【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）小麥（Triticum aestivum L.）耐鹽相關(guān)基因的克隆及特性分析生物化學(xué)與分子生物學(xué)博士論文

i 密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 小麥（ .）耐鹽相關(guān)基因的克隆及特性分析 .) h. D. .) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 i 摘要 鹽漬化是作物生產(chǎn)中常遇到的自然逆境之一，在沿海地區(qū)和干旱、半干旱地區(qū)尤為突出，鹽脅迫嚴(yán)重限制了植物生長(zhǎng)，致使植物枯黃、萎蔫，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，作物顆粒無收。 培育耐鹽堿的作物品種是改良和利用鹽堿地資源比較經(jīng)濟(jì)、有效的措施之一，其前提是對(duì)耐鹽機(jī)制的深刻了解和耐鹽相關(guān)基因的克隆及其功能研究。 以耐鹽性受主效基因控制 的小麥品系 98材料，利用 術(shù) 研究了 98迫時(shí)間分別為 0, 15261224 72用約200 對(duì) P/M 引物組合，共得到 500 多條差異片段，從中隨機(jī)選取 233 個(gè)進(jìn)行二次擴(kuò)增，成功擴(kuò)增并克隆、測(cè)序的有 112 個(gè)。 它們分別與絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶、鋅指蛋白、抗病相關(guān)蛋白、液泡膜 亞基、泛素羧基末端水解酶、泛素相關(guān)蛋白以及受體激酶等有較高的同源性。 對(duì)結(jié)果表明，與已知基因有同源性的 片段有 73 條，約占測(cè)序數(shù)的 編碼未知功能蛋白的基因有 25 條，約占 另有 14 條片段與已知基因或序列無任何同源性，可能是尚未發(fā)現(xiàn)的新基因。 采用 法，首次克隆了小麥 個(gè)乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的負(fù)調(diào)節(jié)因子。該基因全長(zhǎng) 2635碼 759 個(gè)氨基酸，在基因的 3端有一個(gè)非常保守的絲氨酸 /蘇氨酸結(jié)構(gòu)域。在此結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)與 合位點(diǎn)和一個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合位點(diǎn) 。 析表明， 表達(dá)受鹽、干旱和低溫的誘導(dǎo)，其表達(dá)還受 制，解除 迫后，該基因的表達(dá)又逐漸 恢復(fù)。 交結(jié)果表明，該基因在小麥中以基因家族形式存在。 以 基礎(chǔ)載體，成功構(gòu)建了 植物表達(dá)載體，并進(jìn)行了煙草轉(zhuǎn)化。 測(cè)結(jié)果表明 對(duì)照中均未檢測(cè)到該基因的表達(dá)。 過量表達(dá) 00培養(yǎng)基上葉片黃化，耐鹽性下降，說明 能在小麥鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中起負(fù)調(diào)控作用。 通過電子克隆結(jié)合 方法，成功克隆了小麥的泛素相關(guān)蛋白的全長(zhǎng) 長(zhǎng) 2894碼 870 個(gè)氨基酸，在基因的 3端有一個(gè)非常保守的泛素相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域，在基因的中部有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。第 544 到 565 位氨基酸組成一個(gè) 22 個(gè)氨基酸的外向型跨膜結(jié)構(gòu)域。 果顯示，在葉片中，該基因在鹽脅迫的早期表達(dá)量降低，在 24小時(shí)以后又增強(qiáng)。而在根中，該基因的表達(dá)受鹽的抑制。 表達(dá)還受干旱和低溫的誘導(dǎo) 。 它的表達(dá)沒有明顯影響。 果顯示，該基因在普通小麥中 可能為單拷貝 基因 。以 基礎(chǔ)載體，構(gòu)建了 植物表達(dá)載體。 通過電子克隆 結(jié)合 方法，我們克隆了小麥液泡膜 亞基的全長(zhǎng) 長(zhǎng) 1369碼 380 個(gè)氨基酸，在基因的 5端有一個(gè)非常保守的 亞基結(jié)構(gòu)域。在鹽脅迫的早期，該基因的表達(dá)基本穩(wěn)定，隨后表達(dá)降低，以后又升高，說明該基因與鹽脅迫的適應(yīng)有關(guān)。干旱脅迫對(duì)該基因的表達(dá)模式與鹽脅迫一致。但低溫對(duì)其表達(dá)有明顯的抑制作用。 其表達(dá)沒有影響。該基因在 A、 D 三個(gè)基因組中各有一個(gè)拷貝，但在 因組雜交信號(hào)明顯加強(qiáng)。在普通小麥（六倍體）中也只有 一個(gè)拷貝。用缺四體對(duì)該基因進(jìn)行定位發(fā)現(xiàn)該基因 可能 位于 1B 或 7B 染色體上。以 基礎(chǔ)載體，構(gòu)建了 植物表達(dá)載體。 利用 功克隆了一個(gè)小麥 該基因全長(zhǎng) 1761國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 碼 400 個(gè)氨基酸。在該基因的 N 端，有一個(gè)約 50 個(gè)氨基酸組成的 構(gòu)域。第 247 到 266 氨基酸組成一個(gè) 20 個(gè)氨基酸的內(nèi)向型跨膜結(jié)構(gòu)域，第 248 到 266 位氨基酸組成一個(gè) 19個(gè)氨基酸的外向型跨膜結(jié)構(gòu)域。 交結(jié)果顯示，該基因在小麥中可能為單拷貝 基因。以 基礎(chǔ)載體，構(gòu)建了 植物表達(dá)載體。 