【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）高效廣譜蘇云金芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建及殺蟲晶體蛋白的研究植物病理學(xué)博士論文

密級(jí)：無 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 高效廣譜蘇云金芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建 及殺蟲晶體蛋白的研究 F 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 摘 要 蘇云金芽孢桿菌（ 目前世界上應(yīng)用范圍最廣的殺蟲微生物，但是傳統(tǒng)的 株存在殺蟲譜窄、毒力低等缺點(diǎn)，因此必須通過生物技術(shù)手段構(gòu)建高效廣譜的 程菌來滿足生產(chǎn)的需要。蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性主要來源于其在芽孢形成過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白，殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制是目前國(guó)內(nèi)外研究的一 個(gè)熱點(diǎn)；在了解殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，可以通過分子設(shè)計(jì)來改變殺蟲晶體蛋白的毒力和殺蟲譜，為轉(zhuǎn)基因植物或微生物提供新的基因來源。 本論文圍繞蘇云金芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建、殺蟲晶體蛋白的分子設(shè)計(jì)、殺蟲晶體蛋白的體外結(jié)晶等方面進(jìn)行了一系列的研究，主要內(nèi)容包括： 將對(duì)鞘翅目害蟲高毒力的 因分別通過電擊轉(zhuǎn)化到對(duì)鱗翅目害蟲高毒力的野生菌株 ，得到工程菌 內(nèi)生測(cè)結(jié)果表明兩株工程菌對(duì)鞘翅目害蟲和鱗翅目害蟲都表現(xiàn)出很高的毒力，其中 鞘翅目害蟲榆藍(lán)葉甲 和馬鈴薯甲蟲的 別為 mg/mg/鱗翅目害蟲甜菜夜蛾和小菜蛾的 別為 g/g/榆藍(lán)葉甲和馬鈴薯甲蟲的 別為 mg/mg/小菜蛾的 g/程菌在田間對(duì)鞘翅目害蟲和鱗翅目害蟲也表現(xiàn)出了很好的防效。在用量為40 g/畝時(shí)， 甜菜夜蛾的防效達(dá) 在使用濃度為 1g/L 時(shí)， 馬鈴薯甲蟲的防治效果為 接近化學(xué)農(nóng)藥的防治水平，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。 通過監(jiān)測(cè)工程菌在田間的殘留、擴(kuò)散以及對(duì)非靶標(biāo)昆蟲的影響，完成了工程菌中間試驗(yàn)和環(huán)境釋放階段的安全性評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)結(jié)果表明工程菌 田間存活時(shí)間較短，擴(kuò)散范圍較小，對(duì)草蛉、瓢蟲等非靶標(biāo)昆蟲種群無不良影響。因此認(rèn)為這兩種工程菌使用安全， 對(duì)于生態(tài)環(huán)境不會(huì)造成有害影響。 為了確定 最小活性區(qū)，通過 增獲得 9 種不同長(zhǎng)度的 因片段，分別在大腸桿菌 表達(dá)。采用浸葉法測(cè)定了相應(yīng)蛋白片段對(duì)小菜蛾的殺蟲活性，最 終將白對(duì)小菜蛾的最小活性區(qū)確定在第 22氨基酸之間。 通過重疊引物 到由 白 分別與 大腸桿菌 進(jìn)行表達(dá)；提取三種蛋白，對(duì)棉鈴蟲和甜菜夜蛾進(jìn)行了殺蟲毒力測(cè)定。結(jié)果表明，與 白相比，三種嵌合蛋白對(duì)對(duì)棉鈴蟲的毒力力有不同程度的提高，但對(duì)甜菜夜蛾的毒力都有所降低。 通過高效液相色譜純化了對(duì)小菜蛾高毒 力的 白以及對(duì)甜菜夜蛾高毒力的營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白 用氣相擴(kuò)散法，探索了兩種蛋白體外結(jié)晶的條件，最終分別得到了方形的白晶體和正八面體形的 白晶體。這些結(jié)果將為這兩種蛋白的結(jié)構(gòu)與功能解析奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌工程菌，殺蟲晶體蛋白，營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白，蛋白結(jié)晶，嵌合蛋白 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 is of t as as to is by A 03 to by 033A in 033A to g/g/mg/(mg/ . P. . g/mg/ml mg/ml . . 033A 033A . 00 g/033A . at g/L. 033A is of 033A in t in on of t a of 0 of t no To of . 2 55, is in In to of by To of II to of +II II of to . of II be a to of 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 i 目 錄 緒 論 . 1 1 蘇云金芽孢桿菌 . 1 蟲 毒素 . 2 蟲蛋白與其它物質(zhì)間的增效 . 15 2 殺蟲蛋白的應(yīng)用 . 16 蟲基因植物 . 16 基因微生物 . 17 3 轉(zhuǎn)基因生物的安全性 . 19 4 本研究的立題依據(jù) . 21 5 本研究的 目的和意義 . 