骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠骨組織GABA信號通路的影響（可編輯）

1、骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠骨組織gaba信號通路的影響 暨南大 學(xué)碩士學(xué)位 論 文 題名: 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠骨組織 gaba 信號通路的影響 effect of total flavonoids of rhizoma drynariae on gaba signalling in bone tissue of ovariectomized rats作者姓名: 呂辰 鵬 指導(dǎo)教師姓名 及學(xué)位、職稱: 張榮華 博士 教授 學(xué)科、專業(yè)名稱: 中藥學(xué) 論文提交日期: 2011 年 月 論文答辯日期: 2011 年 05 月 答辯委員會主席: 吳清和 教授 論文評閱人: 吳 清和 教授 葉文 才

2、教授 學(xué)位授予單位和日期:暨南大學(xué) 2011 年月獨 創(chuàng) 性 聲 明本人聲明 所呈交 的學(xué)位 論文是本 人在導(dǎo) 師指導(dǎo) 下進行的 研究工 作及取 得的研究成果。 除了文中特別加以標注和致謝的地方外, 論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的 研究成果 ,也不包含為 獲得 暨南大學(xué) 或其他 教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同 志對本研究所做的任何貢獻均已在論文作了明確的說明并表示謝意。 學(xué)位論文作者簽名:簽字日期: 2011 年月日學(xué) 位 論 文 版 權(quán) 使 用 授 權(quán) 書本學(xué)位論文作者完全了 解 暨南 大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定, 有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的

3、復(fù)印件和磁盤, 允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán) 暨南大學(xué) 可以將學(xué)位論文的全部或部 分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索, 可以采用影印、 縮印或掃描等復(fù)制手段保存、 匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名: 導(dǎo)師簽名:簽字日期: 年 月 日 簽 字日期: 年 月 日 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向: 工作單位: 電話: 通訊地址: 郵編: 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 主要縮略語中英文對照表 縮略語 英文全稱 中文全稱 alp alkaline phosphatase 堿性磷酸酶 bmd bone mineral de

4、nsity 骨密度 bmscs bone marrow stromal cells 骨髓間充質(zhì)干細胞 bmp-2 bone morphogenetic protein-2 骨形態(tài)蛋白-2 cbf-1 core binding factor -1 核心結(jié)合因子 -1 cgrp a-calcitonin gene-related peptide 降鈣素基因相關(guān)肽 col-i collagen type i 型膠原 camp cyclic adenosine monophosphate 環(huán)磷酸腺苷 fgf fibroblast growth factor 成纖維細胞生長因子 glu glutamat

5、e 谷氨酸 gaba gamma-aminobutyric acid - 氨基丁酸 gad glutamate decarboxylase 谷氨酸脫羧酶 gabar gaba receptor gaba 受體 gat gaba transporters - 氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白 gaba-t gaba transaminase - 氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶 gh growth hormone 生長激素 igf-i insulin growth factor 胰島素生長因子- il-1 interleukin 1 白細胞介素-1 il-6 interleukin 6 白細胞介素-6 nf- nuclear f

6、actor- 轉(zhuǎn)錄核因子-暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 nmu neuromedin u 神經(jīng)介素 u npy neuropeptide y 神經(jīng)肽 y ob osteoblast 成骨細胞 oc osteoclast 破骨細胞 opg osteoprotegerin 骨保護素 pmop postmenopausal osteoporosis 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 rankl receptor activator of nf-kappa ligand 核因子- 受體活化因 子配體 sp substance p p 物質(zhì) tfrd tota

7、l flavonoids of rhizoma drynariae 骨碎補總黃酮 tgf- transforming growth factor 轉(zhuǎn)化生長因子- th tyrosine hydroxylase 酪氨酸羥化酶 tnf tumor necrosis factor 腫瘤壞死因子 vgat vesicular neurotransmitter transporter 囊泡神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白 vip vasointestinal peptide 血管活性腸肽 who world health organization 世界衛(wèi)生組織 5-ht 5-hydroxy tryptamine 5-

8、羥色胺暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 摘 要 目的: 觀察 gaba 信 號通路在 op 形成過程中的作用及骨碎補總黃酮對其影響。 方 法: 1. 將45只3月齡sd 雌性大鼠隨機分為手術(shù)組30只和假手術(shù)組15只, 手術(shù)組采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)復(fù)制op 大鼠 模型 , 造模12周 時 通過 雙能x線測量bmd 確認op復(fù)制成功后,手術(shù)組再隨機分為模型組15只和給藥組15只。 2. 按人鼠劑量換算, 給藥組大鼠給予相當于臨床成人用藥量的骨碎補總黃酮灌胃干預(yù)12周,假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。 3. 應(yīng)用 雙能x 線檢測 各 組大鼠的b