通過電子克隆結(jié)合 法，克隆了小麥泛素羧基末端水解酶基因 基因全長(zhǎng)3161碼 932 氨基酸，在中部和 C 末端各有一個(gè)非常保守的 構(gòu)域。 交結(jié)果顯示，該基因在小麥中可能為多拷貝基因。 關(guān)鍵詞：小麥，耐鹽，基因克隆，表達(dá)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 is a of its in in of to is to to is to of of 98is a 8, 15261224 200 00 P/M 233 to be of 12 of 3 of 25 2.3 of 4 or be is a in of 635 59 a at TP a in by is a of a An on in no in is a of in an in 894 70 is a at a in An 44 65 in in at of 4 by 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 iv no on be a in An on of a 369 a 80. is a at at of it in it be to of on no on a , SS S a in B B An on in 761 a 00. at An 47 66 an 4866 to is a in An on An in 161 32 a in is a in 目錄 v 目錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一節(jié) 植物耐鹽的分子機(jī)制 1 成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) 1 節(jié) 體內(nèi)的分布 2 累 白 4 第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子在植物耐鹽中的重要作用 4 第三節(jié) 植物鹽脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)途徑 6 號(hào)傳導(dǎo)途徑 6 號(hào)傳導(dǎo)途徑 7 它蛋白激酶參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑 8 第四節(jié) 白在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能 10 白的結(jié)構(gòu) 11 植物生長(zhǎng)發(fā)育及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的功能 11 合體的調(diào)控 14 第五節(jié) 研究目的和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 15 究目的和意義 15 術(shù)路線 16 第二章 利用 術(shù)分離與小麥苗期耐鹽性相關(guān)的 段 17 料和方法 17 料和試劑 17 法 17 結(jié)果與分析 24 麥根總 取 24 鏈 合成 24 24 異片段的二次擴(kuò)增 25 異片段的克隆 26 異表達(dá)片段的序列分析和 對(duì) 26 論 26 子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與小麥的耐鹽 性有關(guān) 27 麥耐鹽性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑 28 素在小麥耐鹽性信號(hào)傳導(dǎo)中的可能作用 28 脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑與其它信號(hào)傳導(dǎo)途徑的交叉 29 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 三章 小麥 因的克隆及表達(dá) 30 料和方法 30 料和試劑 30 法 30 果 41 因 3 5 段的擴(kuò)增 41 因 全長(zhǎng) 獲得 42 生物信息學(xué)分析 42 因的 析 47 因的表達(dá)分析 47 因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 48 基因植株的 測(cè) 49 基因植株的 表達(dá)分析 50 基因植株的 耐鹽性檢測(cè) 50 論 51 第四章 小麥 因的克隆和表達(dá) 53 料和方法 53 料和試劑 53 法 53 果 56 長(zhǎng) 克隆 56 因的生物信息學(xué)分析 56 因的 交分析 61 因的 交分析 61 因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 62 論 63 第五章 小麥 克隆和表達(dá) 65 料和方法 65 料和試劑 65 法 65 果 67 長(zhǎng) 克隆 67 因的生物信息學(xué)分析 68 因的 交分析 71 因的 交分析 72 因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 72 論 73 第六章 小麥 因的克隆和特性分析 76 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 料和方法 76 料和試劑 76 法 76 果 78 子延伸 78 3段的克隆 78 長(zhǎng) 克隆 78 生物信息學(xué)分析 79 交結(jié)果 84 論 84 第七章 小麥 因的克隆和特性分析 86 料和方法 86 料和試劑 86 法 86 果 88 3段的克隆 88 長(zhǎng) 克隆 89 因的生物信息學(xué)分析 89 交結(jié)果 93 論 95 結(jié)論 98 參考文獻(xiàn) 99 主要試劑的配制 I V 致謝 者簡(jiǎn)歷 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 植物耐鹽性研究具有十分重要的意義。