【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）益生乳酸桿菌篩選和蘋果渣發(fā)酵工程研究微生物學(xué)碩士論文

密級(jí) 論文編號(hào) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士研究生學(xué)位論文 益生乳酸桿菌篩選和蘋果渣發(fā)酵工程研究 F I 摘 要 研究的目的： （ 1）建立 并采用 新的乳酸桿菌篩選模型，篩選益生乳酸桿菌 以作為主要的發(fā)酵菌種 ；（ 2）建立 粟酒裂殖 酵母發(fā)酵降解蘋果渣中的有機(jī)酸技術(shù)，為后續(xù)乳酸桿菌發(fā)酵提供適宜的境條件 ；（ 3）建立應(yīng)用篩選的益生乳酸桿菌發(fā)酵蘋果渣的實(shí)驗(yàn)室工程技術(shù)，使得發(fā)酵 產(chǎn)物具有抑菌活性 。 主要結(jié)果和結(jié)論： 建立 并采用 新的乳酸桿菌篩選模型 ,從 5 個(gè)豬糞樣品中篩選出的 18 株乳 酸桿菌其中有 15 株能夠清除培養(yǎng)物中三種致病性大腸桿菌 987P，對(duì)篩選的乳酸桿菌有關(guān)的生物特性進(jìn)行了研究。 同時(shí)分離到一株酵母菌 能夠促進(jìn)篩選乳酸桿菌的增殖和抑制大腸桿菌活性。 本研究選擇到一株 粟酒裂殖酵母 菌株能夠有效降解蘋果渣中的 解率達(dá) 使得蘋果渣的 大上升到 機(jī)酸下降約 60%；研究了 粟酒裂殖酵母 發(fā)酵工 藝，最佳發(fā)酵參數(shù)為： 亞硫酸用量 100mg/種量 07 個(gè) g，發(fā)酵溫度 28 ，批次發(fā)酵時(shí)間 24 h，不攪拌。 將 粟酒裂殖酵母 發(fā)酵后的蘋果渣調(diào)整 種篩選的乳酸桿菌 酵母 行聯(lián)合發(fā)酵能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物的抑制大腸桿菌的活性；該聯(lián)合發(fā)酵產(chǎn)物含有乳酸，含量為 不含蘋果酸和乙酸；乳酸桿菌 耐熱的 抗菌物質(zhì) ，該物質(zhì)的產(chǎn)生 與乳酸桿菌的生物量和菌體穩(wěn)定期的長(zhǎng)短兩個(gè)因素有關(guān) 。發(fā)酵產(chǎn)物中的益生乳酸桿菌 的生物量為 108g。 經(jīng)過(guò)發(fā)酵，蘋果渣總黃酮保存率為 游離 型黃酮的含量升高 20%。 發(fā)酵的產(chǎn)物含有乳酸、 抗菌物質(zhì) 、類黃酮 和益生乳酸桿菌等抗生素替代品的多種元素， 提高了蘋果渣的功能活性水平。 研究的意義： 新的篩選模型的建立提高了益生乳酸桿菌的篩選效率 ，具有新型安全抗菌微生態(tài)制劑研制的方法學(xué)意義 ；通過(guò)開(kāi)發(fā)蘋果渣利用的新途徑，有助于解決蘋果渣帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題；通過(guò)提高蘋果渣發(fā)酵飼料的抑菌活性以及微生態(tài)因子，期望能夠 提高蘋果渣作為飼料原料或其他的應(yīng)用價(jià)值 ；采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)處理蘋果渣為生物飼料符合綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)。 關(guān)鍵詞： 乳酸桿菌，篩選，蘋果渣， 發(fā)酵 (1) to a of of to as to (2) to up a of by to pH (3) to P in to P A is to of 18 5 88、 987P of of of 1, is at of is to pH so as to P A 757 is , 0% P, pH .0 to of 2100mg/10%; 28 ; 24of pH P 757, A of 29 1 to P, as a by of sp in 108g. 0% P. of as of P of of is a to P, P be P of to P as P of of 錄 第一章 引言 . 1 1 研究的目的和意義 . 1 2 飼用抗生素替代品研究進(jìn)展 . 1 3 乳酸桿菌的篩選研究進(jìn)展 . 3 4 蘋果渣的利用 . 6 5 固態(tài)發(fā)酵研究進(jìn)展 . 10 6 粟酒裂殖酵母發(fā)酵降解 . 11 7 蘋果多酚物質(zhì) . 