微生物次生代謝產(chǎn)物研究方法-3.ppt

1、第三講 色譜學(xué)原理與實(shí)際應(yīng)用（2） 非常壓色譜,減壓柱 中低壓柱 高壓液相色譜 氣相色譜,減/加壓的目的： 實(shí)現(xiàn)快速分離或?yàn)檫m應(yīng)分辨率高但流速慢的小粒度固定相,3.1 減壓柱層析（抽柱 Vacuum Liquid Chromatography),1 簡(jiǎn)介 簡(jiǎn)便、實(shí)用、快速的層析方法，其基本原理與吸附層析相同，適用于較大量的制備性分離或提取物的極性分段劃分。（粗分） 2 操作 VLC柱（或布氏漏斗）、磨口收集瓶（或抽濾瓶）、真空泵。 a 裝柱（抽實(shí)） b 上樣（一般干法，抽實(shí)） c 洗脫（低極性逐漸到高極性的梯度洗脫，每次都抽干，類似 pTLC多次展開(kāi)的過(guò)程） d 收集 3 注意事項(xiàng) a 真空度

2、 2070 mmHg b 洗脫劑極性 由小到大梯度遞增 c 交叉色帶,3.2 中低壓柱層析,1）快速色譜（ 閃式柱層析，F(xiàn)lash Chromatography ） 1 簡(jiǎn)介 柱短（20cm），分離時(shí)間短，快，分離效率高。 閃式硅膠（Flash Sicica gel，230400目，球形） 加壓層析 約2 bar 10mg-10g 樣品 10-15min 2 用途 常用于快速分段/初步純化，尤適于常壓柱上長(zhǎng)時(shí)間分離過(guò)程中易分解的化合物，拖尾少 3 操作 與普通柱層析法基本相同。 a 裝柱：濕法 干法（20cm） b 上樣：拌樣 濕法 c 洗脫：Rf 0.2-0.3 加壓,1atm=10bar=

3、106Pa=760mmHg,2）低壓柱 適用樣品：10 mg1 g 壓力小于5 bar 固定相：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、反相硅膠等各種分離材料，普通粒度，因此在低壓下也有較快流速。吸附也不是特別嚴(yán)重。 一般配有自動(dòng)收集器、紫外監(jiān)測(cè)器和低壓恒流泵/氮?dú)馄浚械倪€可聯(lián)機(jī)監(jiān)控、操作和分析。 有些商品化的預(yù)制色譜柱，如E. Merck公司產(chǎn)的Lobar柱系列產(chǎn)品（粒度150250目），其分離效果有時(shí)可接近HPLC的分辨率，但載樣量遠(yuǎn)超過(guò)制備型HPLC。 也可自己裝填。,2）中壓液相色譜系統(tǒng)（ Medium-pressure LC ） 適用樣品：100 mg100 g 壓力540 bar 固定相：硅膠、氧

4、化鋁、聚酰胺、反相硅膠等各種分離材料，較細(xì)較均勻顆粒（硅膠常直接用薄層層析材料（粒度15um，約700目），分辨率很高，但常壓下基本流不動(dòng)，在中壓下才有較快流速。有一定程度的吸附。 均配有自動(dòng)收集器、紫外監(jiān)測(cè)器和壓力輸液泵，有的還可聯(lián)機(jī)監(jiān)控、操作和分析。如BUCHI公司生產(chǎn)的中壓液相系統(tǒng)，還配有一系列規(guī)格的耐壓玻璃塑料加強(qiáng)色譜柱，其中有些為預(yù)制柱，如反相柱，有些可自己裝填分離材料。還可選配其它類型的監(jiān)測(cè)器如示差折光監(jiān)測(cè)器。,2 操作 a 裝柱（氮壓） b 上樣（干法或濕法，樣品柱） c 洗脫（所有管材均耐壓耐溶劑） d 收集（較智能化自動(dòng)收集，等時(shí)間或按峰收集）,3.3 高壓液相色譜系統(tǒng)（Hi

