【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）DEFB-1基因多態(tài)性與甘肅裕固族人群齲病易感性的關(guān)聯(lián)性研究

第一章 前言 1 齲病 病概述 齲病 是 口腔中多種因素復(fù)合作用導(dǎo)致的牙齒硬組織 慢性 進行性病損 1， 臨床主要 表現(xiàn)為 牙體硬組織中 無機質(zhì)的脫礦 及 有機質(zhì)的分解，隨著 齲病 病程發(fā)展 ，牙體硬組織發(fā)生從 色澤變化到形成實質(zhì)性病損 。齲病不僅 可以 導(dǎo)致口頜系統(tǒng)功能障礙 ，而且是多種全身性疾病的危險因素，如 消化系統(tǒng)疾病 、 心血管疾病、過敏性紫癜腎損害 等 2。 齲病列為僅次于心血管病、癌癥之后的第三大非傳染性重點防治疾病，并提出 “ 在未來 10 年應(yīng)重點加強對影響人群范圍最大且嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的齲病及其后遺癥方面的研 究” 3。 全 國口腔第三次健康流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國 5歲兒童乳牙齲病患病率為 12歲兒童恒牙齲病患病率為 中老年人齲病患病率達 80%以上 4。由此可見，我國的齲病防治任務(wù)非常艱巨 。如不采取有效的預(yù)防和治療措施， 齲病 將嚴(yán)重影響人類的健康。 病的致病因素 齲病是人類最普遍最嚴(yán)重的口腔感染性疾病，針對齲病的病因?qū)W研究、風(fēng)險評估乃至預(yù)防策略是目前研究的重點問題。齲病四聯(lián)因素學(xué)說認為細菌、宿主、環(huán)境、時間均是齲病發(fā)生的必要條件。 菌斑和致齲細菌 牙菌斑是附著在牙齒表面 軟而 未礦化的細菌沉積 物的膜樣物質(zhì)，即牙表面的生物膜。 目前新興“生態(tài)菌斑假說” 5， 6 認為菌斑是一個整體，應(yīng)整體看待其生物學(xué)行為，即 “致齲性”的細菌不 只是 變 異 鏈球菌 (S. 而是種類豐富的一群細菌，這些細菌是口腔正常菌群，它們通過復(fù)雜的相互作用使牙體硬組織維持整體的脫礦與再礦化水平；當(dāng)口腔內(nèi)環(huán)境因素發(fā)生改變，菌斑內(nèi)菌群或者基因成分發(fā)生改變向脫礦水平傾斜，不斷的惡性循環(huán)使脫礦過程持續(xù)進行進而使牙體硬組織發(fā)生齲壞。 7 等采用 16S 隆文庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)含有變形 鏈球菌的齲病易感個體，其他菌屬諸如奇異菌屬 (丙酸菌屬 (及乳酸菌屬 (常以更高比例存在；在沒有檢測到變形鏈球菌屬的齲病易感個體，乳酸菌屬、雙歧桿菌屬 （ 以及低 的非變形鏈球菌屬則是優(yōu)勢菌屬；因此， 為患齲易感個體口腔內(nèi)除變形鏈球菌之外，韋榮菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸菌屬、低 非變形鏈球菌屬、放線菌屬以及奇異菌屬都與齲病的發(fā)生發(fā)展有著顯著相關(guān)性。 食因素 在齲 病的發(fā)病過程中，飲食因素至關(guān)重要， 目前通過流行病學(xué)研究及實驗室研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖是高致齲性食物，隨著攝糖量的增加，人群患齲的風(fēng)險也隨之 增加 8 。 糖類可 作為細菌代謝的底物 ， 在代謝過程中為細菌生存提供營養(yǎng)，其終末酸性 產(chǎn)物又可造成 牙體硬組織的進行性 破壞 9 。 