11 8 研 究的內(nèi)容和方法 . 13 第二章 抑制大腸桿菌的乳酸桿菌的篩選 . 15 1 材料和方法 . 15 . 16 . 23 4 結(jié)論 . 24 第三章 乳酸桿菌的有關(guān)生物學(xué)特性研究 . 26 劑 . 26 . 26 3 結(jié)果 . 27 . 29 . 30 第四章 粟酒裂殖酵母的選擇及其發(fā)酵降酸工藝研究 . 31 器和方法 . 31 2 結(jié)果 . 33 . 36 . 37 第五章 乳酸桿菌和酵母菌聯(lián)合發(fā)酵蘋果渣的研究 . 38 1 主要儀器、材料和方法 . 38 2 結(jié)果 . 40 3 討論 . 45 4 結(jié)論 . 47 V 第六章 結(jié)論與展望 . 48 . 48 2. 提高蘋果渣功能活性水平的蘋果渣發(fā)酵工程及其可能機(jī)理（圖示） . 49 3. 展望 . 50 參考文獻(xiàn) . 51 致 謝 . 57 作者簡(jiǎn)歷 . 58 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 1 研究的目的和意義 本研究的目的（ 1）建立并應(yīng)用新的乳酸桿菌篩選模型，篩選益生乳酸桿菌，為蘋果渣發(fā)酵提供優(yōu)良菌株；（ 2）建立粟酒裂殖酵母發(fā)酵降解蘋果渣有機(jī)酸 的技術(shù)，以避免理化方法降低酸度帶來(lái)的功能活性物質(zhì)（纖維素改性、維生素和多酚物質(zhì)）的破壞，同時(shí)為后續(xù)乳酸桿菌發(fā)酵提供適宜的 境條件和營(yíng)養(yǎng)；（ 3）建立益生乳酸桿菌發(fā)酵蘋果渣的實(shí)驗(yàn)室工程技術(shù)，得到具有抑菌活性的蘋果渣生物飼料。 本研究的意義：（ 1）建立乳酸桿菌抑菌活性篩選模型，作為一種新的方法嘗試用于本研究篩選應(yīng)用，具有新型安全抗菌微生態(tài)制劑研制的方法學(xué)意義；（ 2）將所篩選優(yōu)良乳酸桿菌的產(chǎn)酸產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵代謝途徑與優(yōu)選的粟酒裂殖酵母的降酸發(fā)酵代謝途徑有機(jī)結(jié)合，建立一種專門針對(duì)于提高蘋果渣附加值的新型發(fā)酵系統(tǒng)工程 ；（ 3）本課題嘗試研究建立開(kāi)發(fā)利用蘋果渣的新途徑，以利于解決蘋果渣廢棄帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題；利用以上新型的發(fā)酵系統(tǒng)工程預(yù)期能夠得到具有蘋果渣原料的功 能性物質(zhì)成分、抑菌物質(zhì)以及微生態(tài)因子，提升其作為飼料資源的價(jià)值 ；本課題的總體研究思路和預(yù)期結(jié)果符合新型生物飼料安全、環(huán)保和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)要求，具有一定的理論和實(shí)際意義。 2 飼用抗生素替代品研究進(jìn)展 題的提出 40 年代末人們發(fā)現(xiàn)四環(huán)素對(duì)畜禽生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，從而開(kāi)創(chuàng)了抗生素作為飼料添加劑的時(shí)代（李千軍等， 2001）。 1950 年美國(guó)食品與藥物管理局（ 次批準(zhǔn)抗生素用做飼料添加劑后世界各國(guó)相繼進(jìn)行抗生素的飼喂實(shí)驗(yàn)，并用于畜牧生產(chǎn)。飼用抗生素通過(guò)抑制病原微生物的增殖，減少其代謝毒素對(duì)動(dòng)物的毒害作用而在防治動(dòng)物疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高畜產(chǎn)品質(zhì)量等方面起到了積極作用，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了許多的便利和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但是長(zhǎng)期使用尤其是濫用抗生素帶來(lái)的負(fù)面作用不可忽視，其負(fù)面作用主要有：抗生素的使用引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性；飼用抗生素的殘留，直接威脅人類健康，破壞生態(tài)環(huán)境；破壞機(jī)體內(nèi)正常菌群的生態(tài)平衡；對(duì)動(dòng)物的機(jī)體免疫力產(chǎn)生不良影響（佟建明等， 2001；熊家林等， 2001；張力等， 2000；郭興華， 2002）。