課題進(jìn)展匯報(bào)

1、str非變性非變性hplc快速診斷快速診斷 唐氏綜合征方法的建立及評(píng)價(jià)唐氏綜合征方法的建立及評(píng)價(jià)rapid prenatal diagnosis of down syndrome by non-denaturing high-performance liquid chromatography with short tandem repeat markers概述概述 唐氏綜合征唐氏綜合征(down syndrome，ds) ，又稱，又稱21三體綜合三體綜合征或先天愚型，是人類最常見的染色體數(shù)目異常導(dǎo)致的征或先天愚型，是人類最常見的染色體數(shù)目異常導(dǎo)致的遺傳性疾病，是先天智力低下的最常見原因。新生兒

2、發(fā)遺傳性疾病，是先天智力低下的最常見原因。新生兒發(fā)病率約病率約1/800-1/ 600。ds的遺傳分型：的遺傳分型：（1）21三體型三體型(47,xx(xy),+21，占，占92.5%（2）易位型：）易位型： 占占4.8%（3）嵌合型：）嵌合型： 占占2.7%（4）雙重三體，較罕見）雙重三體，較罕見（5）21部分三體部分三體 v新生兒的新生兒的ds發(fā)生率約為發(fā)生率約為12，我國(guó)目前大約有，我國(guó)目前大約有60萬以上的萬以上的ds患兒?；純骸該病目前缺乏有效的治療手段，預(yù)防該病目前缺乏有效的治療手段，預(yù)防ds患兒出生是防患兒出生是防治該病的主要措施。治該病的主要措施。v因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、

3、低成本、高通量、自動(dòng)因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、低成本、高通量、自動(dòng)化程度高的唐氏綜合征產(chǎn)前診斷方法對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育具有化程度高的唐氏綜合征產(chǎn)前診斷方法對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。重要意義。研究背景國(guó)內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)前診斷方法現(xiàn)狀：國(guó)內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)前診斷方法現(xiàn)狀：v超聲波篩查：通過超聲波檢查胎兒頸部半透明組織厚度、超聲波篩查：通過超聲波檢查胎兒頸部半透明組織厚度、股骨長(zhǎng)度與肱骨長(zhǎng)度、心臟異常情況、胎兒鼻骨發(fā)育情況、股骨長(zhǎng)度與肱骨長(zhǎng)度、心臟異常情況、胎兒鼻骨發(fā)育情況、孕早期胎兒靜脈導(dǎo)管血流檢測(cè)等以達(dá)到診斷目的。孕早期胎兒靜脈導(dǎo)管血流檢測(cè)等以達(dá)到診斷目的。該方法陽該方法陽性率低，假陽性率高，易漏診誤診性率低，假陽性

4、率高，易漏診誤診。v孕早、中期母體血清相關(guān)標(biāo)記物結(jié)合孕婦年齡篩查：主要孕早、中期母體血清相關(guān)標(biāo)記物結(jié)合孕婦年齡篩查：主要相關(guān)血清標(biāo)記物有相關(guān)血漿蛋白相關(guān)血清標(biāo)記物有相關(guān)血漿蛋白(ppa)、甲胎蛋白、甲胎蛋白(fp)、游、游離雌三醇離雌三醇(e3)、人絨毛膜促性腺激素、人絨毛膜促性腺激素(hcg)。檢出率為檢出率為60-70%，假陽性率，假陽性率5%。v羊水細(xì)胞培養(yǎng)、染色體羊水細(xì)胞培養(yǎng)、染色體g顯帶核型分析：經(jīng)典方法，但顯帶核型分析：經(jīng)典方法，但費(fèi)費(fèi)時(shí)長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)(2-3周周)，手工操作量大，羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率低，手工操作量大，羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率低。v熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescence

5、 in-situ hybridization，fish)：該方法準(zhǔn)確率高，但同時(shí)該方法準(zhǔn)確率高，但同時(shí)技術(shù)要求高，成本昂貴技術(shù)要求高，成本昂貴 。vpcr熒光染料定量分析法：同時(shí)擴(kuò)增熒光染料定量分析法：同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體的人肝型號(hào)染色體的人肝型磷酸果糖激酶基因磷酸果糖激酶基因(pekl2ch21)外顯子外顯子8和和1號(hào)染色體的人肌號(hào)染色體的人肌型磷酸果糖激酶基因型磷酸果糖激酶基因(pekm2ch1)外顯子外顯子9，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熒，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熒光染料標(biāo)記后，再用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)光染料標(biāo)記后，再用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行吸光度分產(chǎn)物進(jìn)行吸光度分析。該方法析。該方法操作較繁瑣，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)大人群的高

6、通量篩查操作較繁瑣，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)大人群的高通量篩查。vpcr擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，str)后，后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，進(jìn)行經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，進(jìn)行dna密度分析：該方法密度分析：該方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低，不能實(shí)現(xiàn)高通量篩查操作繁瑣，費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低，不能實(shí)現(xiàn)高通量篩查。vstr熒光定量熒光定量pcr分析方法：通過分析峰面積比值或出峰分析方法：通過分析峰面積比值或出峰個(gè)數(shù)進(jìn)行診斷。但該方法個(gè)數(shù)進(jìn)行診斷。但該方法成本較高成本較高，僅合成標(biāo)記探針就需數(shù)，僅合成標(biāo)記探針就需數(shù)千元，而且在產(chǎn)前診斷方面千元，而且在產(chǎn)前診斷方面

7、特異性稍差特異性稍差。相對(duì)以上技術(shù)而言，相對(duì)以上技術(shù)而言，dhplc技術(shù)是一種高通量、快速、技術(shù)是一種高通量、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化程度高的遺傳變異篩查準(zhǔn)確、靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化程度高的遺傳變異篩查技術(shù)技術(shù), 在非變性溫度條件下，可以對(duì)不同長(zhǎng)度的雙鏈在非變性溫度條件下，可以對(duì)不同長(zhǎng)度的雙鏈dna片段進(jìn)行分離。片段進(jìn)行分離。近期大量研究發(fā)現(xiàn)，多余的片段中含有近期大量研究發(fā)現(xiàn)，多余的片段中含有21q22帶，就會(huì)帶，就會(huì)患患ds，反之則不會(huì)患病。表明，反之則不會(huì)患病。表明21q22是是ds的關(guān)鍵區(qū)域。的關(guān)鍵區(qū)域。str均勻地分布于人類基因組中，具有高度多態(tài)性和高均勻地分布于人類基因組中

8、，具有高度多態(tài)性和高雜合度等特點(diǎn)，并遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律。雜合度等特點(diǎn)，并遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律。由此引出對(duì)本課題的研究。由此引出對(duì)本課題的研究。研究?jī)?nèi)容 str位點(diǎn)的選?。和ㄟ^網(wǎng)上資源及實(shí)際分析，選取理位點(diǎn)的選?。和ㄟ^網(wǎng)上資源及實(shí)際分析，選取理論及實(shí)際雜合度較高的論及實(shí)際雜合度較高的str位點(diǎn)。位點(diǎn)。 方法的建立與優(yōu)化：對(duì)所選實(shí)際雜合度較高的方法的建立與優(yōu)化：對(duì)所選實(shí)際雜合度較高的str位位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，利用非變性高效液相色譜技術(shù)分離擴(kuò)增，利用非變性高效液相色譜技術(shù)分離pcr產(chǎn)物中不同片段長(zhǎng)度的產(chǎn)物中不同片段長(zhǎng)度的dna片段，由不同的峰型可片段，由不同的峰型可以診斷以診斷ds

