，最后也是放在培養(yǎng)皿中， 30蒸餾水孵浴，待用。 2)實(shí)驗(yàn)組：把上面以不同比例 合溶液與 次標(biāo)記為： 7： 3為 樣本 1， 5：5為樣本 2， 3： 7為樣本 3。 縮模量測(cè)量 為了方便測(cè)量壓縮模量，我們利用 一個(gè)圓柱形的大 10 混合陽(yáng)離子溶液反應(yīng)，然后直接把大 放入油浴中進(jìn)行熱反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間也是 5小時(shí)。最后反應(yīng)結(jié)束后把凝膠塊從離心管中取出，用不銹鋼小刀修剪成近似圓柱狀。用萬(wàn)有材料測(cè)試儀測(cè)試各組材料的壓縮模量。萬(wàn)有材料測(cè)試儀 3見(jiàn)附錄一 ）的壓縮速度為 1mm/至凝膠塊被壓為薄片終止壓縮，獲得凝膠塊的壓縮模量 ， 每 個(gè)樣本 準(zhǔn)備 5個(gè) 試樣 ，重復(fù)測(cè)量5次 。 用 算得出壓縮模量 。 透性測(cè)定 1） 牛血清白蛋白和胰蛋白酶溶液的吸光度和濃度之間的線性關(guān)系測(cè)定。分 別配置濃度為 0、 牛血清白蛋白和胰蛋白酶，并測(cè)量其在 280后根據(jù)吸光度和濃度建立坐標(biāo)，觀察坐標(biāo)點(diǎn)之間的線性趨勢(shì)，以 1d，算出 2） 按 童粵生 10等的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定凝膠滲透性：配制濃度為 4個(gè) 1000燒杯，分別加入四組已制作的凝膠小球，每個(gè)燒杯 200 個(gè)小球和 800胰蛋白酶溶液，于 12481632別取各組燒杯中的上清液 10紫外分光光度計(jì)測(cè)量 280的 ，記錄各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì) 牛血清白蛋白溶液的滲透性測(cè)量方法同胰蛋白酶組。 計(jì)學(xué)分析 采用 得數(shù)據(jù)以 x s 表示。組間比較采用單因素方差分析， P 果 A 氫譜分析圖（見(jiàn)圖 4） 甲基丙烯酸藻酸鹽的化學(xué)式見(jiàn)圖 1,若 之 間出現(xiàn)峰 ,均為甲基丙烯酸本身的峰 ,而 之間未出現(xiàn)顯著的峰值 ,說(shuō)明產(chǎn)物 氫譜分析可以得出甲基丙烯酸和藻酸鹽發(fā)生了反應(yīng)，生成了甲基丙烯酸藻酸鹽（ 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 11 : 4:甲基丙烯酸藻酸鹽的氫譜分析結(jié)果 . 合陽(yáng)離子交聯(lián)劑凝膠塊的壓縮模量 。 從結(jié)果分析中可以得到，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的凝膠壓縮模量均有顯著的提高（ p實(shí)驗(yàn)組中樣本 2 5： 5組壓縮模量最高，樣本 1 7： 3組壓縮模量次之，樣本 3 3： 7壓縮模量最低。（見(jiàn)表 1） 表 1 混合陽(yáng)離子交聯(lián)劑制作的各組凝膠小球的壓縮模量（ s,n=5） . 分組 壓縮模量 樣本 1 樣本 2 樣本 3 對(duì)照組 間比較采用單因素方差分析，以 p差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。 : of 合陽(yáng)離子交聯(lián)劑凝膠小球的滲透性 凝膠小球的直徑約為 5見(jiàn)附錄一 ) 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 12 凝膠小球?qū)τ谝鹊鞍酌傅臐B透性（見(jiàn)圖 6） ， 根據(jù) 1d 測(cè)定出的上清液胰蛋白酶的吸光度值換算成濃度 . : of 圖 6凝膠小球?qū)σ鹊鞍酌傅臐B透曲線 . 凝膠小球?qū)τ诜肿恿繛?24透性的實(shí)驗(yàn)表明，胰酶在 2后逐漸趨于平衡。 32因素方差分析各組溶液 32的濃度之間的差異，以p結(jié)果分析中可以得到， 32本 2和樣本 1 溶液中胰蛋白酶的含量較對(duì)照組降低較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p樣本 3溶液胰蛋白酶的含量較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p本 2溶液中胰蛋白酶的含量最低，表明樣本 2小球?qū)τ谝鹊鞍酌傅臐B透性最好，和其它組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p是總體來(lái)講，四 組凝膠小球?qū)τ诜肿恿繛?24液達(dá)到平衡濃度后，溶液中胰蛋白酶的濃度最大僅下降 41%。 