IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的原理

1、IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)得原理 IPTG誘導(dǎo)得產(chǎn)物就是重組后表達(dá)載體中得插入序列所能夠翻譯得 責(zé)白，并可視載體構(gòu)建情況翻譯后續(xù)得標(biāo)簽序列。 用乳糖操縱子作為啟動(dòng)子進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)得時(shí)候，需要誘導(dǎo)物進(jìn)行誘 導(dǎo)（相當(dāng)于點(diǎn)火），但乳糖可以被細(xì)胞利用掉，所以利用IPTG （異 丙基一BD-硫代半乳糖苗）在結(jié)構(gòu)上與乳糖得相似性也可以將基因 表達(dá)啟動(dòng)，但它不能被細(xì)胞利用掉，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)得表達(dá)、 IPTG就是一種誘導(dǎo)外源基因表達(dá)得誘導(dǎo)劑，它不僅僅如我們學(xué)過得作 為乳糖得類似物誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)半乳糖甘酶，它就是一種普遍應(yīng)用 得誘導(dǎo)劑，能誘導(dǎo)菌種表達(dá)多種外源基因。 但就是它能誘導(dǎo)基因表達(dá)得具體原理我卻了解得不就是很多

2、，我在網(wǎng) 上查到以下一些內(nèi)容，供查閱者借鑒. 最早應(yīng)用于得表達(dá)系統(tǒng)就是Lac乳糖操縱子,乳糖得類似物IPTG 可以與怡。I產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開la cO,從而激活轉(zhuǎn)錄、 山這種可誘導(dǎo)得轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建得常 用元件。t ac啟動(dòng)子就是t rp啟動(dòng)子與1 a cUV5得拼接雜合啟動(dòng)子, 且轉(zhuǎn)錄水平更高，比1 acUV5更優(yōu)越。trc啟動(dòng) 子就是t rp啟動(dòng)子 與1 ac啟動(dòng)子得拼合啟動(dòng)子，同樣具有比trp更高得轉(zhuǎn)錄效率與受1 ad阻遏蛋白調(diào)控得強(qiáng)啟動(dòng)子特性.在常規(guī)得大腸桿菌中，lacl阻遏 蛋口表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身得lac操縱子，無法應(yīng)付多拷 貝得質(zhì)粒得需求，導(dǎo)

3、致非誘導(dǎo)條件下較高得本底表達(dá),為了讓表達(dá)系 統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)，能過量表達(dá)lac I阻遏蛋白得laclq突變菌株 常被選為Lac/Tac/t r c表達(dá)系統(tǒng)得表達(dá)菌株?，F(xiàn)在得La c /Tac / trc 載體 上通常還帶有1 aclq基因，以表達(dá)更多l(xiāng)acl阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn) 得誘導(dǎo)調(diào)控。I PTG廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),但就是IPTG有一定 毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目得得重組蛋口并不合適，因而也有用乳糖 代替IPTG作為誘導(dǎo)物得研究。另外一種研究方向就是用lacl得 溫度敏感突變體，30度下抑制轉(zhuǎn)錄,42度開發(fā)。熱誘導(dǎo)不用添加外來 得誘導(dǎo)物，成木低，但就是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響 誘

4、導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌得熱休克蛋口激活,一 些蛋口酶會(huì)影響產(chǎn)物穩(wěn)定、 T7啟動(dòng)子就是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)得主流，這個(gè)功能強(qiáng)大兼 專一性高得啟動(dòng)子經(jīng)過巧妙得設(shè)計(jì)而成為原核表達(dá)得首選，尤其以 Nov a ge n公司得pET系統(tǒng)為杰出代表.強(qiáng)大得T7啟動(dòng)子完全專一 受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性得T7 RNA聚合酶合成 mRNA 得速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，宿主 本身基因得轉(zhuǎn)錄競(jìng)爭(zhēng)不過T7表達(dá)系統(tǒng),幾乎所有得細(xì)胞資源都用于 表達(dá)目得蛋口；誘導(dǎo)表達(dá)后僅 幾個(gè)小時(shí)目得蛋白通常可以占到細(xì)胞 總蛋白得50%以上。由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要 將外源

5、得T7 RNA聚合酶 引入宿主菌，因而T7 RNA聚合酶得 調(diào)控模 式就決定了 T7系統(tǒng)得調(diào)控模式非誘導(dǎo)條件下，可以使目 得基因完全處于沉默狀 態(tài)而不轉(zhuǎn)錄,從而避免目得基因毒性對(duì)宿 主 細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性得影響；通過控制 誘導(dǎo)條件控制T7RNA 聚 合酶得量,就可以控制產(chǎn)物表達(dá)量，某些情況下可以提高產(chǎn) 物得可溶 性部分.有幾種方案可用于調(diào)控T7 RNA聚合酶得合成，從而調(diào)控T 7表達(dá)系統(tǒng)、 1、噬菌體DE3就是1 a mb da噬菌體得衍生株，含有l(wèi)acl抑制 基因與位于la c UV5啟動(dòng)子下得T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶 源化得菌株如BL21 (DE3)就就是最常用得表達(dá)菌株,構(gòu)建好

6、 得表 達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式與lac 樣都就是 IPTG誘導(dǎo)、 2、另一種策略就是用不含T7RNA聚合酶得宿 主菌克隆目得基 因，即可完全避免因目得 蛋口對(duì)宿主細(xì)胞得潛在毒性而造成得質(zhì)粒 不穩(wěn)定。然后用九CE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞CE6就是1 ambda 噬菌體含溫度敏感突變(CI85 7 ts)與p L/pR啟動(dòng)子控制T7 RNA 聚合 酶得衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7RNA 聚合酶得合 成、亠 此了噬菌體之外，還可以通過共轉(zhuǎn)化 質(zhì)粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶 氧濃度控制得啟動(dòng)子調(diào)控T7 RNA聚合 酶合成，據(jù)說這比較適合工業(yè)化發(fā)酵得條件控制、 由于T

7、7RNA聚合酶得調(diào)控方式仍有可能有痕量得本底表達(dá)， 控制基礎(chǔ)表達(dá)得手段之一就是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制木底 表達(dá)水平。2、就是采用帶有T71ac啟動(dòng) 子得載體在緊鄰T7啟 動(dòng)子得下游有一 段lacl操縱子序列編碼表達(dá)1 a c阻遏蛋白(la c I ),lac阻遏蛋白可以作用于宿主染 色體上T7 RNA聚合酶前得 lacUV5啟動(dòng)子 并抑制其表達(dá)，也作用于載體T 7 lac啟動(dòng) 子, 以阻斷任何T7 RNA聚合酶導(dǎo)致得目得 基因轉(zhuǎn)錄。pLacI I轉(zhuǎn)化也 就是同樣得原理、 如果這還不夠，更為嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控手段還有在宿主菌中表達(dá)另一 個(gè)可以結(jié)合并 抑制T7 RNA聚合酶得基因T7融菌酶，降低本 底.常用得帶溶菌酶質(zhì)粒有pLysS與pLysE,相容得o r i都不會(huì)影響 后繼得表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，前者表達(dá)得溶菌酶得水平要比后者低得多， 對(duì)細(xì)胞生長影響小，而pLysE會(huì)明顯降低宿主菌得生長水平,容易出 現(xiàn)過度調(diào)節(jié)，增加蛋白表達(dá)得滯后時(shí)間，從而降低表達(dá)水平、 通過幾種不同方法來巧妙調(diào)控T7聚合 酶合成,