用葡萄糖沖擊實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)口內(nèi) 下降時，變形鏈球菌和乳酸桿菌 （ 較之前分別增加了 19 和 180 倍，并且抑制了其他非致齲菌的生長和代謝 10 。 研究發(fā)現(xiàn)，隨著口腔內(nèi)蔗糖攝 入的增多，細菌生物膜可以生成更多的 胞外多糖，牙釉質(zhì)脫礦程度也隨著口腔內(nèi) 的下降而 增強 11 。雖然近年關(guān)于牙菌斑生物膜形成與飲食因素相關(guān)機制的研究越來越多，但迄今尚未闡明蔗糖與生物膜胞外多糖增多而導(dǎo)致牙體硬組織脫礦的確切機制。 主因素 目前大多數(shù)學(xué)者認為，齲病 的發(fā)生發(fā)展 不僅 受 致齲菌、食物的性質(zhì)及食物停留在口內(nèi)的時間 等因素的影響 ，宿主的遺傳易感性也是齲病發(fā)生的重要因素 。 齲病的 易感性存在個體差異， 即宿主個體間遺傳基因的差異和環(huán)境的差異，其患齲病的風(fēng)險程度不同 ，齲病 易感性亦不相同 。 唾液的成分和功能 的改變 與齲病 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān) 。唾 液是牙齒的外環(huán)境，唾液的分泌量、成分，緩沖能力及抗菌系統(tǒng)都與齲病發(fā)生過程有著密切的關(guān)系。唾液對維持口腔正常 持牙面完整性和促進已脫礦牙硬組織的再礦化方面有重要的影響 ，唾液的理化性質(zhì)及唾液的功能成分 能抵御殺滅唾液或菌斑內(nèi)致齲微生物， 其中唾液中最有意義的成分是蛋白質(zhì)如黏蛋白、抗菌蛋白、抗菌肽等 ，它們 影響 著 齲病 的 發(fā)生發(fā)展 。 這是因為作為牙齒的外環(huán)境，唾液的理化性質(zhì)及唾液的功能成分存在宿主個體間的差異，而這些差異可能導(dǎo)致了宿主齲病易感性的不同。 因此宿主的易感因素成為當(dāng)前研究熱點，多數(shù)學(xué)者認為 遺傳因素是齲病發(fā)生發(fā) 展的重要因素 12， 遺傳因素在個體患齲風(fēng)險因素中高達 4013。 間 齲病 發(fā)生 的每一 階段均 需要一定的時間才能完成。從牙面上清除所有附著物到獲得性膜開始產(chǎn)生；從獲得性膜附著到菌斑形成；從致齲菌代謝碳水化合物產(chǎn)酸到釉質(zhì)脫礦等過程均需要一定時間。同時時間因素還包括牙齒萌出之后的時間和碳水化合物滯留于牙面的時間。不論哪種情況，時間因素都和其他三大因素有聯(lián)系。 病易感基因的研究 單核苷酸多態(tài)性（ 研究遺傳變異應(yīng)用最 廣泛的一種， 是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的 列多態(tài)性 ，在任何已知或未知基因內(nèi)和附近都可能找到 具有密度高、遺傳穩(wěn)定性好、應(yīng)用范圍廣和易實現(xiàn)自動化分析等特點，是研究相關(guān)易感基因的新一代遺傳標(biāo)記。 H 等 14首次應(yīng)用齲病雙生子研究調(diào)查 171對異卵雙胞胎和 130 對同卵雙胞胎的齲病發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)同卵雙胞胎的齲病發(fā)生情況更為相似，因此，該學(xué)者認為齲病的發(fā)生與遺傳 因素 密切相關(guān)。之后亦有學(xué)者證實了H 的研究 15， 16，但由于實驗樣本量較少，齲病雙生子研 究齲病易感人群遺傳因素存在較大局限性。隨著現(xiàn)代科技的不斷進步，基因組學(xué)和基因檢測技術(shù)的深入發(fā)展，易感基因多態(tài)性的研究已經(jīng)成為探究齲病宿主遺傳因素的重要手段。