第五章重組DNA技術

1、第五章第五章 重組重組DNA技術技術以以LNX1基因的表達載體構建進行說明基因的表達載體構建進行說明第第 一一 節(jié)節(jié) 重組重組DNA技術的主要工具技術的主要工具一一 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶定義定義限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)是識別是識別DNA的特異序列的特異序列, 并在識別位點或其周并在識別位點或其周圍切割雙鏈圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H分類分類、（基因工程技術中常用（基因工程技術中常用型）型）類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結構回文結構(

2、palindrome) 切口切口 ：平端切口：平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口重組重組DNA技術中常用的工具酶技術中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能Taq酶酶用于用于PCRDNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平

3、移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標記等末端標記等反轉錄酶反轉錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標記或進行填補，標記或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶末端轉移酶在在3

4、羥基末端進行同質多聚物加尾羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第第 二二 節(jié)節(jié) 載體載體載體定義載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分分子。子。常用載體常用載體質粒質粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。設計的載體稱為克隆載體。表達載體表達載體(expression vector) 含有能被宿主細胞基因表達系統(tǒng)識別的含

5、有能被宿主細胞基因表達系統(tǒng)識別的表達元件、從而可以在宿主細胞內表達目的表達元件、從而可以在宿主細胞內表達目的基因合成目的蛋白的載體?；蚝铣赡康牡鞍椎妮d體。載體的選擇標準載體的選擇標準 復制的起始點，能自主復制；復制的起始點，能自主復制； 選擇標記，具有兩個以上的遺傳標記物，選擇標記，具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點（外源有克隆位點（外源DNA插入點），常具有插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； 分子量小分子量小，以容納較大的外源，以容納較大的外源DNA。 表達載體還要有表達元件。表達載體還要

6、有表達元件。質粒質粒 (plasmid)特點特點 能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息傳信息, , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 第第 二二 節(jié)節(jié) 重組重組DNA技術的基本原理技術的基本原理基本原理基本原理獲取目的基因，選擇載體獲取目的基因，選擇載體DNA導入受體菌導入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接切割目的基因和載體切割目的基因和載體重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達克隆基因的表達 以以 質質 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程一一 目的基因的獲取目的基因的獲取1.基因組基因組

7、DNA文庫文庫(genomic DNA library) 2. cDNA文庫文庫(cDNA library)3.聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)4.化學合成法化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列氨基酸序列 。 三三 目的基因與載體的連接目的基因與載體的連接二二 克隆載體的選擇和構建克隆載體的選擇和構建1. 平端連接平端連接適用于：限制性內切酶切割產(chǎn)生的平端適用于：限制性內切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因目的基因限制性內切酶限制性內切酶

8、限制性內切酶限制性內切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連2. 粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連不同限制酶切位點連接接 單酶切末端連接單酶切末端連接 雙酶切末端連接雙酶切末端連接Bam H切割反應切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體載體DNA用用Bam H切割切割同一限制酶切位

9、點連接同一限制酶切位點連接GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連目目 錄錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點切割位點GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位點切割位點AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切雙酶

10、切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接在末端轉移酶在末端轉移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。制造出粘性末端，再進行粘端連接。5 3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶T(T)nTA(A)nAA(A)

11、nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體目目 錄錄 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉移酶末端轉移酶+ dATP末端轉移酶末端轉移酶+ dTTP4. 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。 人工接頭及其應用人工接頭及其應用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REc

12、o R目目 錄錄受體菌條件受體菌條件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導入方式導入方式 轉化轉化 (transformation)：重組：重組DNA導入宿主導入宿主細胞的過程。細胞的過程。四四 重組重組DNA導入宿主細胞導入宿主細胞五五 篩選和鑒定重組體篩選和鑒定重組體 1. 平板篩選平板篩選 2. 酶切分析酶切分析 3. PCR分析分析 4.核酸分子雜交分析核酸分子雜交分析( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出重組重組DNADNA技術操作過程可形象歸納為技

13、術操作過程可形象歸納為 分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉轉轉入受體菌轉入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術操作的主要步驟技術操作的主要步驟載體載體質粒質粒噬菌體噬菌體病毒病毒限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉化轉化體外包裝，轉染體外包裝，轉染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物第三節(jié)第三節(jié) L

