【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）苧麻莖皮cDNA文庫的構建及EST序列分析作物遺傳育種碩士論文

密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 學位論文 苧麻 莖皮 庫的構建及 列分析 of of in .)ST of of in .)ST 目 錄 摘 要 . I . 文縮略表 . 一章 文獻綜述 . 1 . 1 構建 . 2 庫的種類 . 3 庫的應用 . 5 . 6 術原理與方法 . 7 生物信息學在 . 7 在功能基因組研究上的應用 . 9 本研究的目的與流程 . 11 第二章 苧麻莖皮 庫構建 . 13 實驗材料 . 13 材料 . 13 主要試劑和常用溶液 . 13 器皿準備 . 14 培養(yǎng)基配方 . 14 主要儀器設備 . 14 實驗方法 . 15 苧麻莖皮總 . 15 分離和純化 . 15 庫的構建 . 15 結果與分析 . 18 總 提取 . 18 離純化 . 19 合成及分析 . 19 庫的質量 . 19 討論 . 21 苧麻莖皮總 . 21 庫的質量 . 22 第三章 苧麻莖皮 列與生物信息學分析 . 23 實驗材料 . 23 材料 . 23 主要試劑 . 23 培養(yǎng)基配方 . 23 主要儀器設備 . 24 實驗方法 . 24 列測定 . 24 測序 . 24 生物信息學分析 . 25 結果與分析 . 25 序起點 . 25 列的獲得 . 26 列 提交 . 27 與 據庫 . 27 對具已知功能和推測功能的 . 28 高豐度表達的基因與纖維發(fā)育相關基因 . 32 討論 . 34 . 34 對情況 . 34 莖皮的主要功能基因 分類 . 34 第四章 結 論 . 36 構建了 2個高質量的 苧麻莖皮 庫 . 36 獲得 275條有效 . 36 獲得 12類苧麻莖皮的功能基因 . 36 獲得 8個纖維發(fā)育相關基因序列 . 36 今后研究方向 . 37 參考文獻 . 38 附錄 1 測序結果示意圖 . 44 附錄 2 對 . 45 附錄 3 . 49 致 謝 . 51 作者簡歷 . 52 I 摘 要 苧麻 在我 國 有著悠久的歷史 ，是一種重要的 韌皮 纖維作物，它主要 用 作 精紡原料 ，長江流域苧麻一年收三季（頭麻、二麻和三麻）。 為了解苧麻纖維發(fā)育時期的基因表達情況，本研究 首次構建了中苧 1 號二麻和三麻的 莖皮 庫，并對二麻文庫進行 序和生物信息學分析。本研究獲得的主要結果如下： ，提取 總 純化 ，合成雙鏈 鏈上 接頭后，用限制酶 酶切并除去小于 400短鏈 于 400段連接到 - 酶切載體 ，獲得滴度為 05 05 苧麻 庫，插入片段大部分分布在 5001500間 。 庫中隨機挑選部分克隆進行測序，得到 384 條序列，根據 準獲得長度大于 150列，通過 到有效序列 275條，占總獲得序列的 非冗余 核酸 序列 數據庫 進行同源性 比對，有 序列（ 99 條）顯示與已知序列高度的同源性；與蛋白質數據庫比對時有 200 條）顯示與已知序列 有 高度的同源性。 通過 對獲得有功能描述的基因（包括功能確定和推測功能的）大致分為 12 類，其中與蛋白質合成 (關的 基因 所占比例最大，占總基因數的 能量 ( 關基因 次之，占 細胞分化 (關基因 占 細胞信號傳導 (關基因 占 代謝 (關基因 占 8%、次生代謝(關基因 占 1%、蛋白質降解 (關基因 占4%、轉運 (關基因 占 10%、抗病及防御 (關基因 占 轉錄(關基因 占 13%、細胞結構 (關基因 占 功能不明確及未分類(關基因 占 8%。 2 類基因中， 6 個 豐度較高的基因（表達頻率 4）有 42 條 占總數的 9 個 中等豐度的基因（ 2表達頻率 4）有 20 條 總數的 剩下的為低豐度表達 基因；與纖維發(fā)育的基因有 8 個， 共 14 條 占總 的 關鍵詞 ：苧麻，莖皮， 庫，表達序列標簽 .)a is an of Its is of in of to he of ST as NA .) at to ,by 00bp 05ml 05a of 00bp 500ST of 75 ST 50bp by 75 6% of 75 2 of to ,%),%),%),10%),3%),%)。 