因此，利用 選齲病相關(guān)易感基因，可以更好地理解齲病發(fā)生發(fā)展的機制，從而為齲病的早期預(yù)防、診斷和治療提供重要的 依據(jù) 。 白細胞抗原系統(tǒng)（ 人白細胞抗原系統(tǒng)（ 位于號染色體的短臂，片段大小為 3500有數(shù)十個基因座；其中 齲病易感基因，抗原與變形鏈球菌的定植、粘附相關(guān) 17， 18； 1302 分別與唾液中乳酸桿菌和鏈球菌數(shù)量相關(guān)，提示其可能為齲病易感基因 19。但也有學(xué)者報道上述基因在不同人種間與齲病的關(guān)聯(lián)性有差異20，提示我們 齲病易感基因位點可能與種族及 異性相關(guān)。 生素 D 受體基因 （ 維生素 D 受體 （ 親核蛋白，是介導(dǎo) 1， 25(D 發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，屬于類固醇激素 /甲狀腺激素受體超家族成員 。 參與 因的轉(zhuǎn)錄與調(diào)節(jié)，與唾液中鈣磷離子濃度、牙體硬組織的鈣化程度密切相關(guān)。 李志強等 通過對甘肅特有少數(shù)民族東鄉(xiāng)族、裕固族和保安族的 因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn) t 基因型個體其患齲風(fēng)險顯著增高 21；張良等通過檢測長春地區(qū)兒童齲病患者 因多態(tài)性，亦證實其基因型在病例組與對照組有顯著差異，并與齲病發(fā)展程度成正相關(guān) 22。 質(zhì)形成蛋白基因 (牙釉質(zhì)是口腔內(nèi)高度礦化的牙 體最堅硬部分，由 95機物（主要為含鈣和磷的磷灰石晶體）組成，其 它 為水及有機物。 齲病的發(fā)生首先是從牙釉質(zhì)開始，目前多數(shù)學(xué)者認為編碼釉質(zhì)形成的蛋白異常可使患齲風(fēng)險增高。 報道證實成釉蛋白基因（ C/T）基因多態(tài)性與齲病嚴(yán)重程度顯著關(guān)聯(lián)（ 1， P= 5， P=15， P=20，P=23;其他一些學(xué)者研究亦證實 因位點 齲 病易感性顯著相關(guān) 24， 25。 防御素 1 基因多態(tài)性與齲病的關(guān)系 抗菌肽 （ 是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在 2000 7000 左右，由 20 60 個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點。 防御素是抗菌肽家族中的一個重要組成部分，其廣泛存在于自然界有機生物體內(nèi)，其主要由消化道、呼吸道口腔粘膜上皮及免疫細胞產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)人類防御素對革蘭氏陽性、陰性細菌、真菌、支原體、衣原體及腫瘤細胞等都具有 高效而廣泛的殺傷作用；當(dāng)病原微生物侵入機體后，防御素可以更快更有效的殺滅微生物，其速度是 100 多倍 26。上世紀(jì) 80 年代 次從家兔巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)防御素，此后又在不同物種間發(fā)現(xiàn)了 20 余種相似結(jié)構(gòu)，其蛋白結(jié)構(gòu)中均富含半胱氨酸形成的二硫鍵，所以統(tǒng)稱為防御素 27。根據(jù)二硫鍵的結(jié)構(gòu)和位置，防御素又可以分為 3 種： 防御素，人類主要分布的防御素是 （ ， 具有廣譜抗菌 的特點 ， 在生物體和環(huán)境之間形成第一道防御線。 