因此各國(guó)一方面加強(qiáng)飼用抗生素的管理，另一方面加強(qiáng)飼用抗生素替代品的研究和開(kāi)發(fā)。 目前正在研究和開(kāi)發(fā)的飼用抗生素替代品包括：微生態(tài)制劑（益生菌， 低聚糖、飼用酶制劑、飼用酸制劑、中草藥飼料添加劑、糖萜素等植物提取物（ 李千軍 等 ， 2001； 張建東等 ， 2001； 張昌蓮 ， 1999； 林元銀 等， 2001； 劉亞力 ， 1999； 王洪生 ， 2000； 石現(xiàn)瑞 等 2000）。下面就 動(dòng)物微生態(tài)制劑、 飼用酸制劑、中草藥糖萜素等植物提取物等方面進(jìn)行綜述。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 物微生態(tài)制劑 動(dòng)物微生態(tài)制劑是我國(guó)專家 1988年提出，是指在微生態(tài)理論指導(dǎo)下利用對(duì)宿主有益的活的正常微生物或正常微生物的促生長(zhǎng)物質(zhì)經(jīng)特殊工藝制成的制劑，可起到調(diào)整動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡的作用。微生態(tài)制劑按有無(wú)活菌分為益生素、滅活益生素及益生元（化學(xué)益生素）。 添加微生態(tài)制劑（或益生素）可以顯著地增加日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，降低干物質(zhì)和氮排泄量、降低腹瀉率，提高仔豬成活率、提高仔豬采食量和增重，提高雛雞成活率，料肉比及日增重（ 1992）。 微生態(tài)制劑（主要是益生素）提高畜禽生產(chǎn)性能的生理機(jī)制：對(duì)動(dòng)物消化道微生態(tài)的調(diào)節(jié) ，提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)生長(zhǎng)， 增強(qiáng)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)功能， 促進(jìn)幼畜消化道發(fā)育和結(jié)構(gòu)優(yōu)化 ， 合成維生素提供給宿主，防止有害物質(zhì)的產(chǎn)生。 益生素在肉雞、仔豬、犢牛等養(yǎng)殖業(yè)中有防病治病、提高生產(chǎn)性能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，替代飼用抗生素，減少糞中產(chǎn)生的臭味等效果（ 郭興華， 2002）。 用酸制劑 飼用酸制劑分有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸。有機(jī)酸有檸檬酸、延胡索酸、乳酸、異位酸等，無(wú)機(jī)酸有磷酸。飼用酸制劑的作用：可降低胃腸道的 ，有利于腸道有益菌的繁殖，抑制某些病原菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)食欲，提高蛋白質(zhì)的消化率和蛋白質(zhì)沉積，有利于微量元素的吸收，增 強(qiáng)抵抗疾病的能力，激活一些重要的蛋白酶，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化（ 張建東等 ， 2001； 張昌蓮 ， 1999； 林元銀 等， 2001）。 草藥飼料添加劑 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)我國(guó)已有 200 余種中草藥用于畜禽添加劑，有 5000 多種中草藥可用于畜禽添加劑的生產(chǎn)。作用有：理氣健脾促進(jìn)消化，補(bǔ)氣壯陽(yáng)、養(yǎng)血滋陰、增強(qiáng)體質(zhì)，扶正驅(qū)邪、驅(qū)蟲(chóng)消積、促進(jìn)畜禽健康，安神定驚、開(kāi)關(guān)利竅，清熱解毒、殺菌抗病等。研究表明中草藥添加劑對(duì)兔、禽球蟲(chóng)病，牛、豬流行性腹瀉等病有明顯治療效果（ 張昌蓮 ， 1999）。 