9、md ,elisa 法 觀察各組大鼠 血清gad 水平, 免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察各組大鼠股骨遠端gaba 、 gaba r1和gat1的表達,brt-pcr 觀察各組大鼠 股骨gaba r1 mrna 的表達。 b結(jié) 果: 1. 在造模12 周時,手術(shù)組和假手術(shù)組比較,大鼠身體多部位骨組織的bmd均顯著下降(p 0.05)。 2. 給藥結(jié)束后,模型組大鼠血清gad水平顯著高于假 手術(shù) 組 (p0.05 ),給藥組 較模型 組則 顯 著降 低 (p0.05 ) ,假手 術(shù) 組和 給 藥組 之間 無 顯著 性 差 異(p0.05)。 3. 給藥結(jié)束后,模型組大鼠股骨gaba 和gaba r1 的表達

10、水平 顯著高于假b手術(shù)組 (p0.05) , 給藥組較模型組則顯著降低 (p0.05) , 假手術(shù)組和給藥組無顯著性差異(p0.05 )。 4. 給藥結(jié)束后,三組大鼠股骨gat1 的表達 水平無顯著性差異(p0.05)。 - i - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 5. 給藥結(jié)束后, 模型組大鼠股骨gaba r1 mrna 的表達顯著高于假 手術(shù)組b(p0.01) , 給藥組較模型組則顯著降低 (p0.05) , 假手術(shù)組和給 藥組無顯著性差異(p0.05)。 結(jié) 論: 1. 大鼠 血清gad 水平 增高、 骨組 織gaba 和gaba

11、 r1 的表 達增 加及 股骨bgaba r1 mrna 表達 的增多可能是gaba信號通路參與op 形成的表現(xiàn)之一。 b2. 骨碎補 總黃 酮干預(yù) 后能夠降 低 大 鼠血清gad 水平、減 少股 骨gaba 和gaba r1的表達及gaba r1 mrna 表達,這可能是其防治op 的機制之一。 b b關(guān)鍵詞: 骨碎補總黃酮 ;骨質(zhì)疏松癥;- 氨基 丁酸信號- ii - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 abstract objective :to investigate the role of gaba signalling in t

12、he formation and development of op and explore the effect of total flavonoids of rhizoma drynariaetfrd on itmethods : 145 female sd rats of 3-month old were randomly divided into operation group30 rats and sham operation group15 rats. the osteoporotic model was established by ovariectomy. 12 weeks a

13、fter ovariectomy, when the op was affirmed by dualenergy x-rayabsorptiometry the rats in operation group were randomly divided into model group15 rats and treated group15 rats2according to the dose conversion between rat and human, the rats in the treated group were respectively treated with gastric

14、 perfusion of tfrd solution that amounted to the dose that used in clinic adult patients and those in the sham operation group and model group received gastric perfusion of normal saline. the gastric perfusion will last for 12 weeks3we got the bone mineral densitybmd through dual-energy x-ray measur

15、ement and the levels of serum gad was obtained by elisa. then, the expression of gaba, gaba r1 and gat1 of distal femur was checked with bimmunohistochemical techniqueand and reverse transcription polymerase chain reaction rt-pcr was applied to detect the the expression of gaba r1 mrna of bfemur- ii

16、i - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 results : 112 weeks after ovariectomy, the bmd of different parts of rats in model group was significantly lower than that of rats in sham operation groupp 0.052when the 12 weeks gastric perfusion ended, the levels of serum gad of rats in model group

17、was significantly higher than that of sham operation groupp 0.05. while the levels of serum gad of rats in treated group was significantly lower than that of model groupp 0.05, and there was no significantly difference between sham operation group and treated groupp0.053when the 12 weeks gastric per

18、fusion ended, the expression of gaba and gaba r1 of distal femur of rats in model group was significantly stronger than that bof sham operation groupp 0.05. while the expression of gaba and gaba r1 of bdistal femur of rats in treated group was significantly weaker than that of model groupp 0.05, and

19、 there was no significantly difference between sham operation group and treated groupp0.054when the 12 weeks gastric perfusion ended, there was no significantly difference in the three groupsp0.055when the 12 weeks gastric perfusion ended, the expression of gaba r1 bmrna of femur of rats in model gr

