【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）小麥族A、S、D二倍體種全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及序列初步分析生物化學(xué)與分子生物學(xué)博士論文

i 密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 小麥族 A、 S、 D 二倍體種 全長(zhǎng) 庫(kù) 構(gòu)建及 序列初步分析 , S , S 要 普通 小麥 （ 異源六倍體（ 基因組龐大（ 1010重復(fù)序列多（約 90），發(fā)掘、克隆小麥新基因意義巨大。全長(zhǎng) 庫(kù)中 絕大多數(shù)克隆不僅包含完整的閱讀框架，還擁有 5和 3端的非編碼區(qū)， 是進(jìn)行功能基因組學(xué)研究的一條有效途徑。 在引進(jìn)、消化吸收的基礎(chǔ)上，我們對(duì) 做了一些具體的改進(jìn)，形成了一套簡(jiǎn)單易行的技術(shù)體系，建立了我們自己的全長(zhǎng) 庫(kù)構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)。利用改進(jìn)的 ，分別構(gòu)建了 烏拉爾圖小麥（ A 基因組 ， 擬斯卑爾脫 ( 基因組和 粗 山羊草（ D 基因組 的全長(zhǎng) 庫(kù) ， 庫(kù)容量達(dá)到了 106，重組率超過(guò) 95， 文庫(kù)中 全長(zhǎng)基因的比例分別為 70%、 70%。 基因功能注釋表明， 在 得到的 2089 個(gè)基因中 ， 有 1584 個(gè)基因?yàn)槿L(zhǎng)基因， 1346 個(gè)為小麥全長(zhǎng)新基因，其中 A 基因組 569個(gè) ， S 基因組有 553 個(gè) ， D 基因組 468 個(gè) 。 密碼子使用 的偏愛(ài)性是在生物長(zhǎng)期進(jìn)化歷程中逐漸形成的，影響偏愛(ài)性的因素有多種 ，如G+C 含量 ，基因 表達(dá)水平，基因的長(zhǎng)度 ， 豐度等等。 我們以得到的 2089 個(gè)基因?yàn)榭疾鞂?duì)象，對(duì)小麥中密碼子使用的偏愛(ài)性進(jìn)行了分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明 A、 S、 D 三個(gè)基因組 間 密碼 子使用偏 愛(ài) 性沒(méi)有差別 ，但單個(gè)基因組中密碼子使用偏愛(ài)性明顯，如 用頻率超過(guò)了 35 ， 使用頻率甚至超過(guò)了 45 ；另外 ，還 有 3 種密碼子的使用頻率超過(guò)了 30 ， 12 種密碼子的使用頻率超過(guò) 20 。通過(guò)與水稻中密碼子使用的偏愛(ài)性比較， 我 們發(fā)現(xiàn)在擁有 4 6 個(gè) 同義密碼子 的 氨基酸 中 ， 水稻和小麥在 優(yōu)先使用密碼子 方面 存在明顯的不同，水稻中優(yōu)先使用 密碼子的末尾堿基傾向于 U 和 C，而小麥中則傾向于 G 和 C。 比較基因組學(xué)是基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容，通過(guò)進(jìn)行不同層次的 基因 組比較，不僅可以了解不同物種的基因及基因組在結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)調(diào)節(jié)方面的差異，而且 有助于 揭示物種的起源 和進(jìn)化 的動(dòng)力。 我們利用分子進(jìn)化的分析方法，以測(cè)序得到的 22個(gè)基因?yàn)榭疾鞂?duì)象，通過(guò)構(gòu)建基因進(jìn)化樹來(lái)探索小麥 A、 S、 計(jì)結(jié)果表明，來(lái)自 A、 親緣關(guān)系 普遍較近，而與 一結(jié)果在之后的 有數(shù)量多，分布廣， 高度穩(wěn)定， 適于快速、自動(dòng)化 檢測(cè) ，應(yīng)用前景廣闊 等特點(diǎn) ，因而倍受青睞。我們 以測(cè)序得到的 2089 個(gè)來(lái)自小麥不同基因組的基因序列為源序列，利用件，從 小麥 中檢測(cè)到 1296 個(gè) 辟了一條通過(guò)單基因組測(cè)序發(fā)掘小麥 有效途徑。在所得的 ， 有 397 個(gè)自 A 基因組 ， 322 個(gè)來(lái)自 420 個(gè)來(lái) 自 D 基因組 ；另外， A 和 D 基因組共同的 154 個(gè)， A 和 S， S 和 D， 和 D 基因組共有的 僅有 1 個(gè) 。