萜素等植物提取物 糖萜素是從油茶餅 粕和茶籽餅粕中提取的含糖類、三萜皂甙和有機(jī)酸等生物活性物質(zhì)，作用有：對(duì)機(jī)體的免疫功能，提高動(dòng)物體內(nèi)酶活性，改善消化吸收功能，抗應(yīng)激作用，抑制病源微生物作用 菌濃度： 沙門氏菌（抑菌濃度： 某些球蟲(chóng)、病毒等有害菌群。大蒜素、茶多酚、山楂葉黃酮、大豆異黃酮等植物提取物促進(jìn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能，替代抗生素的功能研究開(kāi)發(fā)也在進(jìn)行之中（ 王岳飛 ， 1994；劉根桃等， 1997；劉燕強(qiáng)等， 1998；謝奉祥， 2001）；類黃酮是中藥和植物中普遍存在 的功能性的成分，有著作為功能性食品添加劑和新型飼料添加劑的潛力，是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)（石碧等， 2000；張德全等， 1999）。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 3 乳酸桿菌的篩選研究進(jìn)展 為了提高動(dòng)物微生態(tài)制劑應(yīng)用的有效性，針對(duì)寄主特異性，從不同動(dòng)物體內(nèi)、體外進(jìn)行乳酸菌的篩選以期望得到優(yōu)良的菌株，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)（陳世瓊， 2000；楊華， 2000 黃滄海，2003； M. M. 2003； et 2003； et 2003；禹慧明等，2002）。傳統(tǒng)的篩 選模型效率低且工作量大已經(jīng)成為益生菌篩選工作的瓶頸，直接影響到益生菌的應(yīng)用。本文通過(guò)總結(jié)并比較前人做過(guò)的三個(gè)典型的乳酸菌篩選模型，探討如何提高篩選效率，并把實(shí)踐中常見(jiàn)的篩選方法作一簡(jiǎn)要概述。 選模式和篩選效率 總結(jié)的三個(gè)典型的篩選模型分別命名為模型 A（陳世瓊， 2000；楊華， 2000），模型 B（黃滄海， 2003）和模型 C（ M. M. 2003），它們的共同點(diǎn)是篩選模式相同，為傳統(tǒng)的“先分離后篩選”；不同點(diǎn)在于采用的篩選指標(biāo)及其篩選的順序不同。為了便于評(píng)價(jià)篩選模型的效率，作者提 出益生菌篩選效率的計(jì)算公式為： 公式中： a 為篩選結(jié)果中符合需要的菌株的數(shù)量， b 為待篩選的菌株的數(shù)量。 表 1選模型和篩選效率 of 型 /發(fā)菌株 /of 合需要的菌株 /of 選效率（ %） /of %） 模型 A/ 200 38 19 模型 B/ 7009 4 型 C/ 686 4 1選模型和各自的篩選指標(biāo) of 型 /選指標(biāo)，篩選效率（ %）及其順序 /of 型 A/ 益生性 19 黏附和耐藥性 模型 B/ 耐酸 70、耐膽鹽 高銅 50、益生性 43 模型 C/ 益生性 40、菌株純化 27、耐酸和耐膽鹽 25、耐藥性 21 表 1出了三個(gè)不同的篩選模型及其篩選效率。表 1出了篩選模型和各自的篩選指標(biāo)及其篩選效率和順序。由表 1以看出，模型 A 只有一個(gè)篩選指標(biāo)，篩選效率為 19%，模型 ) 第一章 引言 4 和模型 C 的篩選效率小于 1%， 99%以上的工作量是徒勞的。表 1明，各指標(biāo)的篩選效率有明顯的差異，按篩選效率的高低篩選指標(biāo)依次為耐酸、益生性、耐藥性、耐膽鹽。 作為動(dòng)物微生態(tài)制劑的待選菌株，往往要經(jīng)過(guò)多項(xiàng)指標(biāo)的篩選，其中益生性、耐酸、耐膽鹽是最常用的篩選指標(biāo)。耐藥性也 是一項(xiàng)重要的指標(biāo)，但目前并沒(méi)有關(guān)于乳酸 菌耐藥性的統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。此外定植性也是應(yīng)該考慮的篩選指標(biāo)，但技術(shù)要求的難度較高。 對(duì)于模型 B 和 C 從總的篩選效率考慮要篩選到理想的菌株工作量很大，并且 99%以上的工作量是徒勞的，篩選效率極其低下?？梢?jiàn)“先分離后篩選”的篩選模式很不經(jīng)濟(jì)。 