20、oup was significantly stronger than that of sham operation groupp 0.05. while the expression of gaba r1 mrna of femur of rats bin treated group was significantly weaker than that of model groupp 0.05, and there was no significantly difference between sham operation group and treated groupp0.05- iv -

21、 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 conclusions : 1it is suggested that the high levels of serum gad and the up-regulated expression of gaba, gaba r1, gaba r1 mrna of bone may be one of the b bevidences that the gaba signalling was involved in development of op2the intervention of tfrd can

22、 reduce the abnormally levels of serum gad and the up-regulated expression of gaba, gaba r1, gaba r1 mrna of bone, b bwhich may be one of the mechanisms of its treatment on opkey words : total flavonoids of rhizoma drynariae; osteoporosis; gamma-aminobutyric acid signalling- v - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對

23、去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 目 錄 摘 要. abstract 目 錄. 前 言 1 1 神經(jīng)因素與骨代謝和op1 1.1 骨代謝和op. 1 1.2 神經(jīng)纖維在骨組織中的分布. 2 1.3 神經(jīng)系統(tǒng)對骨代謝及op 的影響2 1.4 神經(jīng)遞質(zhì)與骨代謝3 1.5 - 氨基丁酸(gaba )信號通路與骨代謝 7 2 骨碎補總黃酮(tfrd )10 2.1 tfrd 在臨床防治op 中的應(yīng)用10 2.2 tfrd 對op 骨量和 骨組織形態(tài)學(xué)的影響. 10 2.3 tfrd 對op 分子生 物學(xué)的影響11 2.4 tfrd 對op 細胞生 物學(xué)的影響11 2.5 tfrd 毒理

24、學(xué)研究12 3 本課題的研究思路和意義 13 實驗研究. 15 1 實驗材料. 15 1.1 實驗動物. 15 1.2 實驗藥物. 15 - vi - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 1.3 主要試劑. 15 1.4 實驗器械. 17 1.5 實驗儀器及設(shè)備. 17 1.6 實驗試劑的配制. 18 2 實驗方法. 22 2.1 動物飼養(yǎng). 22 2.2 動物分組. 22 2.3 op 模型復(fù)制和bmd 檢測22 2.4 給藥方法. 23 2.5 標本的采集 23 2.6 血清 gad 含量的 測定(elisa 法)24 2.7 骨組織的

25、脫鈣切 片及 he 染色. 26 2.8 sabc 免疫組織化學(xué)法檢測 gaba 、gaba r1 和 gat1. 27 b2.9 rt-pcr 檢測 gaba r1 mrna 的表達. 30 b2.10 統(tǒng)計學(xué)方法. 33 3 實驗結(jié)果. 34 3.1 一般情況. 34 3.2 op 模型復(fù)制情況35 3.3 骨組織普通病理結(jié)構(gòu)的變化36 3.4 血清 gad 的表達. 36 3.5 骨組織gaba 、gaba r1 、gat1 的表 達37 b3.6 總rna 的檢測. 39 3.7 骨組織 gaba r1 mrna 的表達 39 b- vii - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對

26、去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 4 討論 41 4.1 op 大鼠骨組織中 gaba 信號通路的變化 41 4.2 骨碎補總黃酮對 op 大鼠骨組織中 gaba 信號通路的影響 42 結(jié) 論. 44 展 望. 45 附 圖. 46 參考文獻. 49 致 謝. 62- viii - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 前 言 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis ,op )是 一種慢性系統(tǒng)性骨骼疾病,以骨強度下降,易于發(fā) 生骨 折為特 征, 多發(fā)生于老 年人尤 其是絕經(jīng)后婦女 ,世界 衛(wèi)生組織(world health or

27、ganization,who )將之列為三大老年病之一。隨著社會發(fā)展,人均壽命 延長 及社會 老 齡化,op 總體發(fā) 病率 亦隨之逐 漸上 升,其 引 起的骨折可致殘、 致死, 不僅給患者個人帶來極大的痛苦, 同時也給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān) 和生 活負擔(dān) 。 所以,op 防治已經(jīng) 成 為老齡化 社會 衛(wèi)生醫(yī) 療 保健的突出問題。 1 神 經(jīng)因素與骨 代謝 和 op 神經(jīng)系統(tǒng)是機體內(nèi)起主導(dǎo)作用的調(diào)節(jié)機構(gòu), 控 制和協(xié)調(diào)著體內(nèi)器官系統(tǒng)的活動, 使之成為有機的整體, 以適應(yīng)內(nèi)、 外環(huán)境的不斷變化, 保證生命活動的正常1進行 。 機體各組織器官的生長、 發(fā)育和再生過程中, 神經(jīng)系統(tǒng)同樣起著不可