分析表明小麥中堿基 平均變異率為 ， 與 大豆中的研究結(jié)果（ ）非常接近，而與玉米中的研究結(jié)果 （ ） 相差較遠(yuǎn)。 關(guān)鍵詞： 基因組供體 ， 全長(zhǎng) 庫(kù)，單核苷酸多態(tài)性，密碼子使用偏愛(ài)性，分子進(jìn)化， 比較基因組學(xué) is of in it . A. Up to a of 010 0） . As of DS of as is as an to in on we of we of s A, B, D of of of of in 0%, 0%, 584 346 in 089 569 553 68 is of of in a of as +C, of of We 089 in s no of in 5 ， 5 ； in 0 2 0 。 in we In -6 of in , in . is of by at it to of We 2 of of on we of , D in , S, D is of 089 as 296 397 322 20 v of 54. , S , A, S in ， to of ） , ). 錄 第一章 引言 . 1 物功能基因組學(xué)的發(fā)展和小麥基因組研究 . 1 因組學(xué)的誕生和發(fā)展 . 1 物功能基因組研究的技術(shù) . 2 麥基因組學(xué)研究現(xiàn)狀 . 3 長(zhǎng) 庫(kù)構(gòu)建與全長(zhǎng) . 4 通 庫(kù) . 4 減文庫(kù) . 4 一化 庫(kù) . 6 長(zhǎng) 庫(kù) . 6 較基因組學(xué)與小麥染色體組研究 . 14 較基因組學(xué)研究方法 . 14 較基因組學(xué)在小麥基因組研究中的應(yīng)用 . 15 子進(jìn)化研究進(jìn)展 . 16 統(tǒng)進(jìn)化樹 . 16 統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建方法 . 17 子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育分析軟件 . 19 統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 . 20 子進(jìn)化的發(fā)展與應(yīng)用前景 . 21 子進(jìn)化在小麥進(jìn)化研究中的應(yīng)用 . 22 碼子使用偏愛(ài)性研究進(jìn)展 . 22 通小麥 的分類和起源 . 23 麥的分類 . 23 通小麥的基因組起源 . 23 麥基因組起源研究方法 . 25 麥基因組起源研究的對(duì)象 . 25 核苷酸多態(tài)性研究進(jìn)展 . 25 定義及特點(diǎn) . 26 掘、檢測(cè) 技術(shù)和方法 . 27 應(yīng)用前景 . 29 第二章 論文設(shè)計(jì) . 33 題依據(jù) . 33 通小麥的起源 . 33 長(zhǎng) 庫(kù)在功能基因組學(xué)研究中的地位 . 33 麥 A、 S、 D 基因組間的比較研究 . 34 麥 掘存在的困難 . 34 究目的 . 34 期目標(biāo) . 34 術(shù)路線 . 35 第三章 小麥二倍體基因組供體種 全長(zhǎng) 庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 . 36 料與方法 . 36 料 . 36 法 . 39 果分析 . 51 長(zhǎng) 庫(kù)構(gòu)建結(jié)果 . 51 長(zhǎng)新基因發(fā)掘及基因功能注釋 . 55 麥 A、 S、 D 基因組密碼子使用偏愛(ài)性分析 . 58 論 . 61 響 庫(kù)全長(zhǎng)比例的因素 . 61 長(zhǎng)判定 . 62 長(zhǎng) 庫(kù)與小麥功能基因組研究 . 62 第四章 小麥 A、 S、 . 64 法 . 65 果與討論 . 67 第五章 小麥 掘 . 72 掘流程 . 72 果與討論 . 73 第六章 結(jié)論 . 79 附錄 . 81 附錄 . 81 附錄 . 89 附錄 . 99 參考文獻(xiàn) . 107 作者簡(jiǎn)歷 . 121 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 物功能基因組學(xué)的發(fā)展和小麥基因組研究 因組學(xué)的誕生和發(fā)展 現(xiàn) 螺旋結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著分子生物學(xué)的誕生。