鑒于“先分離后篩選”的篩選模式的缺點(diǎn)，作者提出了“先篩選后分離然后再進(jìn)一步篩選”的篩選模式，現(xiàn)將該模式從理論上闡述如下： 一般待篩選的菌株都要經(jīng)過(guò)同樣的篩選指標(biāo)的篩選及篩選程序，可以將方便集成的指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行篩選，比如耐酸、益生性、耐膽鹽篩 選指標(biāo)。具體做法是將待篩選的樣品不經(jīng)過(guò)分離而直接經(jīng)過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的且工作量很小的初步篩選，作用是將不符合需要的菌株淘汰，將符合需要的菌株保留下來(lái)并加以富集，隨后分離單菌株并進(jìn)一步篩選。這一篩選模式為“先預(yù)篩選后分離再進(jìn)一步篩選”。理論上該篩選模式可以顯著提高篩選的效率，另外這一篩選模式還可能有以下優(yōu)點(diǎn)：避免漏篩，初步篩選的待篩菌株為樣品中的所有菌株，同時(shí)也避免了取樣的不科學(xué)性；可以預(yù)先知道樣品是否含有目的菌株，避免篩選的盲目性；具有可評(píng)價(jià)的特點(diǎn)，待篩樣品經(jīng)過(guò)耐酸、耐膽鹽的篩選后，益生性指標(biāo)可以作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)，分 離的菌株的益生性指標(biāo)可以與初篩結(jié)果相比較，從而保證篩選到優(yōu)良的菌株。 對(duì)于一個(gè)動(dòng)物微生態(tài)制劑的篩選模型，應(yīng)該經(jīng)過(guò)耐酸、益生性、耐膽鹽、耐藥性、定植性等指標(biāo)的篩選過(guò)程；而篩選效率的高低并不取決于篩選指標(biāo)，而是取決于篩選模式；而“先篩選后分離再進(jìn)一步分離”在提高篩選效率上可能顯著優(yōu)于“先分離后篩選”的模式。 生性篩選 益生性指乳酸菌通過(guò)有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制特性。益生性篩選首先涉及到指示菌的選擇，這取決于篩選的應(yīng)用目的。益生性篩選的方法，常用的有牛津杯擴(kuò)散法（祝嫦巍等， 2002）、菌落抑菌法（ M. M. 2003）、平皿挖溝法（黃滄海， 2003）、聯(lián)合培養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)抑制法（黃滄海， 2003）和二乙酸熒光素水解法（徐利華等， 1997）。其中平皿挖溝法可以用于不超過(guò)三個(gè)指示菌的益生性篩選，菌落抑菌法和二乙酸熒光素水解法適合高通量的篩選，而聯(lián)合培養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)抑制法是檢驗(yàn)待篩益生菌菌株清除指示菌的能力且最終決定優(yōu)良菌株取舍的方法。 膽鹽篩選 常用耐膽鹽篩選的方法有兩種，一是最低抑制濃度法即 （ B., et 2000），以在含有膽鹽的 養(yǎng)基上所能生長(zhǎng)的最大膽鹽濃度表示，最低要求 不低于 二是分光光度計(jì)法（ S. E., et ， 1998），通過(guò)測(cè)定待篩菌株在含 鹽的 體培養(yǎng)基中在不同培養(yǎng)時(shí)間（ 1、 2、 3、 4、 6h）的 ，然后作圖，和對(duì)照（不加膽鹽）比較，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 分別計(jì)算二者達(dá)到 的時(shí)間（與 0 h 培養(yǎng)基的 比較），并計(jì)算二者的差值（以示），判斷標(biāo)準(zhǔn)為：差值 15耐膽鹽； 15值 40中等； 40值60弱 ；差值 60敏感。其中， 較為簡(jiǎn)單實(shí)用；而分光光度計(jì)法要求條件比較復(fù)雜。 酸性篩選 常用的耐酸性篩選是測(cè)定經(jīng)過(guò)一定時(shí)間（一般 4h），在一定 （ ）的 湯培養(yǎng)后的存活率（黃滄海， 2003）；另外一種就是分光光度計(jì)方法（ M. M. 2003），測(cè)定待篩菌株在不同 （ 2、 4、 5， 7 為對(duì)照）條件下 沖液中在不同培養(yǎng)時(shí)間（ 2、 4、 24h）的 ，根據(jù)以下的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：在 24h 內(nèi)，在所有 水平上 上升的為最優(yōu)；在 24h 內(nèi)，在 3 個(gè) 水平上 都上升的為較優(yōu)；以下情況可以認(rèn)為良好 4h 內(nèi)，在 2 個(gè) 水平上 都上升；在 24h 內(nèi)，在 1 個(gè) 水平上 h 內(nèi)在 2 個(gè)以上 水平上 都上升；在 4h 內(nèi)在所有 水平上 藥性篩選 耐藥性直接關(guān)系到食品安全因而在乳酸菌應(yīng)用中日益受到關(guān)注。