研究發(fā)現(xiàn) 表 達 水平可能與齲齒、牙周炎 和 口腔鱗癌 相關(guān) 28， 29 ， 因編碼序列的不同可影響 其 表達與調(diào)控 。與其他抗菌肽作用于病原微生物體內(nèi)酶不同的是防御素主要作用于病原微生物的細胞膜，因此其不易產(chǎn)生抗藥性，迄今尚未發(fā)現(xiàn)微生物對其有抗藥性 30。因此，防御素在機體天然免疫中具有重要的意義，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的多肽。 防御素 1 的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性 防御素是 1980 年 次從兔肺巨噬細胞中發(fā)現(xiàn) ， 其后又從兔和人的中性粒細 胞胞漿顆粒中分離出 ， 是一類富含半胱胺酸、精氨酸的陽離子抗微生物多肽 ， 分子量較小 (103)， 6 個保守的半胱胺酸殘基形成三個分子內(nèi)二硫鍵 ，使肽鏈折疊成三束 子內(nèi)二硫鍵對維持防御素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用 ， 是防御素抗微生物活性和細胞毒效應(yīng)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 成熟的 含 3650 個氨基酸殘基 ，其中 6 個半胱氨酸殘基 (23獨特的空間模式形成二硫鍵 ， 與 在多肽核內(nèi)引入環(huán)狀共價鏈。根據(jù) 收錄的數(shù)據(jù)資料 ， 原肽 (前體 )一般由64200 個氨基酸殘基組成。 體的結(jié)構(gòu)比較簡單 ， 包括信號序列、短的 (或者無 )原片段、 31。與 32。已知的防御素中 ， 僅 有 11 個氨基酸殘基的原片段 。 級結(jié)構(gòu) 是由 3 對二硫鍵形成 3 股 發(fā)夾環(huán) ， 在 螺旋。緊鄰 螺旋區(qū)段的包裹主要由 間的二硫鍵驅(qū)使形成。已經(jīng)清楚 ,由于結(jié)構(gòu)上細微的差異 ,特別是 分子表面的性質(zhì) ,決定了功能的特異性。通過這些多肽的生物學(xué)活性所共有的結(jié)構(gòu)折疊推測 ,它與對應(yīng)的受體發(fā)生相互作用時要達到的最佳尺寸、形狀很重要 33。 三級結(jié)構(gòu) 雖然和 防御素 在 列或二硫鍵拓撲結(jié)構(gòu)并不相同 ,但它們具有相似的三級結(jié)構(gòu) ,并表現(xiàn)出共同的性質(zhì) ,如抗微生物活性 34。 在整個結(jié)構(gòu)中 ,子中心含有一個共同的 (類防御素 )拓撲折疊。這種折疊的原型是人 3 的結(jié)構(gòu)。 子內(nèi)含 3 個反向平行的 由 3 個分子內(nèi)二硫鍵連接。在 , 螺旋片段連接 ,形成分子 片層的連接位點是通過二硫鍵來穩(wěn)定的 (35， 36。 四級結(jié)構(gòu) 有 形成多種低聚結(jié)構(gòu) (潛能 ,這些低聚結(jié)構(gòu)影響著防御素蛋白的生物學(xué)活性和功能。 本質(zhì)為特異性蛋白，這種蛋白的 形成歸功于 4 個非共價二聚體 ,每個單體的第一條 種二聚體與以前提到的 37。 因序列中無 和 號通路，故其不因炎癥 因子 的表達而上調(diào)，而是在上皮組織中生理性表達 38，構(gòu)成了人體第一道機體免疫防御屏障。 傷的細菌譜很廣，包括 伴放線放線桿菌、 牙齦卟啉單胞菌、鏈球菌、乳酸桿菌、 金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、大腸桿菌、綠膿假單胞桿菌和嗜血流桿菌 等 ，而且可在幾分鐘內(nèi)見效 39。