在隨后的半個(gè)世紀(jì)里，分子生物學(xué)得到了 迅猛的 發(fā)展，尤其在最近的 30 多年中，由于基因克隆技術(shù) 的 出現(xiàn)和不斷改進(jìn)，人們克隆了許多重要 基因。限于技術(shù)和認(rèn)識(shí) 制約 ，以往許多研究主要集中在一個(gè)或幾個(gè)基因上。隨著生物學(xué) 、 工程學(xué) 和計(jì)算機(jī)科學(xué)的 發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)的涌現(xiàn)，人們開(kāi)始通過(guò)全基因組測(cè)序來(lái)研究生物 遺傳物質(zhì)的 組成 和 結(jié)構(gòu) ，由此誕生了基因組學(xué)（ (2001)。 基因組學(xué)的概念最早由美國(guó) 科 學(xué)家 1986 年提出的。它涵蓋的研究?jī)?nèi)容相當(dāng)廣泛， 包括全基因 作圖（包括遺傳圖譜，物理圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析等。根據(jù)基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容可以將其分為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)兩個(gè)部分，前者 是 基因組分析的早期階段，以建立生物基因組高分辨率的遺傳、物理和轉(zhuǎn) 錄圖譜 為目的；后者則是利用前者提供的序列信息，系統(tǒng)地研究基因的功能， 以高通量、大規(guī)模實(shí)驗(yàn)方法以及統(tǒng)計(jì)和計(jì)算機(jī)分析為特征。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和多種模式生物全基因組測(cè)序的結(jié)束，科學(xué)家們的 研究中心由對(duì)基因組的序列分析轉(zhuǎn)移到從整體水平對(duì)功能的研究上， 基因組研 究也從研究基因組的結(jié)構(gòu)階段過(guò)渡到功能基因組研究階段，即后基因組 時(shí) 代 （ 。 擬南芥基因組計(jì)劃的實(shí)施標(biāo)志著植物基因組的誕生，其全基因組測(cè)定的完成是植物學(xué)發(fā)展史上的一個(gè)里程碑（ et 2001）。隨著雙子葉模式植 物擬南芥和單子葉植物水稻全基因組測(cè)序的完成，植物基因組研究也進(jìn)入 功能分析時(shí)期， 標(biāo)志著植物功能基因組學(xué)的誕生。 植物基因組學(xué)研究已經(jīng)受到各國(guó)科學(xué)家及政府機(jī)構(gòu)的重視，在新一期的五年計(jì)劃中，美國(guó)國(guó)家自然基金 委 斥資 1 億美元用于資助這方面的研究。歐盟國(guó)家基因組研究協(xié)助網(wǎng)投資 歐元用于加強(qiáng)植物基因組研究。植物基因組研究在我國(guó)也非常受重視，以北京基因組研究所為首發(fā)起的 秈稻 全基因組測(cè)序?yàn)橹参锘蚪M研究做出了巨大貢獻(xiàn) (et 2003)，目前已經(jīng)啟動(dòng)以研究中草藥基因組的 神農(nóng)計(jì)劃 更是前途無(wú)量。國(guó)際上有 很多生物公司也非常注重植物基因組研究，如司等。正是這些盈利性公司的參與和競(jìng)爭(zhēng)，大大加速了植物基因組研究的進(jìn)程。 基因組學(xué)的誕生和發(fā)展與其它學(xué)科的發(fā)展密不可分，是一門多學(xué)科相互交叉、滲透的 大科學(xué) 。基因組學(xué)的發(fā)展也帶動(dòng)了其它相關(guān)學(xué)科的產(chǎn)生和發(fā)展，生物信息學(xué)就是其中的一個(gè)代表。廣義的生物信息學(xué)是使用數(shù)學(xué)、物理和信息科學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法來(lái)研究生命現(xiàn)象 ， 組織、分析呈指數(shù)增長(zhǎng)的生物學(xué)數(shù)據(jù)。生物信息學(xué)的一個(gè)重要內(nèi)容 是 通過(guò)開(kāi)發(fā)各種相關(guān)的軟件，對(duì)日益增長(zhǎng)的核酸或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行 收集、整 理，加工、提取其中最本質(zhì)，最規(guī)律的東西，并反作用于生物 基因組研究，對(duì)基因可能的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。