凝膠小球?qū)εＱ灏椎鞍椎臐B透性（見(jiàn)圖 7） 根據(jù) 1d 測(cè)定的上清液牛血清白蛋白的吸光度值換算成濃度。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 13 : of 圖 7凝膠小球?qū)τ谂Ｑ灏椎鞍椎臐B透曲線 . 凝膠小球?qū)τ诜肿恿繛?67牛血清白蛋白分子的通透性的實(shí)驗(yàn)表明，牛血清白蛋白的溶液的濃度始終維持在 間，幾乎沒(méi)有變化，表明凝膠小球?qū)τ诜肿恿?67 論 在以往的研究中，通過(guò)海藻酸鈉和氯化鈣反應(yīng)生成的藻酸鹽凝膠小球，小球的強(qiáng)度不高，易破碎，不利于海藻酸鹽水凝膠在組織工程中的應(yīng)用 31，同時(shí) 等研究發(fā)現(xiàn)基底剛度可以影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，所以長(zhǎng)期以來(lái)人們一直在探索對(duì)海藻酸鈉水凝膠的改性，構(gòu)建一種強(qiáng)度更大的海藻酸鹽水凝膠。但是在以往的改性中，強(qiáng)度的增 加一般都是通過(guò)增加交聯(lián)密度來(lái)實(shí)現(xiàn)，這樣就會(huì)帶來(lái)凝膠小球滲透性的下降 1。在組織工程中作為包埋細(xì)胞的材料，凝膠小球的滲透性是影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入和細(xì)胞代謝產(chǎn)物排出的重要物理參數(shù)。目前國(guó)際上通常使用截留相對(duì)分子質(zhì)量作為凝膠滲透性的表征，截留相對(duì)分子質(zhì)量反應(yīng)了凝膠對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量溶質(zhì)的通透能力 40在本實(shí)驗(yàn)中用相對(duì)分子質(zhì)量較大的牛血清白蛋白和相對(duì)分子質(zhì)量較小的胰蛋白酶兩種蛋白考察凝膠的滲透性。本實(shí)驗(yàn)研究得出， 5： 5組凝膠小球的強(qiáng)度比對(duì)照組有了顯著的提高，同時(shí)對(duì)于胰蛋白酶的滲透性 也比對(duì)照組好，對(duì)于分子量較大的牛血清白蛋白與對(duì)照組一樣具有截留作用。由于生長(zhǎng)因子如白細(xì)胞介素類(lèi)、表皮生長(zhǎng)因子類(lèi)等生物活性分子的分子量均在蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 14 20下，而免疫大分子如 分子量均在 100上，所以該方法制作的小球可以滿足小球內(nèi)細(xì)胞對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要和分泌物的釋放，并且可以起到對(duì)免疫大分子的屏障作用。所以應(yīng)用 5： 5作為混合陽(yáng)離子交聯(lián)劑與甲基丙烯酸藻酸鹽作用生成的凝膠小球，有希望成為一種更好的體外三維培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)移植物包埋的支架材料。但是，本實(shí)驗(yàn)中采用熱反應(yīng)（加熱到 80）來(lái)達(dá)到雙鍵的斷裂聚合，在實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)受到限制，已有國(guó)外的研究資料表明 5，熱反應(yīng)使雙鍵斷裂聚合的反應(yīng)可以在光反應(yīng)條件下同樣進(jìn)行，光反應(yīng)過(guò)程中可以用循環(huán)水冷卻的方法，這樣就可以控制溫度維持在常溫不變，使這種材料成為理想的組織工程材料變?yōu)榭赡堋?蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 15 第二部分 兔膝關(guān) 節(jié)軟骨細(xì)胞的體外單層培養(yǎng)以及包有軟骨細(xì)胞的藻酸鹽凝膠小球的構(gòu)建 軟骨是由軟骨細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成的，在體內(nèi)分布在關(guān)節(jié)表面的軟骨叫做關(guān)節(jié)軟骨，在臨床中，關(guān)節(jié)軟骨的損傷是十分常見(jiàn)的一種疾病，一旦軟骨損傷，便會(huì)影響關(guān)節(jié)的 活動(dòng)，給人們的正常生活帶來(lái)極大的影響。