28、或缺的調(diào)控作用。 就骨組織而言, 神經(jīng)系統(tǒng)同樣發(fā)揮著重要的作用。 隨著研究的深入,人們逐漸認識到神經(jīng)系統(tǒng)在骨代謝及op 形成過程中的重要作用。 1.1 骨 代謝 和op 在人體的生長、 發(fā)育、 成熟及衰老過程中, 骨組織都在不斷地進行自我調(diào)整和自我更新, 依靠骨的構(gòu)塑(modeling)和重 建(remodeling ) 來維 持骨的分布、2質(zhì)量、 數(shù)量和微結(jié)構(gòu)的完整性 。 骨構(gòu)塑是新生骨生成、 發(fā)育和損傷修復(fù)的主 要形式,而骨重建則是成熟骨代謝的主要形式。骨重建是由成骨細胞(osteoblast ,ob )主導(dǎo)的骨形成和 破骨細胞(osteoclast ,oc )主導(dǎo)的骨吸收不斷耦聯(lián)更新的過

29、程, 每年約10% 的骨 量通過此種方式更新, 以維持骨質(zhì)量和骨強度。 在正常生- 1 - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 理狀況下, 舊骨的吸收與新骨的形成相互偶聯(lián), 使骨代謝處于一種平衡的、 連續(xù)的循環(huán)過程中以維持骨密度(bone mineral density ,bmd )及骨礦化 量;若這種偶聯(lián)被解除,且ob 的 骨形成能力下降,oc 功能過于亢進,骨吸收超過骨形成,導(dǎo)致體內(nèi)鈣磷代謝不平衡, 使骨質(zhì)大量減少, 骨的微細結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 骨脆性增加,則可發(fā)生op 。 1.2 神 經(jīng)纖 維在骨 組織 中的 分布 解剖學(xué)和免疫學(xué)研究均顯

30、示神經(jīng)纖維廣泛分布在骨組織內(nèi), 骨髓、 骨質(zhì)、 骨膜均分布著豐富的感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)纖維, 骨骼細胞周圍均可見纖細的環(huán)狀神3 5 6經(jīng)末梢, 同時與 血管伴 行 。bjurholm 等 采用神經(jīng)纖 維變性 法研究 了骨內(nèi)神經(jīng)纖維的性質(zhì)和功能, 發(fā)現(xiàn)骨內(nèi)神經(jīng)纖維有三種: 一是無髓的交感神經(jīng)纖維, 位于血管周圍, 可收縮血管, 控制血流; 二是有髓的感覺神經(jīng)纖維, 分布于血管周圍及骨髓;三是分布于骨髓內(nèi)的無髓神經(jīng)纖維,可能與調(diào)節(jié)造血功能有關(guān)。 1.3 神經(jīng)系統(tǒng) 對骨 代謝 及 op 的 影響 神經(jīng)纖維和神經(jīng)遞質(zhì)及其受體和載體, 組成了復(fù)雜的神經(jīng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。 骨組織通過神經(jīng)骨骼信號通路調(diào)節(jié)骨骼系統(tǒng)微循

31、環(huán)環(huán)境, 還直接通過感覺神 經(jīng)和交感神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì), 調(diào)節(jié)ob 及oc 的增殖、分化、 活化及礦化, 在 骨重建過程7中發(fā)揮重要作用,對op 的發(fā)病有重要影響 。 近年來許多研究表明, 神經(jīng)系統(tǒng)與8 11骨代謝的平衡及op 存在著密切的關(guān)系 。 臨床和實 驗研究 都發(fā)現(xiàn) ,交感神 經(jīng)系統(tǒng) 在骨重 建的過程 中發(fā)揮 著關(guān)鍵 的作用, 下丘腦通過腎上腺素能神經(jīng)及其神經(jīng)遞質(zhì)可以部分調(diào)節(jié)骨重建。 腎上腺素能神經(jīng)影響 著由 絕經(jīng)、 脊 髓損傷、 抑郁 、制動 等 因素導(dǎo)致 的op 形 成過 程的各個環(huán)- 2 - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影