因此 ， 生物信息學(xué)的方法已經(jīng)成為功能基因組學(xué)研究方法的重要組成部分。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 2 物功能基因組研究的技術(shù) 功能基因組學(xué)是一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域，其研究方法也正在不斷發(fā)展和自我完善。根據(jù)研究方式的不同?？梢詫⒅参锘蚪M研究方法分為兩類，一類建立在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)具體的實(shí)驗(yàn) 研究基因組的功能；另一類建立在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，它通過(guò)對(duì) 已有的信息的整理，分析，提取其中規(guī)律性的東西 ，用于 其它 生物 基因組研究上。 以 實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的方法主要包括以下幾種： 入 /轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法，基因表達(dá)序列分析技術(shù)、表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)、生物芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)和 擾技術(shù)。 1） 座子標(biāo)簽技術(shù)是利用轉(zhuǎn)座子或 為生物誘變劑，通過(guò)它們對(duì)目的基因的插入失活而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的標(biāo)記，根據(jù)基因和表型間的相互關(guān)系確定基因的功能 （李偉等2000） 。 2） 基因表達(dá)序列分析技術(shù) 在植物功能基因組研究 中常用的主要是 簽技術(shù)。 常為 300 500核酸序列，是 庫(kù)隨機(jī)測(cè)序得到的 段，由于 自基因的編碼區(qū) 段，所以它所反映的是生物在某一特定條件下表達(dá)狀況。該方法借助高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)了解生物特定組織，特定器官，特定時(shí)期的基因表達(dá)信息。 3） 生物芯片技術(shù) 生物芯片包括 片和蛋白質(zhì)芯片兩種類型。 片是根據(jù)核酸分子雜交 的 原理設(shè)計(jì)而成的，它按照特定的排列方式將大量的基因探針或基因片段固定在特定的載體上，通過(guò)雜交檢測(cè)基因的表達(dá)狀況。蛋白質(zhì)芯片類似于 片，不同的是它是將蛋白質(zhì)或多肽固定在載體上。其檢測(cè)原理類似于抗原抗體間的免疫學(xué)反應(yīng)。 4） 蛋白質(zhì)組學(xué)研究 基因是遺傳物質(zhì)的攜帶者，而生物功能的執(zhí)行者卻是 蛋白質(zhì)，后者有其自身的活動(dòng)規(guī)律，所以僅僅從基因的角度來(lái)研究基因的功能是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。蛋白質(zhì)組（ 概念最早由澳大利亞 學(xué)的科學(xué)家 1995 年提出的，它 包括基因組表達(dá)產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)及其存在方式。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)不同 時(shí)間和空間發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)群體進(jìn)行研究，從蛋白質(zhì)水平來(lái)探索蛋白質(zhì)的作用方式、功能機(jī)理、調(diào)節(jié)調(diào)控以及蛋白質(zhì)群體間的相互作用。由于蛋白質(zhì)存在多樣性、可變性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，同時(shí)還存在低表達(dá)蛋白質(zhì)難以檢測(cè)等特點(diǎn)，所以研究起來(lái)相對(duì)較困難。 