所以一直以來(lái)，對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)，都是一個(gè)重要的研究課題。近年來(lái)，由于組織工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，用組織工程方法來(lái)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，被人們所認(rèn)識(shí)到，并且取得了一定的成效，向人們展示出了廣闊的前景。組織工程的研究?jī)?nèi)容一般都包括三個(gè)方面即種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞生長(zhǎng)的外環(huán)境。作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞，自體軟骨細(xì)胞是最理想的，但是由于取材受限，增殖能力差，體外培養(yǎng)時(shí)容易發(fā)生去分化而失去原來(lái)的表型，使軟骨組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源受到限制。 近年來(lái)，隨著三維（ 3D）培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù) 的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，三維培養(yǎng)可以模擬軟骨細(xì)胞的天然生長(zhǎng)環(huán)境，有效的維持軟骨細(xì)胞的表型，并且可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，讓人們看到了在體外大量獲得自體軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞的可能，本實(shí)驗(yàn)就是想在體外應(yīng)用三維培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、活性、表型為軟骨組織工程的研究提供一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 16 實(shí)驗(yàn)一 兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)及鑒定 軟骨細(xì)胞的原代分離，培養(yǎng)是一項(xiàng)基本成熟的技術(shù)，早在 1967年，3等就用通過(guò)胰酶和型膠原酶消化關(guān)節(jié)軟骨的方法，成功的把軟骨細(xì)胞從堅(jiān)韌的細(xì) 胞外基質(zhì)中分離出來(lái)。此后，又有很多學(xué)者成功的在體外培養(yǎng)了動(dòng)物和人的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，對(duì)軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，形態(tài)，增殖等做了詳細(xì)的研究。 要試劑 高糖 劑型）（ 司 ,美國(guó)）；胎牛血清 (國(guó) ,胎牛血清（ 國(guó) 杭州四季青公司）；胎牛血清（ 美 國(guó) 國(guó) 司）；胰蛋白酶（美國(guó) 司）；型膠原酶（美國(guó) 司） ；型膠原酶（美國(guó) 司）； 6孔 /24 孔 /96 孔板（ 國(guó)）；二甲基亞砜（ 京，亞太精細(xì)化工）；兔型膠原多克隆抗體（ 漢 博奧森公司）；羊抗兔 杉金橋，北京）； 杉金橋 北京）；甲苯胺藍(lán)（美國(guó) 司）； 4%的多聚甲醛（索萊寶）。 要儀器 倒置相差顯微鏡（日本 州凈化設(shè)備廠）；溫孵育箱（德國(guó) 離心機(jī)（上海安亨 科學(xué)儀器廠）；烘干箱（德國(guó) 高溫高壓滅菌器（山東新華醫(yī)療器械司）；恒溫?fù)u床（美國(guó) 要溶液配制 1）高糖 將袋裝干粉型 入 1000燒杯中加入磁力攪拌棒，并置于恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?4h，攪拌快結(jié)束時(shí)，整 到 右。