32、響 12節(jié) 。 一項關(guān)于神經(jīng)性 厭食癥患者的研究發(fā)現(xiàn), 導(dǎo)致患者骨量丟失的原因不僅 僅13是制動,ob 中-2 腎 上腺素能神經(jīng)信號通路被激活也增加了骨量的丟失 。在ob 和oc 中都 發(fā)現(xiàn)了- 腎上腺素 及其受 體,神 經(jīng)突觸可 能就是 通過腎 上腺素受體14與骨細胞發(fā)生聯(lián)系 , 這 說明骨骼能夠以神經(jīng)自分泌的形式維持自身組織的整體穩(wěn)定與修復(fù)。 阻斷交感神經(jīng)系統(tǒng)信號還能抑制由性激素匱乏所導(dǎo)致的骨丟失, 因為-2 腎上腺素受體缺 陷小鼠表現(xiàn)高骨量顯型,去卵巢后的骨丟失也可以被抑制15。 去卵巢大鼠神經(jīng)斷 面密度明顯降低, 也證實了神經(jīng)系統(tǒng)與去卵巢所致的骨 丟16失存在著聯(lián)系 。 因此越 來越多

33、的人開始利用腎上腺素拮抗藥物來研究交感神 經(jīng)系統(tǒng) 對 去 卵巢 大鼠或 絕 經(jīng) 后婦女 骨組 織的影 響 , 為新的 抗op 藥 物的 研發(fā)提供理論依據(jù) 。實驗 研究 都 表明腎 上腺素 拮抗 藥 物對 去 卵巢 鼠 的骨 量 有提升 的作 用17 19, 在臨床研究也取得 了類似的結(jié)果,對pmop 患者給予腎上腺素拮抗藥物20 23 24干預(yù)后,患者的bmd 能得到提高 ,骨折風(fēng)險也會降低 。 1.4 神經(jīng)遞質(zhì)與骨 代謝 及 op 隨著免疫 組織化 學(xué) 技術(shù) 的發(fā)展和 應(yīng)用, 人們對 骨神經(jīng)支 配的認 識也逐 漸加深。 通過大量的實驗研究, 已經(jīng)在骨骼中檢測到了肽類、 氨基酸類、 生物原胺類

34、25等多種神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì) 。 1.4.1 降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide ,cgrp ) cgrp 是一種含有 37 個 氨基酸殘基的活性多肽,它由降鈣素基因編碼而成,在骨組織 中cgrp 主要 分布于骨 代謝 活躍、 成 骨活性較 高的 區(qū)域, 如 干骺端、骨26膜和髓腔,骨骺的分布較 骨干多, 且 多與 血管伴行 ,ob 自 身也 可自分 泌 或旁27分泌cgrp 。cgrp 對骨重建的影響一方面可 以通過調(diào)節(jié)血管的血流 量實現(xiàn),另一方面也可以通過直接影響參與骨重建的相關(guān)細胞來實現(xiàn)。 - 3 - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵

35、巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 28研究發(fā)現(xiàn),ob 和oc 都會表達cgrp 受體 ,cgrp 可以明顯刺激體外培養(yǎng) 的ob 中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate ,camp )水平, 并能使ob 內(nèi)胰島素樣生長因子-i (insulin growth factor ,igf-i )表達增多,從而增 強ob 合成29代謝的作用 ; 對于oc ,cgrp 可以 在 體外 抑制 其 前體 細胞 數(shù)量 , 使成熟oc 數(shù)30 31量也相應(yīng)減少 ,同時 也可以 抑制oc 分化 ,cgrp 還能刺激ob 中 骨 保護 素(osteoprotegerin

36、 ,opg )mrna 表達,同時 亦下調(diào) 核因子- 受體 活化因子配體(receptor activator of nf-kappa ligand,rankl )mrna 表達, 從而 可以間接的32調(diào)節(jié)oc ,維持ob 和oc 間的平衡 。 1.4.2 p 物質(zhì)(substance p ,sp ) sp 屬于速激肽家族, 來 自前速激肽原-a 基因, 為 11 肽, 速激肽受體分為nk1、33nk2、nk3, 均屬于g 蛋白耦聯(lián)受體, 其中nk1 對sp 最敏感 。sp 通 過直接或 間接作用對ob 和oc 分別 起促進或抑制作用, 從而在骨形成和骨吸收的平衡中起調(diào)節(jié)作用,對骨代謝的調(diào)節(jié)發(fā)