5） 擾技術(shù)是最近幾年 興起的一種功能基因組學(xué)研究方法，已經(jīng)在植物功能基因組學(xué)研究中得到應(yīng)用。其基本原理是內(nèi)源或外源的 生物體內(nèi)形成雙鏈 ， 經(jīng) 1 23小干擾 NA 后者與 導(dǎo)沉默復(fù)合體結(jié)合，借助 導(dǎo)向作用，對(duì)底物進(jìn)行特異性降解，使細(xì)胞中 水平下降，達(dá)到沉默基因的目的。 生物信息學(xué) 方法在功能基因組研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。我們常用的 n)， x)以及根據(jù)保守 結(jié)構(gòu)域 和直系同源簇 進(jìn)行的比對(duì)都是建立在生物信息學(xué)基礎(chǔ)之上的， 通過(guò)未知基因與已知基因 的比較，推測(cè)、 確定基因的功能。目前 ， 由于擬南芥功能基因組 已經(jīng)研究 得比較深入，所以許多人以它作為比較 的 模板 。隨著單子葉模式生物水稻基因組研究的進(jìn)一步深入， 以 單子葉植物 為 研究 對(duì)象 科學(xué)家們將會(huì)有更多的選擇余地 。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 3 麥基因組學(xué)研究現(xiàn)狀 小麥為世界 上種植面積最廣的 大糧食作物 （占作物種植總面積的 17） ， 是世界上 40人口的主要糧食來(lái)源， 然而由于小麥基因組龐大 (010)，重復(fù)序列多（ 約 90%），小麥基因組研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落 后于基因組較小的模式植物，這與小麥在世界糧食生產(chǎn)中的地位極不相稱 。雖然水稻作為單子葉植物的模式生物已經(jīng)完成全基因組測(cè)序，但研究表明它與小麥之間存在很大的差異，只有深入研究小麥基因的結(jié)構(gòu)和功能，才能使小麥科學(xué)取得突破性進(jìn)展，進(jìn)而促進(jìn)小麥的生產(chǎn)。 由于小麥在世界糧食生產(chǎn)上的特殊經(jīng)濟(jì)地位，世界上從事小麥生產(chǎn)的發(fā)達(dá)國(guó)家都十分重視小麥基因組學(xué)研究特別是功能基因組研究。目前的研究主要集中在 發(fā)， 菌人工染色體）文庫(kù)構(gòu)建，基因組測(cè)序和全長(zhǎng) 究四個(gè)方面。 1998 年正式啟動(dòng)的的國(guó)際小麥族 劃（ ST ，得到了大量的 列， 為小麥功能基因組研究奠定了基礎(chǔ) 。 目前 小麥 量 為552,245 條，（引自 , 2004），成為禾本科作物中 列 數(shù)量 最多的作物。小麥 劃的實(shí)施為發(fā)掘小麥新基因提供了便利條件，但由于 列一般都比較短，僅有 300 500我們提供的信息有限，僅借助小麥 列，實(shí)現(xiàn)大批量的基因功能分析還有一段距離。 構(gòu)建高質(zhì)量的 庫(kù) 是進(jìn)行重要基因克隆的一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)性工作。目前美國(guó)、法國(guó)、澳大利亞、英國(guó)、加拿大等國(guó)都在從事小麥 構(gòu)建工作，我國(guó)也構(gòu)建了六倍體小麥和烏拉爾圖小麥的 庫(kù)。 通過(guò)構(gòu)建 庫(kù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥基因富集區(qū)的克隆，為小麥基因組測(cè)序奠定基礎(chǔ)。 2003 年 8 月召開(kāi)的 國(guó)際小麥基因組大會(huì) 將小麥基因 組研究分為三個(gè)階段， 其中前兩個(gè)階段（ 2004 2008） 主要 以 構(gòu)建精細(xì)物理圖譜 為主 ，第三個(gè)階段（ 2008 2010） 開(kāi)始 實(shí)施小麥染色體上基因富集區(qū)的測(cè)序計(jì)劃 。小麥基因組計(jì)劃的啟動(dòng) 對(duì)小麥基因組研究的深入開(kāi)展無(wú)疑是很大的促進(jìn) （ ） ，但 測(cè)序 計(jì)劃 從 實(shí)施 到 完成還需要 等六年的時(shí)間 ， 這顯然 不能滿足科學(xué)家們對(duì)小麥研究的需求 。 構(gòu)建小麥全長(zhǎng) 庫(kù)是小麥基因組研究的重要內(nèi)容。 通過(guò)構(gòu)建全長(zhǎng) 庫(kù)可以不通過(guò)全基因組測(cè)序而獲 得大批表達(dá)基因的全長(zhǎng)，對(duì)小麥這樣的超大基因組作物來(lái)說(shuō)，是一種特別經(jīng)濟(jì)有效的方法。