準(zhǔn)備消毒好的無(wú)菌金屬濾器（ 膜已經(jīng)提前安裝好，并和濾器一起消毒），放入無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)。準(zhǔn)備 4 個(gè)消毒好的 250超凈臺(tái)內(nèi)安裝過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。裝瓶后用封口膜及膠布密封口徑，放入 4冰箱，備用。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 17 2） 用電子天平稱(chēng)取 12入 1000燒杯中，加入 1000餾水，放入磁子，在磁力攪拌器上設(shè)置中速攪拌約 1h 至完全溶解，分裝于 4 個(gè) 250上針頭，滅菌消毒，消毒完畢后，待溫度降至室溫后， 4冰箱保存?zhèn)溆谩?3） 稱(chēng)取 12 入 1000燒杯中，加入 1000餾水，放入磁子，在磁力攪拌器上設(shè)置中速攪拌約 1h 至完全溶解，分裝于 4 個(gè) 250清瓶，插上針頭，滅菌消毒，消毒完畢后，待溫度降至室溫后， 4冰箱保存?zhèn)溆谩?4） 胰蛋白酶： 稱(chēng)取胰蛋白酶粉末 入 200杯中，先用少許 胰酶粉調(diào)制糊狀，在定容至 100拌混勻，在超凈臺(tái)內(nèi)過(guò)濾除菌，分裝置小青瓶中于 存?zhèn)溆谩?5） 取一個(gè)消毒好的 100入 90菌 加入 10酶，混勻， 4冰箱保存?zhèn)溆谩?6） 稱(chēng)取 入 200杯中，用100無(wú)菌超凈臺(tái)，過(guò)濾除菌， 冰箱保存?zhèn)溆谩?7）雙抗（青鏈霉素）： 在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，用 5射器加 4理鹽水于青霉素（ 80 萬(wàn)單位 /瓶）混勻，在用 5射器加 5理鹽水于鏈霉素（ 100萬(wàn)單位 /瓶）中，混勻，然后棄去 1 8濾器過(guò)濾至已消毒的小青瓶中， 存?zhèn)溆谩?8） 1g/L型膠原酶： 100膠原酶溶于 100 5%胎牛血清的高糖 ，磁力攪拌至完全溶解， 膜過(guò)濾除菌，分裝至小青瓶，存?zhèn)溆谩?9）胎牛血清的分裝： 將新買(mǎi)來(lái)的胎牛血清放入 4冰箱過(guò)夜，第二天完全化開(kāi)后，在無(wú)菌超凈臺(tái)上，分裝置小青瓶中， 存?zhèn)溆?。?duì)于小牛血清，還需要滅活其中的補(bǔ)體，將化開(kāi)的小牛血清放入 56恒溫水浴箱中，每 5分鐘搖晃一次，總滅活時(shí)間為 30活后的處理同胎牛血清。 10)冰醋酸液： 00配現(xiàn)用。 11） 液： 稱(chēng)取 末，溶于 20濾除菌后，分裝于小青瓶中， 4冰箱保存?zhèn)溆谩?12）甲苯胺藍(lán)染液： 稱(chēng)取甲苯胺藍(lán)顆粒 00后加入三蒸水，定容至 50光放在磁力攪拌器上低速攪拌，至完全溶解，蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 18 現(xiàn)配現(xiàn)用。 13）兔型膠原多克隆抗體 (一抗 )： 體中加入 100溫解凍 10加入 100裝至 10個(gè)小的 管 20用。 14）細(xì)胞凍存液： 在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，按照 ： 4:1的比例，配制凍存液，現(xiàn)配現(xiàn)用。 15）完全培養(yǎng)液： 在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，準(zhǔn)備一個(gè)已消毒的 100清瓶，加入 90101抗、 1氨酰胺， 2勻， 4冰箱保存?zhèn)溆谩?驗(yàn)方法 驗(yàn)動(dòng)物 出生后 1 月齡的日本大耳白 兔 （圖 8 見(jiàn)附錄一 ）（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸類(lèi)研究所提供） 子膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、消化、傳代 1）對(duì)實(shí)驗(yàn)所要用到的器械進(jìn)行消毒，包括刻、尖吸，離心管及蓋子，錐形瓶，燒杯，一個(gè)手術(shù)器械盒（咬骨鉗，大小剪刀 ，大小鑷子，手術(shù)刀及刀片，持針器），玻璃培養(yǎng)皿。 