37、揮重要作用。 sp 能明顯增加oc 的骨 吸收陷窩面積, nk1 受體拮抗劑則能抑制sp 對oc 骨吸34收功能的刺激效應(yīng) ,sohn證實sp 是通過激活 轉(zhuǎn)錄核因子- (nuclear factor- ,35nf- ) 來 正調(diào) 節(jié)骨誘 裂發(fā)生 。 同時,sp 能 夠抑制ob 的分化 ,從 而減少骨形36 37成 。但goto 等 卻發(fā) 現(xiàn),sp 通 過刺 激ob 表達核心結(jié)合因 子-1 (core binding factor -1 ,cbfa-1 ) 、 型膠原(collagen type i ,col-i ) 和骨 鈣素 (bone gamma-carboxyglutamic-acid

38、-containing proteins ,bgp )mrna 促進其分化。 1.4.3 血管活性腸肽(vasointestinal peptide ,vip ) vip 是由副交感神經(jīng)纖 維所分泌表達的一種神經(jīng)肽, 由 28 個氨基酸組成, 為- 4 - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 38直鏈結(jié)構(gòu), 與胰泌素、 胰升糖素同一家族 。 它可以直接或通過ob 間接調(diào)節(jié)oc的活性。 vip 可以刺激小鼠顱骨ob 中白細胞介素-6(interleukin 6,il-6)mrna 的表達和蛋白的釋放, 而il-6 是一種強有力的刺激骨吸收的炎

39、癥因子, 從而促進骨吸39 收 ,這可能是因為 vip 以神經(jīng)- 免疫交互作用 的方式調(diào)控il-6 等促 進骨吸收 因40子或前促炎因子的釋放來參與 骨 吸收過程 ;同時,vip 通過vpac2 受體 激活41camp 反應(yīng)和調(diào)控il-6 從而在mc3t3-e1 細胞株里抑制ob 分化 。 1.4.4 神經(jīng)肽 y (neuropeptide y ,npy ) npy 屬于胰多肽 相關(guān)肽 ,由 36 個氨基酸 組成 ,目前發(fā)現(xiàn)了y1、y2 、y4、42y5 和y6 五種npy 受體 ,其中y1 和y2 對骨代 謝的影響最為重要 。 小鼠骨 髓細 胞可以 表 達npy-y1 受體mrnas , n

40、py 能通 過 阻斷camp 和43rankl 的 合成抑 制異 丙腎上 腺素誘 導(dǎo)的 骨誘 裂發(fā)生 。另外, 短時 間給予npy44能夠抑制ob 表達rankl ,還能使骨髓源基質(zhì) 細胞的opg 表達瞬間增多。 1.4.5 神經(jīng)介素 u (neuromedin u ,nmu ) nmu 屬于 平滑肌 收縮 多肽,廣 泛分布 于外周 器官及中 樞神經(jīng)系 統(tǒng) , 它的兩45個特異性受體介導(dǎo)了其生理作用, 分別為nmu1r 和nmu2r 。 研究發(fā) 現(xiàn),nmu基因 缺陷小鼠表現(xiàn)高骨量顯型,其ob細胞增 殖加快,骨形成功能得到促進,但46這不是有ob 獨立完成 的,而是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控下進行的

41、。 1.4.6 5- 羥色胺(5-hydroxy tryptamine ,5-ht ) 5-ht 是一種吲哚衍生物,因為最早是從血清 中發(fā)現(xiàn)的,所以又稱為血清 素(serotonin) , 它也是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì), 并廣泛存在于動植物組織當中。 5-ht- 5 - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 必須通過相應(yīng)受體 的 介導(dǎo)才能產(chǎn)生作用 。 研究發(fā)現(xiàn) , 骨 組 織中表 達 有 5-htt47 48和 5-ht 受體 ,5-ht 信號通路能通過ap1 轉(zhuǎn)錄因子參與ob 的分 化 。在小鼠體內(nèi)用選擇性 5-ht 攝 取抑制劑阻斷 5-ht

42、t 活 性能導(dǎo)致由骨形成減少,造成的骨49量下降,同樣,5-htt 基因缺失也能引起骨形成減少和骨量下降 。 1.4.7 谷氨酸(glutamate ,glu) glu 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種興奮性氨基酸,調(diào)節(jié)大多數(shù)興奮性突觸中的快速神經(jīng)傳遞, 參與神經(jīng)發(fā)育及突觸形成。 最近發(fā)現(xiàn),glu信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也存在于骨組織中,并 對骨生 物學(xué) 有 重要作 用 。 骨組 織表達 離 子通 道 型和 代謝型 谷氨 酸受 體50(glur ) 、 谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(glt ) 及參與glu信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其他成分 。用針對神經(jīng)標志物和glu 的抗體 對 大鼠骨切片進行免疫細胞化學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)骨組織存在神經(jīng)調(diào)質(zhì)glu ,glu