全世界 約有 4 億多公頃鹽漬化土壤，僅我國(guó)就有 7000多萬公頃（次生鹽漬化土壤除外） ，且主要分布在糧食主產(chǎn)區(qū)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅（ 000）。 在 20 世紀(jì) 90 年代，世界人口的增長(zhǎng)速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過糧食產(chǎn)量的增長(zhǎng)速度 (999)。如果作物育種學(xué)家不能培育出更多更好的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的糧食作物新品種而使這種趨勢(shì)發(fā)展下去的話， 在 21 世紀(jì) 的今天 ，我們會(huì)面臨更加嚴(yán)峻的糧食短缺問題。 隨著分子生物學(xué)、遺傳 學(xué)及各種相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)植物耐鹽性的研究已逐漸從傳統(tǒng)的生理學(xué)水平上升到今天的分子水平。利用化學(xué)誘變、 入、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等技術(shù)得到的各種突變體使我們可以更加準(zhǔn)確的研究基因的表達(dá)和功能，利用各種生化及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)可以研究基因的時(shí)空表達(dá)和蛋白 物信息學(xué)是我們進(jìn)行分子生物學(xué)研究的有力工具。在此基礎(chǔ)上，越來越多的鹽脅迫相關(guān)基因及信號(hào)傳導(dǎo)組分基因被分離和鑒定，從而為我們了解植物耐鹽性及其信號(hào)傳導(dǎo)提供了越來越多的證據(jù)，為利用基因工程提高植物的耐鹽性奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 第一節(jié) 植物耐鹽的 分子機(jī)制 鹽脅迫嚴(yán)重限制了植物生長(zhǎng)，致使植物枯黃、萎蔫，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，顆粒無收。 鹽脅迫對(duì)植物的傷害主要有兩個(gè)方面，一是離子脅迫。由于離子脅迫的毒害作用，植物體內(nèi)的活性氧自由基增加，過氧化作用加劇，造成膜脂或膜蛋白損傷，質(zhì)膜透性增加，胞內(nèi)可溶性物質(zhì)外滲（ et 2002） ；二是滲透脅迫。鹽分使土壤中的水勢(shì)降低，使植物因吸水困難而產(chǎn)生生理干旱。 與此相適應(yīng)，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了自己的適應(yīng)機(jī)制，主要通過合成各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)緩解由鹽脅迫帶來的滲透脅迫，通過調(diào)節(jié) 其它離子在 體內(nèi)的分布來緩解離子脅迫。此外，植物還通過積累一些脅迫誘導(dǎo)蛋白，參與植物的防御代謝（王忠華等， 2002）。 成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) 植物在受到鹽脅迫時(shí)會(huì)合成和積累一些有機(jī)溶質(zhì)，使細(xì)胞免受滲透脅迫。這些可溶性溶質(zhì)的共同特點(diǎn)是：易溶于水，高濃度時(shí)不干擾代謝，可保護(hù)植物在受到鹽脅迫時(shí)酶的活性而對(duì)電荷平衡沒什么影響。這些有機(jī)溶質(zhì)包括糖類（海藻糖和蔗糖）、糖醇（甘油、甘露醇、山梨醇）、氨基酸及其衍生物（脯氨酸、甘氨酸甜菜堿）等。滲透調(diào)節(jié)劑的合成途徑一般都與生物體內(nèi)的基礎(chǔ)代謝相關(guān)聯(lián)。將這種分支途徑引入缺乏有效滲 透調(diào)節(jié)劑合成植物的基因工程已初見成效，一般都可或多或少的改善轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。 甜菜堿是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的滲透保護(hù)劑。在細(xì)菌中，甜菜堿由膽堿經(jīng)膽堿氧化酶（ 步催化合成。目前，已在水稻和擬南芥中克隆了 因（ et 997）。將入水稻，轉(zhuǎn)基因植株高度耐鹽（ et 2002）。在高等植物中，甜菜堿由膽堿經(jīng)兩步催化反應(yīng)合成，這兩個(gè)酶分別為膽堿加單氧酶（ 甜菜堿醛脫氫酶（ 其中，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 2 第一步是甜菜堿生物合成的限速反應(yīng)。用菠菜 探針，沈義國(guó)等（ 2001）克隆了山菠菜的 因。將 動(dòng)子連接后轉(zhuǎn)化煙草，獲得了耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植株。劉鳳華等（ 2001）將克隆的山菠菜 因經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入草莓和煙草，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯高于對(duì)照。將 動(dòng)子連接，郭北海等人（ 2000）用基因槍法將其轉(zhuǎn)入小麥，得到了抗鹽性提高的小麥植株。 脯氨酸是一種非常重要的有機(jī)溶質(zhì)，除可調(diào)節(jié)滲透壓以外，脯氨酸還具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，防止酶變性失活和保持氮含量的作用（ et 1987） 。高等植物中，脯氨酸的合成主要有兩條途徑：谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑，它們的主要區(qū)別在于初始底物不同，分別為谷氨酸和鳥氨酸。一般認(rèn)為，在滲透脅迫下，谷氨酸合成途徑是脯氨酸合成的主要途徑（ et 1993）。在谷氨酸合成途徑中