多數(shù)學(xué)者認為 菌 作用機制 是：當(dāng)致病微生物被 吞噬細胞 吞噬 后， 含有高濃度 胞質(zhì)顆粒 與 病原微生物細 胞膜融合，將 放至細菌 胞膜 周圍， 以插入 病原微生物細 胞壁， 并使其形成孔洞 ， 最終病原微生物因細胞壁破裂而死亡。 抗菌肽除了損傷細菌胞壁， 還 可抑制胞內(nèi) 發(fā)抗菌酶 ； 抗菌肽還可以 殺 真菌菌體和由脂蛋白包被的病毒如流感病毒和單純皰疹病毒 ，但其具體機制 尚 不清楚 35,38。 其可能抗菌機制過程為： A 白 結(jié)構(gòu)； E 病原微生物被吞噬細胞吞噬后 ， 含有 高濃度 質(zhì)顆粒被 釋放到 胞 外 四周 ， 與 微生物 直接接觸，并行使功能； C 雙極分子， 如圖 1 所示：帶正 電的氨基酸側(cè)鏈 (紅色 )和 負電 的氨基酸側(cè)鏈 (綠色 )， 通過 膜電場作用進入 病原微生物胞 質(zhì)膜 ；而 后合 ,發(fā)生蛋白質(zhì)構(gòu)架改變 ，使 病原微生物胞 質(zhì)膜張力下降， 從而 形成孔洞， 最終病原微生物細胞壁破裂 （圖 1） 40。 防御素 1 與口腔疾病的關(guān)系 口腔黏膜持續(xù)受到各種細菌微生物的挑戰(zhàn)、理化因素的刺激而不被感染 ,除了傳統(tǒng)觀念認為黏膜上皮機械屏障、宿主的獲得性免疫系統(tǒng)、正常菌群對致病菌或機會致病菌的制約作用等以外 ,還與機體產(chǎn)生的抗微生物多肽和蛋白密切相關(guān)?？谇簧掀ぬ峁┝丝谇唤M織與環(huán)境之間的第一道防線 ,上皮組織表達的 類中性粒細胞中的 與其它防御因素共同作用維護口腔健康。 防御素 、 2、 3 在 口腔組織的 牙齦、 腮腺、口腔黏膜 、舌、 小 唾液腺 等組織中均有廣泛的表達， 而 腸源性防御素 口腔 組織中的含量極少，防御素 前尚無報道 發(fā)現(xiàn) 其在口腔中存在的證據(jù) 41 尤其是防御素 1、 2 以及防御素 們在齦溝液、唾液中的濃度較高，其可與唾液、齦溝液中的其他蛋白成分（凝集素、黏蛋白、 性富脯蛋白、唾液免疫球蛋白等）協(xié)同作用維護口腔組織的健康，抵御病原微生物的入侵，共同構(gòu)成了口腔粘膜屏障的第一道防線 47， 48。通過體 外培養(yǎng)口腔牙齦角化上皮細胞，在感染狀態(tài)和正常狀態(tài)下防御素 表達水平始終呈現(xiàn)生理性分泌而與炎癥的程度無關(guān)；防御素 3 則有免疫趨化活性，可在炎癥因子（腫瘤壞死因子、核梭桿菌、螺旋體、白介素 1 等）誘導(dǎo)下其大量表達并向病灶部位聚集 49。由于 防御素 于生理分泌性抗菌肽，其嚴(yán)重依賴口腔粘膜上皮角化細胞的正常分化功能，細 胞內(nèi)鈣離 ，即 上皮分化的調(diào)節(jié)因子是 防御素 理性表達的關(guān)鍵介質(zhì)，檢測發(fā)現(xiàn) 防御素 要分布在牙齦角化上皮的基底上層細胞（ 表皮層則檢測到 防御素 成熟肽片段 50， 51。 研究發(fā)現(xiàn) 口 腔鱗癌組織 中存在 防御素 其濃度遠高于正常組織 52。 人 亦證實了上述報道，他們還發(fā)現(xiàn)防御素 1 表達水平高的鱗癌患者其預(yù)后較好，表達水平低的患者其鱗癌易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移 53。白色念珠菌病是口腔常見的疾病之一，有報道指出口腔癌前黏膜病變，如 口腔扁平苔蘚、白斑、白 色念珠菌感染等患者口腔病變組織中防御素 防御素 達水平顯著高于正常組織 54， 55。 29 對唾液 度與齲病關(guān)系的研究顯示，唾液 度與個體患齲風(fēng)險成負相關(guān)。這提示 防止齲病的發(fā)生有著重要的作用。