21 第一章 對(duì)鱗翅目和鞘翅目害蟲高毒力工程菌的構(gòu)建 . 22 1 材料與方法 . 22 驗(yàn)材料 . 22 究方法 . 24 2 結(jié)果與分析 . 30 體 構(gòu)建 . 30 組質(zhì)粒 構(gòu)建 . 31 程菌 構(gòu)建和驗(yàn)證 . 31 程菌 生長(zhǎng)特性 . 34 程菌的遺傳穩(wěn)定性 . 35 程菌的發(fā)酵 . 35 程菌的生物活性測(cè)定 . 35 3 討論 . 40 4 小結(jié) . 41 第二章 工程菌 生物安全性評(píng)價(jià) . 43 1 材料與方法 . 43 驗(yàn)材料 . 43 究方法 . 43 2 結(jié)果與分析 . 45 程菌的殘留分析 . 45 程菌的擴(kuò)散分析 . 50 程菌對(duì)其它非靶標(biāo)昆蟲的影響 . 51 3 討論 . 53 4 小結(jié) . 53 第三章 殺蟲晶體蛋白 小活性區(qū)的測(cè)定 . 54 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 材料和方法 . 54 驗(yàn)材料 . 54 究方法 . 55 2 結(jié)果和分析 . 56 列分析結(jié)果 . 56 物設(shè)計(jì) . 57 同 因片段的克隆和 檢測(cè) . 57 同 因片段的表達(dá) . 58 同 白片段的生物活性測(cè)定 . 59 3 討論 . 60 4 小結(jié) . 62 第四章 殺蟲晶體蛋白 性區(qū)的體外結(jié)晶 . 63 1 材料與方法 . 63 驗(yàn)材料 . 63 究方法 . 64 2 結(jié)果與分析 . 70 因片段的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 . 70 白的誘導(dǎo)表達(dá) . 71 白對(duì)小菜蛾的生物活性 . 72 白的分離純化 . 72 白結(jié)晶 . 73 3 討論 . 74 4 小結(jié) . 75 第五章 營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白 純化與體外結(jié)晶 . 76 1 材料與方法 . 76 驗(yàn)材料 . 76 究方法 . 77 2 結(jié)果與分析 . 78 t 因的擴(kuò)增和克隆 . 78 2.2 因的序列分析 . 79 2.3 因的誘導(dǎo)表達(dá) . 80 白對(duì)甜菜夜蛾的生物活性測(cè)定 . 81 白的分離純化 . 81 白結(jié)晶 . 81 3 討論 . 83 4 小結(jié) . 83 第六章 殺蟲晶體蛋白的分子設(shè)計(jì) . 84 1 材料和方法 . 84 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 驗(yàn)材料 . 84 究方法 . 85 2 結(jié)果與分析 . 87 同殺蟲晶體蛋白的序列分析 . 87 物設(shè)計(jì) . 87 合基因的構(gòu)建 . 87 組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和檢測(cè) . 89 合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和 測(cè) . 89 物活性測(cè)定 . 89 3 討論 . 90 4 小結(jié) . 91 第七章 結(jié) 論 . 92 參考文獻(xiàn) . 93 致 謝 . 106 作者簡(jiǎn)歷 . 108 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 插圖和附表 圖和附表 緒 論 表 1 我國(guó)分離克隆的 Bt 因 4 表 2 殺蟲晶 體蛋白結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果 5 表 3 營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白的種類 12 表 4 殺蟲作用特征 13 圖 1 蘇云金芽孢桿菌中的芽孢和晶體 1 圖 2 白的三個(gè)結(jié)構(gòu)域 5 圖 3 三維結(jié)構(gòu) 6 圖 4 雙元毒素的結(jié)構(gòu) 6 圖 5 白氨基酸序列的保守區(qū) 8 第一章 表 1株與質(zhì)粒 23 表 1程菌中 粒的遺傳穩(wěn)定性 35 表 1033A 和 室內(nèi)對(duì)榆藍(lán)葉甲的殺蟲活性 36 表 1程菌對(duì)馬鈴薯甲蟲的生測(cè)結(jié)果 36 表 1程菌對(duì)椰心葉甲的生測(cè)結(jié)果 37 表 1033A 和 室內(nèi)對(duì)小菜蛾的殺蟲活性 37 表 1程菌株在室內(nèi)對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲活性 37 表 1程菌對(duì)棉鈴蟲的生測(cè)結(jié)果 （ 38 表 1程菌田間對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲活性（ 38 表 1程菌田間對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲活性（ 39 表 1程菌田間對(duì)馬鈴薯 甲蟲的防治效果 39 表 1黃條跳甲的防效 40 圖 1體質(zhì)粒 建的物理圖譜 25 圖 1體質(zhì)粒 建的物理圖譜 26 圖 1組質(zhì)粒 工程菌的構(gòu)建技術(shù)路線 27 圖 1-4 粒及酶切分析圖譜 30 圖 1-5 粒及酶切分析圖譜 31 圖 1-6 粒及酶 切分析圖譜 31 圖 1033A、 因的 定 32 圖 1源于 粒酶切圖譜 32 圖 1程菌株中表達(dá)蛋白的 測(cè)結(jié)果 32 圖 1同時(shí) 間 因的表達(dá)情況 33 圖 1同