2 of 4), 4),.),ST( 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 芐青霉素 苷三磷酸 本局部相似性比對搜索工具 基對 炭酸二乙酯 化乙錠 腸桿菌 二酸四乙酸 達序列標簽 本 培養(yǎng)基 密度 合酶鏈反應 of nd 端快速擴增技術 E 緩沖液 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述 苧麻（ .)蕁麻科苧麻屬 多年生韌皮纖維作物 ，是我國主要纖維作物之一，也是 精紡 原料。早在春秋戰(zhàn)國時期我國就開始種植苧麻（李宗道等， 1989），麻織物已有上千年的歷史。我國目前是世界上最大的苧麻生產國，種植面積和總產量均約占世界的 90%以上。迄今為止，已收集、保存苧麻屬種質資源 2000 多份（揭雨成， 2000）。由于苧麻纖維細度不足，粗硬有余，在 生產應用上存在較大的局限性。目前紡織市場提倡 “綠色 +環(huán)保 ”，植物纖維特別是棉花纖維占領了大部分市場，苧麻纖維 迫切需要提高 競爭力。因此，如何培育出 優(yōu)質 、 多 抗、高產的苧麻 新 品種是目前國內外麻類 科學 工作者的研究熱點之一。 進入 21 世紀后，現代分子生物學技術發(fā)展的十分迅速，而苧麻由于雜合性和多年生特性，遺傳背景很復雜，在分子生物學尤其是功能基因組學方面一直 進度緩慢 。采用常規(guī)育種的方法，通過改良栽培措施，使苧麻的纖維品質、產量和抗性都有了較大的提高，但是還有一些問題是常規(guī)育種無法解決的，比如說 分子標記某個 與性狀有關的 基因，這種高水平的定向改良目標必須在分子水平上進行研究。 （ 1993）分離了苧麻葉綠體 因 ； （ 1998）克隆了苧麻 1， 5（ 2002） 克隆了 氫酶基因； 揭 雨成等（ 2002）用 析了苧麻不同基因型的親緣關系；周建林等（ 2005）分離了苧麻的 13 個微衛(wèi)星序列；（ 2005）分離了苧麻 26S 核糖體 陳建榮（ 2005）分離了苧麻木質素合成關鍵酶因 ； （ 2006）克隆了苧麻 因； 蔣彥波等（ 2007）構建了苧麻富含 (GA)n 微衛(wèi)星的部分基因組文庫，以 18 個微衛(wèi)星位點設計了 18 對苧麻微衛(wèi)星特異引物。但對苧麻功能基因組的研究尚未見報道。 構建 庫是研究生物功能基因組的基礎，表達序列標簽 (術 是功能基因組學研究的主要方式之一 。目前， 術已被廣泛應用于新基因的克隆、組織特異性基因表達譜分析以及基因組序列的功能注釋等許多研究領域。 序分析成為大規(guī)模獲取功能基因一種最為快捷和有效的研究手段（ et 997; et 000），已成為動植物功能基因組研究的基本工具。因此，通過建立苧麻莖皮 庫，開展 序分析，可能在短期內獲得大量的苧麻韌皮纖維功能基因表達信息，為更好的了解功能基因在莖皮組織中的表達提供分子生物學依據，從而為將來從分子水平調控苧麻的生長、發(fā)育、抗性和代謝規(guī)律打下理論基礎。 庫的構建及其研究進展 庫是基因文庫的一種?；蛭膸焓侵覆捎皿w外克隆技術得到的一個重組 子群體。按組成基因文庫的重組 段的供體來源，基因文庫可分為基因組文庫和 庫兩類。基因組文 庫 中 包括了基因組所有順序的隨機克隆片段 ； 庫中重組 段則來源于細胞中表達的 某一特定類型細胞表達的 反轉錄酶催化形成與之互補的組克隆后得到的 庫，反映的是來源細胞當時基因組表達出的基因序列信息。中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 2 基因組文庫 為研究提供 全基因材料與資料 ；而 庫在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)以及表達基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育，細胞分化，細胞周期調控，細胞衰老和凋亡等生命現象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫 。