全基因組測(cè)序的基因預(yù)測(cè)是通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件來(lái)實(shí)現(xiàn)的，由于人們對(duì)植物體內(nèi)基因的拼接、修飾、加工過(guò)程缺乏足夠的了解，目前基因預(yù)測(cè)的的正確性僅有 60左右，即使是小基因組植物（如擬南芥，水稻）也是如此，通過(guò) 庫(kù)獲得的基因可以避免這一錯(cuò)誤。全長(zhǎng) 的一個(gè)完整基因，與 比，可以提供更多的信息，并可以獲得基因的旁側(cè)序列。由于全長(zhǎng) 有以上優(yōu)越性，因此近年來(lái)世界上許多國(guó)家都開(kāi)展了一全長(zhǎng) 核心的基因 組研究，包括目前已經(jīng)測(cè)序的生物，如人、小鼠、擬南芥、水稻等。目前，開(kāi)展小麥全長(zhǎng) 驗(yàn)室和美國(guó)的 司。由于全長(zhǎng) 專利密切相關(guān)，因此目前獲得的數(shù)據(jù)都未公開(kāi)。 有關(guān)全長(zhǎng) 庫(kù)在植物功能基因組研究 中 的應(yīng)用已經(jīng)在單子葉模式植物水稻和雙子葉模式植物擬南芥中得到證明（ et 2003; et 2004; et 2004）。通過(guò)構(gòu)建全長(zhǎng) 庫(kù) ， 可以跨越結(jié)構(gòu)基因組研究的初 級(jí)階段，直接進(jìn)入功能基因組學(xué)研究的高級(jí)階段。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 4 因此，必須 抓住難得的契機(jī)， 構(gòu)建小麥全長(zhǎng) 庫(kù) ， 開(kāi)展小麥功能基因組研究 ，占領(lǐng)小麥功能基因組研究的先機(jī) 。 長(zhǎng) 庫(kù)構(gòu)建 與全長(zhǎng) 庫(kù)是在基因組水平上研究某一生物特定器官，特定組織，特定的發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)的前提和基礎(chǔ)。根據(jù) 庫(kù)的構(gòu)建方法及文庫(kù)的特點(diǎn)不同可以將其大致分為以下幾類：普通庫(kù)，差減 庫(kù)，均一化 庫(kù)，全長(zhǎng) 庫(kù)以及全長(zhǎng)差減 /均一化 通 庫(kù) 普通 0世紀(jì) 80年代初期（ et 1980； et 1980），囿于選擇標(biāo)記、插入片段長(zhǎng)度和多克隆位點(diǎn)的限制，最初構(gòu)建的文庫(kù)插入片段普遍比較小，文庫(kù)篩選也非常困難。為此，前人在載體改進(jìn)上做了很多工作， 載體的類型也 由最初的質(zhì)粒載體發(fā)展到現(xiàn)今的噬菌體載體，文庫(kù)的質(zhì)量得到了大幅度的提高。但全長(zhǎng) 以得到的大部分是基因片段，不利于后期基因結(jié)構(gòu)功能的分析，尤其不適合當(dāng)今大規(guī)模發(fā)掘新基因的要求。 減文庫(kù) 減 文庫(kù)的原理 差減文庫(kù)（ 稱扣除文庫(kù)，最早出現(xiàn)于上世紀(jì) 80 年代初期（ et 1981）。其構(gòu)建的原理是從兩種遺傳背景相同或大致相同，而功能不同的材料或經(jīng)過(guò)不同處理的材料或植物的近等位基因系提取 反轉(zhuǎn)錄成 在一定條件下用遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量但不含目的基因的 含有目的基因的 檢測(cè)方 行雜交，選擇性地除去部分共同的表達(dá)產(chǎn)物，收集未雜交目的產(chǎn)物，構(gòu)建成 庫(kù)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以將 品中大 量相同的基因除去，使差異表達(dá)的基因得以富集。差減雜交是構(gòu)建差減文庫(kù)的核心，差減文庫(kù)的質(zhì)量如何很大程度上取決于雜交效率的高低。 減 庫(kù)的構(gòu)建方法 目前，根據(jù)差減雜交的策略可以將差減文庫(kù)的構(gòu)建方法分為以下幾種：（ 1）羥基磷灰石柱層析法（ 該方法最早出現(xiàn)在 20 世紀(jì) 80 年代初期 （ et 1983），在差減雜 交研究的早期應(yīng)用較多。其基本原理是基于羥基磷灰石對(duì)單鏈和雙鏈的吸附能力不同。當(dāng)將雜交后的混合物