2）耳緣靜脈栓塞法處死兔子，在 75%的工業(yè)酒精中浸泡 1h 消毒，提前準(zhǔn)備好無(wú)菌操作臺(tái)的消毒，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)對(duì)兔子進(jìn)行膝關(guān)節(jié)的解剖，游離出雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，放入無(wú)菌燒杯中，燒杯中注入含雙抗的 沒(méi)膝關(guān)節(jié)，然后收拾超凈工作臺(tái)，把分離好的膝關(guān)節(jié)帶入無(wú)菌間，在無(wú)菌間的超凈臺(tái)上進(jìn)行軟骨細(xì)胞的分離。 3）在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，先對(duì)游離出的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行一些修理，使關(guān)節(jié)表面完全暴露，然后用 12#手術(shù)刀片，從膝關(guān)節(jié)軟骨表面，把軟骨層輕輕取下來(lái)，放入提前準(zhǔn)備好的六孔板的一個(gè)孔中，孔里面注 滿含雙抗的 骨細(xì)胞取完后，用含雙抗的 洗 3 遍（圖 9 見(jiàn)附錄一 ），用眼科鑷轉(zhuǎn)移至 50菌消毒的小燒杯中，滴入一兩滴 后用眼科剪剪碎至 1入胰蛋白酶，進(jìn)行消化 30化期間用玻璃棒攪拌，幫助消化。胰蛋白酶消化完成后，用尖吸吸掉胰蛋白酶，加入型膠原酶，視軟骨的量，加入 10移至錐形瓶，放入恒溫?fù)u床中， 37， 86r/化 6h。 4）消化完成后，在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，用 80目金屬濾網(wǎng)過(guò)濾消化液至一個(gè)蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 19 已消毒的六孔板中，過(guò)濾完成后，把消化液轉(zhuǎn)移至 101000r/心 5上清，加入 800r/上清，加入 5右的完全培養(yǎng)液，吹打成單細(xì)胞懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照1*105/濃度接種于 50次性塑料培養(yǎng)瓶中，放入飽和濕度、 5%37恒溫孵育箱中培養(yǎng)，視細(xì)胞生長(zhǎng)狀況， 72 5）原代軟骨細(xì)胞大約一周可以長(zhǎng)滿瓶壁的 80%然后用 酶消化， 消化時(shí)間兩分鐘左右，在顯微鏡下觀察細(xì)胞之間分開(kāi)，變成圓形，代表消化到位，然后倒掉消化液，加入完全培養(yǎng)液，把瓶壁上的細(xì)胞都吹打下來(lái)，吹打要用力均勻，盡量不要產(chǎn)生氣泡，吹 打 成單細(xì)胞懸液后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照 1*105/ 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 1）凍存一般都選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，凍存前一天全量換液，凍存時(shí)用 酶把細(xì)胞消化下來(lái)，加入完培終止消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后放入離心管中， 1000r/上清液，根據(jù)細(xì)胞的量 ,按照細(xì)胞 密度為 5*10607/入凍存液，吹打成單細(xì)胞懸液 ， 分裝于無(wú)菌凍存管中，每只凍存管加入的量不要超過(guò)一半的容積，擰緊管口，封口膜封閉，白膠布封口，包上棉花，放入 4冰箱 1h， 箱 1h，然后放入 箱保存，凍存管和棉花上都應(yīng)做好標(biāo)記，標(biāo)明細(xì)胞的代數(shù)，凍存時(shí)間等，一般凍存時(shí)間不能超過(guò)三個(gè)月，否則對(duì)細(xì)胞的活性會(huì)有影響。 2）復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，于 箱取出凍存管，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，放入提前準(zhǔn)備好的 37水浴中，輕輕搖動(dòng)，以便速溶。