構建 庫并非最終目的，使用這些文庫才是主要目的，既從文庫中分離到人們感興趣的目的基因（沈倍奮， 2001）。 構建 庫的基本原理和方法 經典 逆轉錄引物或 隨機引物， 為 合成的 接到適當的載體中獲得文庫。 在構建 多種載體系統可供選擇，主要有 噬菌體載體系統、質粒載體系統和噬菌粒載體系統。其中 噬菌體載體系統是在 載體本身的設計方面已相當成熟。 質粒載體的體 外操作簡便，最大的優(yōu)點是能夠實現對 但利用質粒載體構建 要的缺點是文庫中含有全長 庫的庫容量相對較?。ㄉ虮秺^， 2001） 。噬菌粒載體系統 是將質粒與噬菌體人工重組形成的一種基因克隆載體，目前應用較少。 庫 構建 基本步驟包括： 提取 （ 要構建一個高質量的 庫，獲得高質量的 至關重要的，所以處理 品時必須仔細小心。由于 存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個無 的環(huán)境對于 制備優(yōu)質 重要 )；純化分離 用反轉錄酶 導下合成 1 鏈 ； 2 鏈的合成 (用 H 和大腸桿菌 合酶 I，同時包括使用 菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 接酶進行的修復反應 )； 合成接頭的加入 ； 將雙鏈 隆到載體中 ； 分析 入片斷 ， 擴增； 對 構建 的 庫進行鑒定。 圖 1經典 et 1996) of a 國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 3 庫的種類 自 1976年 建 漸 發(fā)展完善的過程。初期 于當時技術的限制，主要適合于獲得高豐度對于低豐度 了使 效滿足研究的需要，近年來， 已發(fā)展了一些構建 經典 經典 )轉錄合成 過分級分離去除小分子 下分子量較大的末端平滑化，接上接頭，克隆到能在細菌中擴增的載體中。隨著分子生物學的發(fā)展， 經典 一，低豐度表達序列在文庫中出現的機率很低，第二， 文庫克隆的片段一般較小 ，單個克隆上的 能提供的基因信息很少，大多需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因的 et 994; et 997）。 全長 全長 指從生物體內一套完整的 是 長 且可以通過基因序列比對得到 外，還可以對蛋白質序列 進行預測及進行體外表達和通過反向遺傳學研究基因的功能等。 均一化 or 均一化 某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且含量相等的 庫。 974)基于 類。隨后研究進一步表明，絕大多數基因是處于中等或低等表達豐度的，在單個細胞中含有近 1 15個拷貝，而高豐度表達基因的轉錄產物在單個細胞中最高可達 5000個左右拷貝，約占總表達量的 25。這種基因表達能力上的巨大差異成了獲得一個具有完整代表性的 表達量上的巨大差異更為大規(guī)模研究增添了困難。對單一組織的 拷貝基因序列的大量存在給基因的篩選和鑒定帶來不必要的浪費，尤其是在大規(guī)模的 991)通過基因組 構建了均一化 庫 。均一化 有利于研究基因的表達和序列分析。 這種文庫主要有三方面的優(yōu)點：第一，增加克隆低豐度 用于分析分化發(fā)育階段的基因表達及突變檢查；第二，等量化的 現基因組序列中的轉錄區(qū)，尤其是普通探針所不能發(fā)現的稀有轉錄區(qū)；第三，與原始豐度的 庫作雜交， 可估計出大多數基因的表達水平及發(fā)現一些組織表達特異的基因 現在，在構建均一化的 種主要的觀點：一種是基于復性動力學的原理， 高豐度的 低豐度的 而可以通過控中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 4 制復性時間來降低豐度；另一種是基于基因組 過 拷貝存在的 一種方法的掌握對技術的要求比較高，對多數人而言需要多次摸索才能找到最適條件；而后一種方法易于掌握，但有研究者根據復性動力學的原理也提出了其不利因素，即采用基因組 前已報到的均一化 晏慧君等， 2006)。 