通常選用的最有代表性抗生素為紅霉素（ 甲氧芐啶 格雷沙星（ 氨芐青霉素（ 左氟沙星（ 四環(huán)素（ 共六種。選擇這 6 種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)是抗生素的對(duì)人類藥物的重要程度（ M. M. 2003）。 最常用的耐藥性檢測(cè)方法為紙片法，用于實(shí)驗(yàn)的抗生素通常采用標(biāo)準(zhǔn)的藥敏紙片（凌代文，1999）。判斷的標(biāo)準(zhǔn)： G+菌參照金黃色葡萄球菌 株， 細(xì)請(qǐng)參考 紙片法所用的培養(yǎng)基為半固體 養(yǎng)基（ 脂）， 9平皿裝量為 25體密度為 106華，張?bào)?2000）。 植性篩選 定植性是乳酸菌在腸道內(nèi)能夠發(fā)揮作用的前提條件，一般用體外條件下與腸上皮細(xì)胞（ ）黏附的乳酸菌的量來(lái)表示（郭興華， 2002）。黏附實(shí)驗(yàn)的基本步驟為：首先進(jìn)行腸上皮細(xì)胞的培 養(yǎng)，然后將培養(yǎng)好的腸上皮細(xì)胞加入 24 孔板貼壁固定，第三，加入乳酸菌進(jìn)行共培養(yǎng)，第四，倒去培養(yǎng)液并用緩沖液沖洗腸上皮細(xì)胞表面；最后，觀察并計(jì)算每個(gè)細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)目（楊華，張?bào)?2000）。 基于乳酸菌的自身凝聚力和對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附力呈正相關(guān)（郭興華， 2002），可以用乳酸菌的自身凝聚力作為乳酸菌定植能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。自身凝聚力的檢測(cè)方法（ B., et 2003）中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 6 如下：乳酸菌用 湯在 37 培養(yǎng) 18h，收集菌體（ 5000r/15然后用 浮，使得菌體密度達(dá) 1084體懸浮液用渦流振蕩 10 s，在室溫下按如下操作測(cè)定自身凝聚力：每 h（包括 0 h）取 0.1 層懸浮液加入 3.9 測(cè)定 身凝聚力的百分比用以下公式表示： （ 1 0） 100，其中 表 1， 2， 3， 4， 5 h 的 表 0 4 蘋果渣的利用 蘋果渣（ 蘋果加工業(yè)的副產(chǎn)品，由蘋果皮、果心和果肉等組成（王晉杰等， 2000）。我國(guó)是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)蘋果 20， 431， 230 噸（中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒 ， 2001，9）。目前有 10%進(jìn)行加工處理，出渣率 20總產(chǎn)量十分可觀（王晉杰等， 2000）。據(jù)楊福有等（ 1998）對(duì)陜西蘋果生產(chǎn)利用現(xiàn)狀調(diào)查，初步估計(jì)用蘋果渣作肥料、燃料的占 15% 20%，作飼料用為 10%，當(dāng)垃圾處理占到 70%，即每年有 15 萬(wàn)噸蘋果渣當(dāng)垃圾處理，污染環(huán)境。 果渣的特點(diǎn) 蘋果渣有以下特點(diǎn)：富含水分、可溶性糖、有機(jī)酸、礦物質(zhì)和維生素 C，蛋白質(zhì)含量低，酸度大。 果渣的成分與利用 關(guān)于蘋果渣成分有不同的報(bào)道（楊福有等， 2000；李彩鳳等， 2001；王晉杰等， 1981；吳衛(wèi)華， 1996； F. A. et 1998； et 1992）。表 1舉了蘋果渣的一般成分，由表 1以看出蘋果渣含有豐富而廉價(jià)的微生物可利用碳源，蘋果渣中還含有促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的豐富的礦物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。