5、gh Pressure LC，High Performance LC）,化合物分析與制備分離的強(qiáng)大武器,高壓液相色譜法是在經(jīng)典色譜和氣相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，在色譜理論方面沒(méi)有本質(zhì)的差別。但由于采用了高效固定相、高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器等新技術(shù)，因而有了更高的分離效率并實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。,六大系統(tǒng)：輸液、進(jìn)樣、色譜柱、檢 測(cè)、記錄與數(shù)據(jù)處理、（收集）,生產(chǎn)商：Agilent、Waters、島津、Dionex、國(guó)產(chǎn),固定相： 一般為 化學(xué)鍵合 固定相,附：手性柱,檢測(cè)器,專用型檢測(cè)器,通用型檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器（UVD）,熒光檢測(cè)器（FLD）,電化學(xué)檢測(cè)器（ECD）,示差折光檢測(cè)器（RID）,蒸

6、發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）,（10-9 g/ml）,（10-12 g/ml, 用途窄）,（10-9 g/ml, 用途窄）,（10-8 g/ml，流動(dòng)相需揮發(fā)性，且不可含鹽，有樣品損失）,（低，？g/ml）,利用樣品池和參比池之間折光 指數(shù)的差別來(lái)對(duì)組分進(jìn)行檢測(cè)。 折光指數(shù)的差別與組分的濃度 成正比,離子、氧化還原物質(zhì),可被激發(fā)產(chǎn)熒光的物質(zhì),固定波長(zhǎng)（254nm）,任意可調(diào)波長(zhǎng)（但只能同時(shí)用一種波長(zhǎng)檢測(cè)）,光電二極管陣列型（PDAD）,可對(duì)每一個(gè)峰同時(shí) 連續(xù)波長(zhǎng)掃描，得 到時(shí)間、吸光度、 波長(zhǎng)的三維光譜 色譜加和圖,（對(duì)溶劑本身有響 應(yīng)，噪音大，基線 漂移厲害，不適合 梯度洗脫）,HPLC用途,

7、指紋圖譜分析（成份展示、比較與定性） 定性與定量分析（如比較鑒別、含量測(cè)定） 色譜條件選擇 制備分離 純度分析,傳代菌株次生代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的指紋圖譜分析,菌株比較、發(fā)酵條件比較等等,分析型、半制備型、制備型HPLC,RP-HPLC使用方法,1. 溶劑需超聲脫氣 2. 樣品的前處理（抽干，除雜: 濾膜，離心；預(yù)柱/小反相柱） 3. 樣品溶成合適濃度 4. 手動(dòng)進(jìn)樣的操作（六通閥） 5. 進(jìn)樣量的摸索（在保證色譜峰分離效果的前提下盡量多進(jìn)樣，特別是 分析性和半制備型用于制備分離） 6. 等度洗脫與梯度洗脫 7. 多次進(jìn)樣的洗脫流程的一般組成（預(yù)平衡；分離洗脫階段、 洗柱階段、平衡階段） 8. 合適

8、洗脫流程的摸索（先連續(xù)梯度，再縮小范圍找到合適的等 度或梯度范圍；盡量縮小非分離時(shí)間段， 兼顧分離效果與分離周期） 9. 柱子的保養(yǎng)與儲(chǔ)存（異丙醇/氯仿1：1，純乙腈保存）,舉例：等度/梯度洗脫的選擇,1. 等梯度洗脫試驗(yàn),2. 梯度或等度,3. 優(yōu)化,RP-HPLC分離效果的優(yōu)化,要分離好的好，有兩條途徑：一是譜帶窄，即柱效高；再就是譜帶間距離大。 Rs=(t2-t1)/(1/2(w1+w2) t1，t2 為二相鄰譜帶間的保留時(shí)間，w1和w2為它們基線處的峰寬。Rs為其分離度。Rs1.5時(shí) 為完全分離。 當(dāng)峰發(fā)生重疊時(shí)，難以準(zhǔn)確測(cè)量到基線處的峰寬，更的辦法好是用半高處的相應(yīng)峰寬1和2： Rs