差減 (差減文庫也稱扣除文庫， 是反映不同組織和細胞或同一細胞在不同功能狀態(tài)下，基因表達差異的 要用于研究細胞的發(fā)育、分化、細胞周期、細胞對藥物和生長因子的誘導反應以及腫瘤等疾病的研究。其基本流程是： 使用兩種遺傳背景相同或大致相同但在個別功能或特性上不同的材料 (如不同基因處理細胞系或植物的近等基因系等 )提取 或反轉錄后合成在一定條件下用大大過量不含目的基因的一方作為驅動子 (含有目的基因的試驗方 (行雜交，選擇性的祛除兩部分共同基因雜交形成的復合物，往往進行多次的雜交 祛除過程，最后將含有相關目的基因的未雜交部分收集后，并連接到載體形成文 庫。消減雜交是構建差減 減文庫是否構建成功很大程度上決定于差減雜交的效率（ 駱蒙等，2000）。 差減雜交的方法主要有 (1)羥基磷灰石柱層析法 ( (2)生物素標記、鏈親和蛋白結合排除法； (3)限制性內切酶技術相結合的差減方法； (4)差減抑制雜交法 ( (5)磁珠介導的差減法 (其中 et 991)。 1996)依據消減雜交和抑制 抑制性消減雜交技術 (n， 主要是利用抑制兩端連接上同一接頭的同源雙鏈片段僅呈線形擴增，從而達到富集差異表達基因的目的（ 羅志勇，2003）。近年來已成功應用于植物發(fā)育、腫瘤與疾病 (et 001)、以及外界因子誘導組織細胞中相關的應答基因 (et 001)的分析和克隆。 固相 門用來獲得可再度利用的第一鏈合成池。但由于使用 合磁珠，使第一鏈不可回收的結合在磁珠上，而且以后的反應步驟也不能都在介質上進行，使得該技術應用并不十分廣泛。 998)提出了一種新的 方法，克服了以前文庫構建中存在的缺點，所用的酶和試劑與傳統方法完全相同，不同的是 合成和修飾均在固相支持物 鏈霉素偶聯的磁珠 (， 樣在反應過程中就可以簡便而迅速的實現酶和緩沖液的更換，所需時間短，從 天，并且構建的文庫適合大多數的研究目的。 固相 不損失 且污染易于控制。另外，用此方法可以得到真實的代表性文庫，它包含有短小的 是因為在克隆 之前省去了分級分離的步驟?？傊?，固相法構建 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 5 了其不足。這種方法簡便、可靠 、低廉，而且所建文庫質量高，因此它可能會替代目前流行的 庫的 應用 隨著分子生物學技術的發(fā)展，探討生物相關發(fā)生、發(fā)展的分子機制的研究炙手可熱，其中構建 便從中分離出相關基因的應用非常廣泛，已取得令人矚目的成績。 而使它在個體發(fā)育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和稠亡等生命現象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。 發(fā)現并分離克隆新基 因始終是分子生物學研究的主要任務和目的，雖然 是，應用于分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的文庫，都可以用于分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對于非全長 不管是經典的 要利用已經獲得的新 過 二，利用全長 從非全長 (1) of et 988)，也稱為錨定 oh et 989)或單向 et 989)，只需知道目的 (5 3端 (3該法的主要特點是利用一條已知序列，設計特異性引物向缺失的方向延伸，利用一條與 )(3加至第一鏈的同聚尾 (5補 的通用引物，可以從未知末端向已知區(qū)域延伸 用06 107倍的富集，結果就產生相對純的 一，從 且分析克隆是否存在缺失的片段，這一過程需要幾周的時間；而 實驗周期大為縮短，可以用更長的時間優(yōu)化實驗以產生全長 二，篩選文庫只能得到很少的 而對序列進行分析和確認。 (2)用 通過對文庫的篩選或適用簡并引物進行 常只能獲得不完整的 了得到 常要重新篩選文庫。重新篩選文庫工作量大， 應用該方法需重新提取 用 需提取 噬菌體 保守序列設計 別是在基因的兩端變異較大而中間某區(qū)域保守的情況下，用 一轉錄產物，又是存在著不同的拼接方式，通過篩庫的辦法同時將不同 拼接方式的克隆篩選出來可能性較小，而使用 利于觀察到不同的拼接方式（ 劉建喜等， 2001）。