另外蘋果渣中含有的膳食纖維一直是營(yíng)養(yǎng)學(xué)家提倡攝取的保健因子，對(duì)于潛在的飼用抗生素替代品的低聚糖也可以由蘋果渣中的纖維素經(jīng)適當(dāng)降解而來(lái)。 蘋果渣干粉的代謝能（牛）值（ 近于玉米（ 麩皮（ 1.7 果渣粉相當(dāng)于 1米粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，蘋果渣可直接作為牲畜如豬、奶牛和羊的青飼料或干飼料。但蘋果渣蛋白含量低，蘋果渣干粉替代麩皮和玉米不能超過(guò)一定的比例。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 7 表 渣的一般成分 P 成分 /均含量 /分 /%） 溶性糖 /%） 定酸 /%） 膠 /%） 粉 /%） 纖維 / %） 蛋白 /%） 壞血酸 /00g） 物質(zhì) /K（ %） a（ %） a（ %） g（ %） e（ mg/ u（ mg/ n（ mg/ 15 n（ mg/ ：表中結(jié)果以干蘋果渣測(cè)定； 95%置信度；水分以濕蘋果渣測(cè)定。 表 1蘋果渣成分與利用的一覽表。由表 1以看出，蘋果渣的利用有很多途徑，概括起來(lái)主要有三方面：（ 1）直接利用途徑：直接提取膳食纖維，但是常規(guī)的酸或堿法提取會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染；直接用做飼料有明顯的不足，如蛋白質(zhì)含量低；做 食品也很少使用；直接利用非常有限。（ 2） 采用發(fā)酵的方法來(lái)提高蘋果渣的利用價(jià)值：生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，有機(jī)酸，酒精，酶制劑等；（ 3） 蘋果渣利用出現(xiàn)的新趨勢(shì)：近年來(lái)蘋果渣利用往功能性食品或飼料發(fā)展，比如，蘋果渣對(duì)脂肪代謝的功能性研究，蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn) 蘋果渣中提取多酚物質(zhì)及其功能性質(zhì)的研究，蘋果渣作為仔豬腹瀉治療物質(zhì)的一種成分的研究等等。但是利用發(fā)酵提高蘋果渣的功能活性水平的研究還沒(méi)有見(jiàn)報(bào)道，利用蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)功能性的飼料原料是很好的選擇。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 8 表 1果渣成分與利用 P 蘋果渣成分/P 蘋果渣利用 /P 文獻(xiàn) / 溶 性 糖 /酵生產(chǎn)酒精、檸檬酸、果醋、單細(xì)胞蛋白、蘋果渣青貯 侯紅萍等， 1998； . A., et 2002； et 19952000； et 1994；., et 1995； et 1992； 傅斌等， 1989；籍保平等， 1999；陳喜英等， 2000； 果膠 / 取果膠、生產(chǎn)果膠水解酶、改善脂肪代謝 陳雪峰等， 2000；孔臻等 , 2000； et 1998；et 2001； et 2000； et 2000； et et 1997 纖維 素 、 木 聚 糖 / 取食用纖維、生產(chǎn)食用菌和低聚糖、生產(chǎn)纖維素酶、做植物生長(zhǎng)基質(zhì)改良劑、制活性炭和天然氣、減肥食品、改善食品品質(zhì)、提取木聚糖 康正平等， 1997；鄧紅等， 2002；史紅兵等， 2002；李文哲等， 2000； et 2001； et 1998、2002； et 1992； et 1992； et 1995； et 1999 角質(zhì) /產(chǎn)角質(zhì)酶和角質(zhì)酯酶 et 1999、 2000 蘋果酸等有機(jī)酸，不含植酸 /為治療仔豬貧血的載體 et 1997 酚類物質(zhì)/植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、分離花青素前體等物質(zhì)做保健藥物 et 2000； et 1997、 1999、 2000；et 1997 蘋果酶系 /P 生產(chǎn)香料 et 1996 蘋果渣 /蘋果果醬、生產(chǎn) 為仔豬腹瀉治療物質(zhì)的一種成分、作為生防制劑基質(zhì) et 2000； et et 2002； et 1999 果渣青貯 楊福有等（ 2000）研究了蘋果渣的青貯與飼喂技術(shù)，認(rèn)為蘋果渣青貯之后適口性有所改善。