9、= 1.18(t2-t1)/ (1+2) Rs1.25在一般情況下，能達(dá)到99的分離度。 Rs1.0時(shí) 定量分析一般精密度較差。,加大洗脫強(qiáng)度,減小洗脫強(qiáng)度， 更換系統(tǒng)，改性劑,分離度與溶劑強(qiáng)度的關(guān)系,Rs=(1/4)(-1)N0.5k/(1+k) k為容量因子；為分離因子；N為理論塔板數(shù)。 對(duì)于RP柱，溶劑極性增大，k 增大，Rs增大，滿意的范圍 2k5 在反相HPLC中溶劑極性會(huì)隨著水/有機(jī)流動(dòng)相中的水增加而增大，洗脫強(qiáng)度變小，分離度提高，見(jiàn)下頁(yè)圖。,降低流速也可以提高塔板數(shù)，改善分離度 延長(zhǎng)梯度時(shí)間也可改善分離度 更換流動(dòng)相系統(tǒng)（分離因子a),加大水的比例，可改善分離度，但分離周期也相應(yīng)

10、拖長(zhǎng),困難樣品：多元梯度,小結(jié),譜峰拖尾,雙保留效應(yīng) 柱壞 污物在柱進(jìn)口處堆積 樣品超載 樣品溶劑不合適（析出） 緩沖不足 重金屬污染,超載，析出，柱壞,雙峰,定性與定量分析,定性分析： 1. 保留時(shí)間（在相同色譜條件，包括柱溫相同的條件下，與已知對(duì)照比較） 2. 峰高增加（把已知物加到試樣中，看組分峰的增高給予定性） 3.利用資料數(shù)據(jù)定性：目前資料數(shù)據(jù)很多，已有專著和數(shù)據(jù)庫(kù)。這些數(shù)據(jù)，常以相對(duì)保留值、比保留值、保留指數(shù)等形式提供。 4. HPLC-MS,HPLC-NMR,HPLC-FTIR等聯(lián)用技術(shù),相對(duì)保留值：在相同色譜柱及相同操作條件下，組分的調(diào)整保留值與標(biāo)準(zhǔn)物調(diào)整保留值的比值,定量分析

11、,1. 峰面積、峰高的測(cè)量 色譜工作站自動(dòng)計(jì)算積分 2. 定量方法 面積歸一化法 （校正因子） 外標(biāo)法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法，外標(biāo)一點(diǎn)法 內(nèi)標(biāo)法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法，內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法 （類似物作為基準(zhǔn)物）,峰面積（高）與含量之間的關(guān)系,利用PDAD檢測(cè)器檢驗(yàn)化合物或色譜峰的純度,發(fā)光二極管陣列檢測(cè)器可記錄測(cè)量色譜峰每一點(diǎn)的連續(xù)波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)光譜圖，如果該峰為單一成分，則其峰前、峰頂及峰后每一點(diǎn)的紫外光譜圖扣除濃度因素外應(yīng)該是完全一致的；而且經(jīng)過(guò)函數(shù)變換和圖形化顯示，可表現(xiàn)為整個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)一個(gè)規(guī)則的長(zhǎng)方形，純度越好長(zhǎng)方形越規(guī)則。如果換用差別大的洗脫梯度，該峰仍呈現(xiàn)此現(xiàn)象，則基本可確定為純化合物。（例外：難分離化合物，如手

12、性異構(gòu)體）,3.4 氣相色譜應(yīng)用簡(jiǎn)介,氣相色譜：流動(dòng)相為氣體（稱為載氣）。 按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜； 按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜,氣固色譜的固定相: 多孔性的固體吸附劑顆粒。 固體吸附劑對(duì)試樣中各組分的吸附能力的不同。 氣液色譜的固定相: 由 擔(dān)體和固定液所組成。 固定液對(duì)試樣中各組分的溶解能力的不同。 氣固色譜的分離機(jī)理: 吸附與脫附的不斷重復(fù)過(guò)程； 氣液色譜的分離機(jī)理： 氣液兩相間的反復(fù)多次分配過(guò)程。,GC特點(diǎn)與在天然產(chǎn)物研究中應(yīng)用,特點(diǎn)： （1）分離效率高： 復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。 （2） 靈敏度高： 可以檢測(cè)出g.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量 （3） 分析速度快： 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。 （4） 應(yīng)用范圍廣： 適用于沸點(diǎn)低于400的各種有機(jī)或無(wú)機(jī)試樣的分析。 不足之處： 不適用于高沸點(diǎn)、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。 被分離組分的定性較為困難。,應(yīng)用（常氣相色譜質(zhì)譜連用）： 1. 揮發(fā)性成分分析 2. 脂肪酸成分分析（甲酯化） 3. 氨基酸成分分析（甲酯化） 4. 結(jié)構(gòu)鑒定中