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 6 從全長 (1)標記探針 后再把這些菌落的樣品吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上；這時加入標記的探針，如果出現雜交信號，那么從盤上就可以把包含雜交信號的菌落分離、培養(yǎng)出來（ 翟禮嘉等， 2004）。以此篩選出陽性克隆，進行序列分析，以獲得 方法能避免 一種比較準確可靠的 要缺點是克隆過程需要一系列的酶促反應、產率低、費時長、工作量大。該方法適合于表達豐度高的基因的篩選分離。用于做標記探針的 這種情況下篩選出來的基因往往是已分離基因的同源基因；如果用于做標記探針的 者是特異分子標記子 么可以篩選得到新功能基因。 (2)反式 反式 鏈 尾連接，環(huán)化的 造成缺口或用 后用 2條基因特異性引物對重新線性化或變性的 式 采用了 2條基因特異性引物，因此不易產生非特異性擴增。該方法可以快速、高效地擴增 慧君等， 2006）。 目前，我國已經成功地構建了上百種 中包括芥藍（王勁 等， 2000）、番茄幼苗（李明剛 等 ， 1999）、玉米葉片（劉長征， 1995）、水稻種子（ 周兆斕， 1996） 、花粉（ 葉秋，2001） 、向日葵花蕾（ 張領兵， 2001） 、油菜花粉（ 江昌俊 ， 1995）、茶樹新梢（趙麗萍， 2004）的 于苧麻 術 隨著人類基因組計劃的完成 (et 001; et 001)，人類已邁入后基因組時代，其中一個主要目標是從測定基因組序列、揭示所有的生命遺傳信息，轉移到解讀這些序列所編碼的基因及其功能并研究基因調控機制。但要確定數萬個基因的功能和表達方式 是一項非常艱難的任務。 如何快速準確的從基因組序列中獲取生物學信息，已成為一個急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題。表達序列標簽（ 術 (et 991;et 992)就是基于這種認識而發(fā)展起來的。經過數十年的應用， 術已經成為植物基因組學研究的一個強有力的工具，雖然開展稍晚，但成就驚人。在植物中，擬南芥由于基因組小、生活周期短等特點被選為第一個開展基因組計劃的雙子葉植物，該計劃與 1991 年底實施，至今已有 個表達基因通過 鑒定出來，占擬南芥基因總數的 70%以上 (et 998)。 它的主要研究內 容包括：構建遺傳圖譜、分離和鑒定新基因、基因差異表達的研究、比較基因組學研究、制備芯片等等 (et 998; et 999; 1992)。 隨著植物 基因組計劃的開展，在基因結構、定位、表達和功能研究等方面都積累了大量的數據，如何充分利用這些已有的數據資源，加速基因 克隆 研究，同時避免重復工作，節(jié)省開支，已成為一個急迫而富有 挑戰(zhàn)性的課題，采用 生物信息學 方法延伸表達序列標簽（ 列，獲得基因部分乃至全長 第一章 文獻綜述 7 克隆，將為基因克隆和表達分析提供空前的動力，并為生物信息學功能的充分發(fā)揮提供廣闊 的空間。 術原理與方法 術是一種相對簡便和快速鑒定大批表達基因的技術。從理論上說， 每條 表了一種模板 部分序列， 是長約 150短序列，由從不同組織來源的 庫中隨機挑取克隆，在 5或 3端測序獲得。 一條典型的真核生物 子由 55端轉錄非翻譯區(qū)）、 放閱讀框）、 33端轉錄非翻譯區(qū)）和 )四部分組成。任何一個基因其子 5端和 3端的序列都是特定的，所以對應的 5端和 3端的序列 則可以特異性代表生物體某種組織某個時期的一個表達基因。 數目可以表示所代表的基因的拷貝數，一個基因的表達次數越多，能夠測得的相應 目也越多，通過分析 可得知基因的豐度和表達情況（武金華， 2004）。 技術步驟如下：基因編碼區(qū)與 據比較 尋找感興趣 度大于 100似介于 50 間） 所選 據庫比較 找出未克隆 與 據庫比較搜尋重疊群 設 計引物進行 增或篩選 庫或索取克隆號進行電子拼接獲取全長 基因定位、結構、功能檢測分析等（王忠華等， 2001）。 在 據庫進行 索 （標準：同源性介于 50%間） 在 據庫進行 析，去