目前， 菌防齲機制的研究尚不明確，國外關(guān)于因多態(tài)性與齲病關(guān)聯(lián)性的研究 尚處于初步階段 56，國內(nèi)尚未見 報道 。 肅特有少數(shù)民族裕固族與齲病的關(guān)系 本 研究 前期 研究發(fā)現(xiàn)： 裕固族除個別年齡段口腔疾病患病率略好于全國及西部水平外，其余狀況均與全國及西部有明顯差異，發(fā)病率較高 21。本 實驗 擬通過病例對照研究，旨在分析 甘肅 裕固族和當(dāng)?shù)貪h族人群基因 個單核苷酸多態(tài)性與齲病易感性的關(guān)系。 2 研究內(nèi)容 究基因 究基因 3 研究目的 析基因多態(tài)性與裕固族及漢族人群齲病患病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性 。 分子生物學(xué)角度探索甘肅特有少數(shù)民族裕固族和漢族齲病的遺傳學(xué)原因 。 甘肅特有少數(shù)民族齲病 的早期預(yù)防、診斷及治療提供依據(jù)。 第二章 研究對象與方法 劑盒儀器 主要試劑： 微量 o., 蛋白酶 K（ 盛生物有限公司 ) 瓊脂糖（ 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司 ） 2凝管（ 滄州永康醫(yī)藥用品有限公司 ） 上下游引物（ 北京博淼生物科技有限公司合成 ） 主要儀器： 美國西格諾 。 北京六一 儀器廠 ) 高溫高壓消毒設(shè)備（ 超 低溫冰箱（ 高速低溫離心 機 （ 810R 凝膠成像分析系統(tǒng)（ 顆粒制冰機（ 北京六一 儀器廠 ） 烤箱（ 北京六一 儀器廠） 電子分析天平 (一次性口腔檢查盤 400個（ 深圳市超今貿(mào)易有限公司 ） 低溫冰箱（ 海爾 , 中國海爾集團 ） 液樣本采集 所有 血液 樣本 在 2011年 11月 采集于 甘肅 肅 南裕固族自治縣常 駐漢族及裕固族 人 群高齲 組 164例（漢族 85例，裕固族 79例）； 低齲組 191例 （漢族 86例，裕固族 105例 ） ，年齡 30 本研究得到蘭州大學(xué)以及西北民族大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書 。 受檢者由兩位經(jīng)過標(biāo) 準(zhǔn) 一致性培訓(xùn) 及檢驗 的口腔專業(yè)高級職稱的醫(yī)師（ 按 納入標(biāo)準(zhǔn)：齲病檢查標(biāo)準(zhǔn)按照 行。 排除標(biāo)準(zhǔn)：有牙周病、黏膜病、口腔潰瘍或智齒冠周炎反復(fù)發(fā)作等口腔疾病，妊娠期或哺乳期，有系統(tǒng)性疾病，有嗜煙酒史，取口腔標(biāo)本前 1個月內(nèi)有抗生素使用史。 本分組（見表 1） 表 1 研究對象的一般情況 of 別 例數(shù) 裕固族（男 /女） 漢族（男 /女） 年齡 低齲組 191 86（ 40/46） 105(48/57) 高齲組 164 79(37/42) 85(39/46) 注：經(jīng)過卡方檢驗兩組之間裕固族和漢族比例無顯著性差異（卡方值 =P=男女性別在各組間和組內(nèi)均未見明顯差異（ P 說明民族和性別比例因素對本實驗研究結(jié)果基本沒有直接的影響；兩組之間年齡也基本相近，以盡量減少年齡因素對實驗的影響。 本采集 抽取前臂靜脈血 2超低溫冰箱 保存 。 取 血液 o., 方法提取 物 置 冰箱 備用。 因三個位點 物設(shè)計 點的選擇： （ 1） 結(jié)合文獻確定本實驗 （ 2） 在 站中下載上述候選基因在 用的數(shù)據(jù)庫為7 36 外，分別在候選基因的 5 3端各擴展 5 （ 3） 采用 件對數(shù)據(jù)進行單體型分析，確定基因的 中最終采用的標(biāo)準(zhǔn)為 （ 4） 在 將 點中，在 5中的 果沒有在 出現(xiàn)，則將其取代關(guān)聯(lián) 時將外顯子中的 點 點標(biāo)記出來。 （ 5） 同時，將每一個 基因的位置標(biāo)記出來，根據(jù)所在位置的不同確定每一個位點的重要性，其中 的錯義突變及 5域中的位點最為重要。 （ 6） 息核實：在 將每一個已報道過的 點在 的 及在相應(yīng)基因的位置進行核實。 （ 7）確定 合文獻采用 游引物 : 5- 3,下游引物 : 53； 游引物：5- 3, 下 游 引 物 : 5- 3 ； 上 游 引 物53, 下游引物 : 5- 3；序列由北京博淼生物科技有限公司合 成。 增反應(yīng) 10ng/10 5U/l 25 20上下游引物混合物共 1離子水補足至 494 預(yù)變性 10 4 變性 20s, 起始退火溫度 56 30s， 72 延伸 1.5 45個循環(huán)； 72 延伸5 物經(jīng) 伸反應(yīng)、去鹽等操作后，點樣進行質(zhì)譜分析。 因型測定 采用質(zhì)譜分析法（ 國西格諾 接檢測 個 量控制及統(tǒng)計學(xué)分析 隨機抽取 10樣本進行重復(fù)實驗，結(jié)果一致；基因頻率用 用 2 檢驗計算兩組基因型頻率、優(yōu)勢比（ 95可信區(qū)間（ 95% = 第三章 結(jié)果 1 衡檢測 P 2 因 點基因多態(tài)性分布 因 （ G/A） 位點高齲組和低齲組基因多態(tài)性分布 in rs G/A） 因型 /等位基因 高齲組 低齲組 卡方值 P 5%G 82( 82( - G 56( 84( G/A) 6( 25( 220( 248( - A 108( 134( ：表示 照組） CI(如表 2所示， G/A） 位點基因型頻率在高齲組中的分布為 等位基因的分布頻率為 在低齲組中的分布為 高齲組和低齲組之間的基因型、等位基因的分布頻率統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異 (P 以 齲組 R=5%A 5%50） 以 齲組 5%。 因 （ G/A） 位點高齲組和低齲組基因多態(tài)性分布 in rs G/A） 因型 /等位基因 高齲組 低齲組 卡方值 P 5%G 85( 86( - G 54( 82( G/A) 5( 23( 224( 254( - A 104( 128( ：表示 照組） CI(如表 3所示， G/A） 位點基因型頻率在高齲組中的分布為 等位基因的分布頻率為 在低齲組中的分布為 高齲組和低齲組之間的基因型、等位基因的分布頻率統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異 (P 以 齲組 R=5%A 5% =以 齲組 5%。 因 5743407 G/A 基因多態(tài)性 表 4 G/A） 位點高齲組和低齲組基因多態(tài)性分布 in G/A） 因型 /等位基因 高齲組 低齲組 卡方值 P 5% 87( 96( - G 51( 70( G/A) 6( 25( 225( 262( - A 103( 120( ：表示 照組） CI(如表 4所示， G/A） 位點基因型頻率在高齲組中的分布為 等位基因的分布頻率為 在低齲組中的分 布為 高齲組和低齲組之間的基因型、等位基因的分布頻率統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異 (P 以 齲組 R=5%A 5% =以 齲組 5%。 利用 )函數(shù)描繪 所示 其在高齲組與低齲組均無統(tǒng)計學(xué)差異 。 