43、 能神 經(jīng)纖維在干骺端的骨內(nèi) 膜尤為豐富。一些ob 也含有不同量的glu, 電鏡研究也進一步證實, 有g(shù)lu 免疫反應(yīng)的神經(jīng)末端與骨細胞間存在聯(lián)系,結(jié)果 表明骨組織存在glu能神經(jīng)纖維的支配, 提示ob 與glu源性 神經(jīng)元相似,51通過囊泡胞吐直接調(diào)控glu 釋放 。此外,成 熟的oc 還可誘導(dǎo)性表達功能性glu囊泡轉(zhuǎn)運體1(vglut1 )。 glu在調(diào)節(jié)ob 成熟和oc 形成過程中起著重要的生理作用,n- 甲基-d- 天冬氨酸受體 ( n-methyl-d-aspartic acid receptor , nmdar ) 和 ampa 受體(a-amino-3-hydroxy-5-met

44、hyl-4- isoxa-zolep-propionate receptor ,ampar )激活52均可調(diào)節(jié)ob的成熟 ,nmda 可影響rankl 誘 導(dǎo)的oc 發(fā)生 。nmda 還 可通過53erk1/2信號途徑, 增強拉力牽張導(dǎo)致的ob分化 。nmdar 激活可誘導(dǎo)ob 前體增殖,并通過cbf-1 刺 激其分化,從而 促進 骨形成 ,同時nmda 激活 還可刺激54nf- 介導(dǎo)的oc 分化,并抑制成oc 凋亡,增加其數(shù)量及骨吸收 。 - 6 - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 1.5 - 氨 基丁 酸(gamma-aminobu

45、tyric acid ,gaba ) 信 號通路 與骨 代謝 gaba 是哺乳動物神經(jīng) 系統(tǒng)中最豐富和功能最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì), 在多種生理活動中發(fā)揮著重要作用。gaba 信號通 路由glu 、 谷氨酸脫羧酶 (glutamate decarboxylase ,gad ) 、gaba 、 囊泡神經(jīng)遞質(zhì) 轉(zhuǎn)運蛋白 (vesicular neurotransmitter transporter ,vgat ) 、gaba 受體 (gaba receptor ,gabar ) 、- 氨基丁酸 轉(zhuǎn)運蛋白(gaba transporters ,gat ) 、- 氨基 丁酸 轉(zhuǎn)氨 酶 (gaba tra

46、nsaminase ,55gaba-t )等組成 。 在突觸前抑制性神經(jīng)元, glu經(jīng)限速酶gad 脫羧而生成gaba,生成 的gaba由vgat 轉(zhuǎn)運至囊泡中儲存。gaba 能夠以囊泡或非囊泡(反轉(zhuǎn)運)的形式被釋放至突觸 間隙。 突觸 前 膜和突觸 后膜均 存在gabar ,gaba 結(jié)合并 激活受體誘發(fā)神經(jīng)抑制作用, 然后被gat 攝取, 轉(zhuǎn)運至周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細胞代謝, 在這些細胞中g(shù)aba 在gaba-t 的作用下代謝為琥珀酸半醛, 從而終止gaba 的神經(jīng)抑制作用。gat 存在于突觸 前膜和神經(jīng)膠質(zhì)細胞表面, 在調(diào)節(jié)gaba 作用 的強度和時56程中起著重要作用 。 它們能有效地阻止神

47、經(jīng)遞質(zhì)擴散到鄰近的突觸, 通過收 集2+神經(jīng)遞質(zhì)使之重復(fù)利用, 并能以非ca 依賴性 的方式釋放神經(jīng)遞質(zhì), 這是一種反57轉(zhuǎn)的工作模式 。 gaba 的作用是通過藥 理學(xué)、 電生理學(xué)和生物化學(xué)特性不同的三種受體亞型(gaba r ,gaba r 和gaba r ) 介導(dǎo)的。gaba r 和gaba r 是離子通道型a b c a c受體, 與gaba 結(jié)合后 , 導(dǎo)致氯通道開放, 使 氯離子內(nèi)流增加, 氯離子的跨膜流58,59動使膜產(chǎn)生抑制性突觸 后電位進而引起神經(jīng)元的抑制 ,作用持續(xù)時 間短。gaba r 屬于代謝 型受 體超家 族,是 神經(jīng) 系 統(tǒng)內(nèi)一 種主要 的抑 制 性神經(jīng) 遞質(zhì)受b體