9、患者并鑒定其染色體的親代來源。患者并鑒定其染色體的親代來源。 方法的評(píng)價(jià)：用細(xì)胞培養(yǎng)、染色體方法的評(píng)價(jià)：用細(xì)胞培養(yǎng)、染色體g顯帶核型分析方顯帶核型分析方法同時(shí)對(duì)所有樣本進(jìn)行確診，與本課題所建立方法進(jìn)行法同時(shí)對(duì)所有樣本進(jìn)行確診，與本課題所建立方法進(jìn)行雙盲評(píng)價(jià)。雙盲評(píng)價(jià)。技術(shù)路線(1) 標(biāo)本的收集：收集標(biāo)本的收集：收集20例例ds家系和家系和100例正常人群外周血標(biāo)本，家系標(biāo)例正常人群外周血標(biāo)本，家系標(biāo)本每份分為兩組，一組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及本每份分為兩組，一組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及g顯帶核型分析，另一組提取顯帶核型分析，另一組提取dna。(2) str位點(diǎn)的選?。豪镁W(wǎng)上資源選取理論雜合度較高位點(diǎn)的選?。豪?/p>

10、網(wǎng)上資源選取理論雜合度較高(0.8)的的str位位點(diǎn)，然后通過對(duì)點(diǎn)，然后通過對(duì)100例正常人群標(biāo)本的分析，獲得實(shí)際雜合度較高的例正常人群標(biāo)本的分析，獲得實(shí)際雜合度較高的str位點(diǎn)。位點(diǎn)。(3) pcr條件的建立及優(yōu)化：條件的建立及優(yōu)化： pcr擴(kuò)增所選實(shí)際雜合度較高的擴(kuò)增所選實(shí)際雜合度較高的str位點(diǎn)。位點(diǎn)。(4) 非變性高效液相色譜技術(shù)診斷非變性高效液相色譜技術(shù)診斷ds方法的建立：分離不同長(zhǎng)度的方法的建立：分離不同長(zhǎng)度的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)化條件使本方法可以用于擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)化條件使本方法可以用于ds產(chǎn)前診斷并鑒定患者染色體的產(chǎn)前診斷并鑒定患者染色體的親代來源。親代來源。(5) 評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)：用細(xì)胞

11、培養(yǎng)、染色體評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)：用細(xì)胞培養(yǎng)、染色體g顯帶核型分析方法與本課題所建立顯帶核型分析方法與本課題所建立方法進(jìn)行雙盲評(píng)價(jià)。方法進(jìn)行雙盲評(píng)價(jià)。研究方案（1）首次將）首次將dhplc技術(shù)應(yīng)用于唐氏綜合征產(chǎn)前診斷的研技術(shù)應(yīng)用于唐氏綜合征產(chǎn)前診斷的研究，目前，國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)導(dǎo)。究，目前，國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)導(dǎo)。（2）本課題所選取的）本課題所選取的str位點(diǎn)均位于位點(diǎn)均位于21q22帶這一關(guān)鍵區(qū)帶這一關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)，且具有高雜合度特點(diǎn)，通過對(duì)數(shù)個(gè)域內(nèi)，且具有高雜合度特點(diǎn)，通過對(duì)數(shù)個(gè)str位點(diǎn)的同時(shí)位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)，幾乎可以對(duì)所有類型的檢測(cè)，幾乎可以對(duì)所有類型的ds做出診斷（嵌合型做出診斷（嵌合型ds患者患者體內(nèi)三體型細(xì)胞比例低者除外），可以對(duì)體內(nèi)三體型細(xì)胞比例低者除外），可以對(duì)99.9%以上的以上的ds患者做出診斷?；颊咦龀鲈\斷。（3）本方法同時(shí)具有快速、準(zhǔn)確、低成本、高通量等其它）本方法同時(shí)具有快速、準(zhǔn)確、低成本、高通量等其它方法不具備的優(yōu)點(diǎn)。方法不具備的優(yōu)點(diǎn)。特色與創(chuàng)新點(diǎn)已完成了已完成了21例例ds家系標(biāo)本的采集工作家系標(biāo)本的采集工作(細(xì)胞染色體核型分細(xì)胞染色體核型分析確診工作已完成析確診工作已完成) ，并已提取，并已提取dna，正常人群標(biāo)本，正常人群標(biāo)本100例例也