溶解后，去除棉花，用酒精擦拭管壁，吸出細(xì)胞懸液到離心管中，然后 加入 10 倍體積的完培， 800r/上清，加入完全培養(yǎng)液，吹打成單細(xì)胞懸液，分裝于 50胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，因凍存對(duì)細(xì)胞的活性有一定的影響，復(fù)蘇后的細(xì)胞濃度應(yīng)該大于正常培養(yǎng)的細(xì)胞濃度。次日觀察細(xì)胞狀態(tài)，視情況換液。 骨細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色鑒定和免疫組化染色鑒定 細(xì)胞的準(zhǔn)備和固定： 取 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的軟骨細(xì)胞，用 酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，以 2*104/濃度接種于預(yù)先放置了 4 個(gè)222玻片的六孔板中，放入孵育箱中培養(yǎng)兩天，待細(xì)胞鋪滿蓋玻片60%， 取出蓋玻片 4%多聚甲醛固定 30 甲苯胺藍(lán)染色： 1) 漂洗：流水輕輕漂洗固定的細(xì)胞爬片 5 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 20 2）染色：細(xì)胞爬片漂洗完成后，不要太干，放入甲苯胺藍(lán)染液中，染色 30水輕輕沖洗， 去除 多余的染液。 3） 分化： 入冰醋酸液分化至胞核和顆粒清晰或者切片逐一進(jìn)入75%95%的乙醇溶液，各 5入無(wú)水乙醇兩次，每次 1 4）流水沖洗。 5）透明：過(guò)二甲苯溶液兩次，每次 1 6) 封片：從二甲苯中取出爬片后，在載玻片上滴加適量的中性樹(shù)膠（ 1把爬片輕輕的由一端到 另 一端 放下，注意排氣泡，放好后，就不要?jiǎng)恿恕?7）鏡下觀察細(xì)胞的染色情況，照相。 免疫組化染色： 1) 漂洗：流水輕輕漂洗固定的細(xì)胞爬片 5 2） 3%雙氧水室溫孵育 30處內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。 3）滴加封閉血清工作液，室溫孵育 15 除 血清，勿洗。 4）在以上處理的細(xì)胞爬片上，滴加兔型膠原多克隆抗體（按照 1:50的比例用 4過(guò)夜。 5） 次三分鐘。 6)滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔 37孵育 15 7） 次三分鐘。 8） 顯色 2現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存） 9）自來(lái)水充分沖洗。 10）脫水：切片逐一進(jìn)入 75%95%的乙醇溶液，各 5入無(wú)水乙醇兩次，每次 1 11）二甲苯透明和中性樹(shù)脂封片同甲苯胺藍(lán)染色。 果 代軟骨細(xì)胞及 軟骨細(xì)胞的倒置顯微鏡觀察 貼壁的軟骨細(xì)胞呈多角形或者短梭形，細(xì)胞核為圓形或者橢圓形，細(xì)胞核及核仁清晰可見(jiàn)，位于細(xì)胞中心（圖 10見(jiàn)附錄一 ）。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)后，密度增加，整體看去呈不規(guī)則的“鋪路石”樣（圖11 見(jiàn)附錄一 ）。細(xì)胞由原代 傳至 后，大約 5h 左右完成貼壁，第二天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，一到兩天既可以長(zhǎng)滿整個(gè)瓶壁，傳至 以后，細(xì)胞形態(tài)蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 21 發(fā)生一定的改變，變大，不規(guī)則，繼續(xù)傳代至 以后，細(xì)胞較稀時(shí)，形態(tài)如灑落地面的雞蛋清。 骨細(xì)胞的鑒定 細(xì)胞爬片的甲苯胺藍(lán)染色：糖胺聚糖為酸性物質(zhì)用甲苯胺藍(lán)等堿性染料染色后，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)紫色異染顆粒，表明細(xì)胞分泌大量的氨基多糖，此種染色對(duì)軟骨細(xì)胞特異性不強(qiáng)（圖 12 見(jiàn)附錄一 ）。 細(xì)胞爬片的型膠原免疫組化染色 ：可見(jiàn) 胞漿著色，呈棕黃色，表明有型膠分