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 9 青貯蘋果渣對(duì)牛、羊、豬等家畜可以長(zhǎng)期飼喂，無(wú)任何毒副作用。陳喜英等（ 2000）認(rèn)為蘋果渣青貯飼料飼喂奶?？梢蕴岣吣膛５漠a(chǎn)奶 量。 蘋果渣青貯的原理是：鮮蘋果渣壓實(shí)在青貯窖中，乳酸菌使蘋果渣中的糖類轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?。由于乳酸的不斷產(chǎn)生酸度加大抑制了其他微生物的繁殖，當(dāng) 蘋果渣的微生物在厭氧條件下幾乎完全停止活動(dòng)，從而使蘋果渣能長(zhǎng)期保存。蘋果渣青貯時(shí)間一般 30天以上。余伯良（ 1999）認(rèn)為青貯飼料調(diào)控的要點(diǎn)為：原料有一定的含糖量，含水量為 65溫度為 19，缺氧或密封。 果渣發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白 單細(xì)胞蛋白（ 叫微生物蛋白，單細(xì)胞蛋白的研究是為了解決飼料糧食 和蛋白質(zhì)缺乏的問(wèn)題。國(guó)內(nèi)籍保平等（ 1999）對(duì)蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白進(jìn)行了詳細(xì)的研究。國(guó)外也有很多相關(guān)報(bào)道（ V. K., et 1997, 2000; H., et T. C., et 籍保平等（ 1999）篩選菌種包括絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為能在蘋果渣原料為培養(yǎng)基的基質(zhì)上生長(zhǎng)和生產(chǎn)較多的粗蛋白。通過(guò)雙菌混生實(shí)驗(yàn)選出適宜的菌種組合，籍保平等（ 1999）篩選出的菌種為白地霉和康寧木霉。 T C, et 酵母菌和產(chǎn)纖維素酶的霉菌進(jìn)行雙菌混生培養(yǎng)篩選，標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量，結(jié)果以黑曲霉和產(chǎn)假絲酵母（ 合為最優(yōu)。 K, et 2000）對(duì)五種酵母菌（ 分別發(fā)酵蘋果渣進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同菌種發(fā)酵的產(chǎn)物有不同的特點(diǎn)：粗蛋白含量以 C. 最高，可溶性蛋白含量以 纖維含量以 S. 最低，粗脂肪和維生素 C 以 C. 最高。需要指出的是：不少 的菌種（包括 C. 在內(nèi)）屬于機(jī)會(huì)性致病菌，由此所引起的假絲酵母癥疾病 現(xiàn)為敏感感染部位的瘙癢等癥狀（王建華， 2002）。 而在有些國(guó)家有關(guān)應(yīng)用微生物研究和生產(chǎn)領(lǐng)域還將其當(dāng)作轉(zhuǎn)化低值生物資源的有益微生物在廣泛應(yīng)用值得引起注意；作為 員國(guó)， 我們必須也應(yīng)該參考或按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)和銷售農(nóng)業(yè)產(chǎn)品。 蘋果渣含水量高、酸度大、缺氮元素，不合適直接作為發(fā)酵原料，必須添加無(wú)機(jī)氮源、調(diào)整水分和酸度。籍保平等（ 1999）研究了發(fā)酵培養(yǎng)基添加的無(wú)機(jī)氮源和添加量，發(fā)酵培養(yǎng)基配方，選擇的標(biāo)準(zhǔn)為粗蛋白含量和產(chǎn)品的風(fēng)味。該研究嘗試加入其他的農(nóng)產(chǎn)品加工的副產(chǎn)品如麩皮等。 籍保平等（ 1999）蘋果渣發(fā)酵的工藝條件包括：菌種接種比例、接種量、料水比、 、發(fā)酵時(shí)間、靜止發(fā)酵料層厚度等。該研究采用了單因素分析的方法確定了工藝的最佳條件，判斷優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量。 蘋果渣發(fā)酵單細(xì)胞蛋白的研究的借鑒意義有：研究目的決定了菌種選擇、培養(yǎng)基和工藝條件