14、NX1基因的表達載體構建基因的表達載體構建1、查找基因序列，根據(jù)基因序列設計、查找基因序列，根據(jù)基因序列設計PCR引物引物 1 tttcctggtc tggagcgacc aatgccgtcc tccttcctcc aggcacctgt tcaccgaagt 61 tgaggctggt cacaactccg gcggcccaag gagctgctcg gttcacccac aaggaatgag 121 agctgcctgc ctgctgctgc ttggagagcc ccagacagtc gcttgaagag gtgtgtggat 181 gtctcctaga tcttgacttg ctcct

15、gagga aatattgtgt gactgagttt cctgttatac 241 tgctctccaa tccatcatga accagccaga gtctgccaac gatcctgaac ccctgtgtgc 301 agtgtgtggc caagcccact ccttggagga aaaccacttc tacagctatc cagaggaagt 361 ggatgatgac ctcatctgcc acatctgcct gcaggctttg ctggaccccc tggacactcc 421 gtgtggacac acctactgca ccctctgcct caccaacttc ctg

16、gtggaga aggacttctg 481 tcccatggac cgcaagcctc tggttctgca gcactgcaag aagtccagca tcctggtcaa 541 caaactcctc aacaagctac tggtgacctg cccattcagg gagcactgca cccaggtgtt 601 gcagcgctgt gacctcgagc atcactttca aaccagctgt aaaggtgcct cccactacgg 661 cctgaccaaa gataggaaga ggcgctcaca agatggctgt ccagacggct gtgcgagcct 7

17、21 cacagccacg gctccctccc cagaggtttc tgcagctgcc accatctcct taatgacaga 781 cgagcctggc ctagacaacc ctgcctacgt gtcctcggca gaggacgggc agccagcaat 841 cagcccagtg gactctggcc ggagcaaccg aactagggca cggccctttg agagatccac 901 tattagaagc agatcattta aaaaaataaa tcgagctttg agtgttcttc gaaggacaaa 961 gagcgggagt gcagtt

18、gcca accatgccga ccagggcagg gaaaattctg aaaacaccac 1021 tgcccctgaa gtctttccaa ggttgtacca cctgattcca gatggtgaaa. Sal-LNX-FP-2445 GCGTCGACTCTCCAATCCATCATGAACCAG 3Sal-LNX-FP-13095 ATGTCGACGTGGCTGACTGTGATGCGTG 3Kpn-LNX-RP-24775 ATCCATGGGATTTTTCTGTTTTCCTCTGACCC 3Sal-短LNX-FP-2835 ACGTCGACAAGGCAGCACACTGCTCGG

19、AG 3Sal-短LNX-FP-2745 ACGTCGACGCCAGGGAGAAGGCAGCACAC 3Kpn-短LNX-RP-22405 ATCCATGGTGTGATTTTTCTGTTTTCCTCTGAC 3Sal-LNX-FP-2175 ACGTCGACGTGTGACTGAGTTTCCTGTTATACTG 3Sal-LNX-FP-2805 ACGTCGACCGATCCTGAACCCCTGTGTGC 3Kpn-LNX-RP-13275 ATCCATGGTTAACGCATCACAGTCAGCCACAGC 3 2、利用設計的、利用設計的PCR引物和腦庫引物和腦庫cDNA模板進行模板進行PCR3、切膠回收、切膠回收PCR產(chǎn)物，與產(chǎn)物，與T載體進行連接載體進行連接T載體結構圖載體結構圖連接體系如下：連接體系如下：載體載體 0.5ulPCR回收產(chǎn)物回收產(chǎn)物 9.5ulSolution 10ul混勻后混勻后16水浴水浴24小時連接。小時連接。4、重組、重組T載體進行轉化培養(yǎng)以得到大量重組質粒載體進行轉化培養(yǎng)以得到大量重組質粒TOP10感受態(tài)的制備：感受態(tài)的制備：常規(guī)轉化方法：常規(guī)轉化方法：即從即從-80冰箱取出感受態(tài)冰箱取出感受態(tài)TOP10后，冰中解凍半后，冰中解凍半小時，然后加入質粒，混勻后冰中半小時，在小時，然后加入質粒，