X 軸 組別 Y 軸 ) 相關(guān)性對照組 2 3 基因 點基因多態(tài)性在裕固族組和漢族組的分布 因 因多態(tài)性在漢族組和裕固族組的分布 表 5 基因 )位點在漢族和裕固族人群基因多態(tài)性分布 in ) in an 民族 /因型 /等位基因 高齲組 低齲組 卡方值 P 5%G 37( 46（ 漢族 3( 42( 32 A 15( 17( 86 (G/A) G 107( 134( A 63( 76( 79 45( 36( 裕固族 3( 42( 57 A 11( 8( 22 (G/A) G 113( 114( A 45( 58( 50 注：表示 照組） n = 例數(shù) R（ CI(按民族分組后，漢族組中基因 )基因型和等位基因頻率分布如表 5所示。圖表結(jié)果顯示基因多態(tài)性分布在高齲組和低齲組中無明顯差異（ P 低齲組中為 低齲組中為 低齲組中占 等位基因頻率分布為高齲組 低齲組 無統(tǒng)計學(xué)差異（ P 裕固族組中基因 )基因型和等位基因頻率分布亦如表 5所示。結(jié)果表明基因 P。 低齲組中為 低齲組中為 5%計學(xué)有顯 著意義（ P 說明攜帶 群患高齲的風(fēng)險降低了了 低齲組中占 等位基因頻率分布為高齲組 低齲組 無統(tǒng)計學(xué)差異（ P 因 因多態(tài)性在漢族組和裕固族組的分布 表 6 基因 )位點在漢族和裕固族人群基因多態(tài)性分布 in ) in an 民族 /因型 /等位基因 高齲組 低齲組 卡方值 P 5%G 37( 47（ 漢族 4( 41( 71 A 14( 17( 95 (G/A) G 108( 135( A 62( 75( 74 48( 39( 裕固族 0( 41( 83 A 11( 6( 90 (G/A) G 116( 119( A 42( 53( 12 注：表示 照組） n = 例數(shù) R（ CI(按民族分組后，漢族組中基因 )基因型和等位基因頻率分布如表 6所示。圖表結(jié)果顯示基因多態(tài)性分布在高 齲組和低齲組中無明顯差異（ P 低齲組中為 低齲組中為 低齲組中占 等位基因頻率分布為高齲組 低齲組 無統(tǒng)計學(xué)差異（ P 裕固族組中基因 )基因型和等位基因頻率分布亦如表 6所示。結(jié)果表明基因 P 。 低齲組中為 基因在高齲組中為 ，低齲組中為 ， 5%計學(xué)有顯著意義（ P 說明攜帶 群患高齲的風(fēng)險降低了了 低齲組中占 等位基因頻率分布為高齲組 低齲組 無統(tǒng)計學(xué)差異（ P 因 因多態(tài) 性在漢族組和裕固族組的分布 表 7 基因 )位點在漢族和裕固族人群基因多態(tài)性分布 in ) in an 民族 /因型 /等位基因 高齲組 低齲組 卡方值 P 5%G 39( 51（ 漢族 1( 37( 65 A 15( 17( 93 (G/A) G 109( 139( A 61( 71( 75 48( 45( 裕固族 0( 33( 31 A 11( 8( 95 (G/A) G 116( 123( A 42( 49( 75 注：表示 照組） n = 例數(shù) R（ CI(按民族分組后，漢族組中基因 )基因型和等位基因頻率分布如表 7所示。圖表結(jié)果顯示基因多態(tài)性分布在高齲組和低齲組中無明顯差異（ P 低齲組中為 低齲組中為 低齲組中占 等位基因頻率分布為高齲組 低齲組 無統(tǒng)計學(xué)差異（ P 裕固族組中基因 )基因型和等位基因頻率分布亦如表 7所示。結(jié)果表明基因多態(tài)性分布在在高齲組和低齲組中無明顯差異（ P 低齲組中為 低齲組中為 低齲組中占 等位基因頻率分布為高齲組 低齲組 無統(tǒng)計學(xué)差異（ P 利用 )函數(shù)描繪漢族、裕固族人群 所示 裕固族組中 X 軸 組別 Y 軸 ) 對照 (漢 /裕 ) (漢