48、, 廣泛分布在于各種神經(jīng)元的突觸前末梢和突觸后膜, 甚至分布于非突觸部位- 7 - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 60。gaba r 通過g 蛋白偶聯(lián)的第二信使系統(tǒng), 介導(dǎo)慢的、 持續(xù)時間較長的抑 制b性效應(yīng), 參與許多重要的生理活動和病理變化。 位于突觸前的gaba r 被激活后,b2+通過g蛋白阻滯鈣通道,降低ca 內(nèi)流,減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放,發(fā)揮突觸前抑制效應(yīng);位于 突觸后 膜的gaba r 被激活后 ,可通過g 蛋 白激活細 胞內(nèi)蛋白激b+酶系統(tǒng)產(chǎn)生磷酸化作用而增加鉀電導(dǎo),k 外流, 產(chǎn)生突觸后抑制效應(yīng);gaba rb的激活

49、還可影響 其他神 經(jīng)遞質(zhì)等與第二 信使系 統(tǒng)間的偶聯(lián)而抑 制其他 神經(jīng)遞質(zhì)61 64包括glu的興奮性效應(yīng) 。 有研究表明, 在 體外 培養(yǎng)的 顱骨 來源 的 成 熟及未成熟的ob 中檢 測到了gaba r mrna 和蛋白 的表達, 而沒有檢測到gaba r 和gaba r ,gaba r 激b a c b動劑能夠抑制ob 中camp 的生成并降低ob 中 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase ,2+alp )的活性以及減少ca 內(nèi)流,提示gaba 可能通過gaba r 影響ob 的代謝、b65增殖、 分化 和成 骨能 力 ,隨 后的 研究 發(fā)現(xiàn)ob 的前 體細 胞骨 髓間

50、充質(zhì)干 細胞66(bone marrow stromal cells ,bmsc )中也表達有g(shù)aba r mrna ,這進一 步b證實了ob表達gaba r 的結(jié)論。在高滲透壓環(huán)境中,顱骨來源的ob 中g(shù)aba 的b聚集增多,gat1 mrna 的表達也增多,同時在新生鼠的脛骨骨小梁表面也檢測到了gat1 的表達,持續(xù)增高的gaba 能夠明顯 改變ob 中alp 的含量 ,而gat167,68可能在這一過程中發(fā)揮了重要的作用 , 高滲透壓環(huán)境中高濃度的gaba 可能影響 了ob 代謝和成骨能力。 最新的研究發(fā) 現(xiàn),gaba r2 基因第二外顯子brs3750344 單核苷酸多態(tài)性 (snp

51、) 與bmd 有 著一定的關(guān)系,snp rs3750344 位點tt 、 tc 及cc 基因型攜帶者個體的上肢、 下肢、 軀干、 肋骨、 骨盆和全 身總bmd 、69骨礦量均依次顯著增加 。 可見,gaba 及其受體 和載體存在于骨微循環(huán)中, 發(fā)揮類似于在神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮和抑制雙向調(diào)節(jié)的作用, 對骨組織細胞增殖、 分化、 功能活動過程發(fā)生重- 8 - 暨南大 學(xué)碩 士學(xué)位論文 骨碎補總黃酮對去卵巢大鼠 骨組織 gaba 信號 通路的 影響 要影響。 骨組織內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)通過自分泌和旁分泌的方式介導(dǎo)ob 和oc 的偶聯(lián)活動, 對維持骨重建平衡有重要影響。 如果出現(xiàn)表達失常, 就會影響骨組織正常代謝并誘導(dǎo)多種骨骼疾病的發(fā)生。越來越多的研究證實神經(jīng)系統(tǒng)與骨代謝和op 形成有著緊密的聯(lián)系,這不僅為我們研究骨代謝和op 的機制指出了一個嶄新的思路,也為研發(fā)防治op 的新藥提供了重要的理論依據(jù)。9圖1 神經(jīng)因素對骨代謝的影響57圖 2 gaba 信號通路 - 9 - 暨南大 學(xué)碩 士