尼可地爾預(yù)處理誘導(dǎo)心肌內(nèi)源性HSP70表達(dá)實(shí)驗(yàn)探究

1、尼可地爾預(yù)處理誘導(dǎo)心肌內(nèi)源性hsp70表達(dá)實(shí)驗(yàn)探究摘要：目的：研究尼可地爾預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)源性熱休 克蛋白70 (hsp70)表達(dá)規(guī)律，探討內(nèi)源性hsp70對(duì)離體供 心的保護(hù)作用，以尋求更為有效的延長(zhǎng)供心保存的方法。方法：選取60只成年sd大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為 2組，每組30只。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射尼可地爾15次 (0. lmg/kg, 1次/d)；對(duì)照組腹腔注射無(wú)菌生理鹽水15次 (0. lml/kg, 1次/d)。兩組大鼠分別于第1、3、6、9、15 次腹腔注射藥物24h后被處死，摘取心臟，取左心室前壁心 肌組織進(jìn)行hsp70的測(cè)定。結(jié)果:尼可地爾預(yù)處理能誘導(dǎo)心肌內(nèi)源性hsp70的表達(dá), 表達(dá)量

2、隨給藥次數(shù)的增加呈遞增趨勢(shì)。結(jié)論：尼可地爾注射液是有效的誘導(dǎo)心肌產(chǎn)生內(nèi)源性 hsp70的藥物，最佳給藥時(shí)間為連續(xù)給藥9次。關(guān)鍵詞：藥物預(yù)處理尼可地爾hsp70心臟移植【中圖分類(lèi)號(hào)】r4【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】 1671-8801 (2013) 10-0001-02器官移植的研究最先以心臟移植起步。但至今仍有很多 未解決的難題如供心的來(lái)源問(wèn)題，免疫排異反應(yīng)問(wèn)題，移植 后移植物的衰竭問(wèn)題，以及遠(yuǎn)期冠狀血管病變等急待解決。 其中供心奇缺是限制心臟移植廣泛開(kāi)展的瓶頸問(wèn)題，而尋求 安全存放更長(zhǎng)時(shí)間的供心保存方法是目前應(yīng)對(duì)這一瓶頸問(wèn) 題的主要途徑之一。熱休克蛋白(hsp)是一組所有的細(xì)胞 能在應(yīng)激情況

3、下由熱休克基因所編碼合成的序列高度保守 的伴隨細(xì)胞蛋白，并能對(duì)抗更為嚴(yán)重的應(yīng)激損傷，是一種生 物體內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)1。hsps是細(xì)胞暴露在不同應(yīng)激狀態(tài) 下所誘導(dǎo)合成的一組保守蛋白質(zhì)，能夠提高細(xì)胞在應(yīng)激情況 下的生存率2,為此，本實(shí)驗(yàn)研究尼可地爾預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi) 源性熱休克蛋白70 (hsp70)表達(dá)規(guī)律，探討內(nèi)源性hsp70 對(duì)離體供心的保護(hù)作用，以尋求更為有效的延長(zhǎng)供心保存的 方法。1實(shí)驗(yàn)材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組。選取24只成年sd大鼠，由華北 煤炭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，雌雄各半，體重250-350g,隨機(jī) 分為2組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組12只。1. 2方法。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射尼可地爾15次(0

4、. lmg/kg, 1次/d)；對(duì)照組腹腔注射無(wú)菌生理鹽水15次(0. lml/kg, 1 次/d)。兩組大鼠分別于第1、3、6、9、15次腹腔注射藥物 24h后被處死，摘取心臟。1.3摘取心臟標(biāo)本。將上述各實(shí)驗(yàn)亞組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在相 對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)稱(chēng)重后，10%水合氯醛0. 4ml/100g腹腔麻醉， 游離股靜脈，注射肝素0. 03mg/kg肝素化，剪開(kāi)胸骨、心包 后暴露心臟，心臟表面放置冰屑，阻斷升主動(dòng)脈，由主動(dòng)脈 根部注射4 °c st-thomas液46ml,待心臟完全停搏，心外 膜變白后，摘除供心，修剪后放入rcst-thomas液中。供 心的熱缺血時(shí)間控制在約1加in之內(nèi)。從s

5、t-thomas液中 取出心臟，冰生理鹽水沖洗干凈，迅速沿房室溝剪去心房， 沿室間溝剪掉右室保留左室前壁，于前壁長(zhǎng)軸處橫切3等份, 取中間份標(biāo)本，置于10%中性甲醛4°c固定24h。然后將固定 的心肌組織標(biāo)本，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。全層 心肌連續(xù)切片，厚度約5um,用經(jīng)粘片劑處理過(guò)的載玻片撈 片，晾干后置于6(tc烤箱烘烤3h后行免疫組化s-p法染色。1.4 hsp70的測(cè)定：免疫組化s-p法檢測(cè)圖像分析，細(xì) 胞核和/或細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色沉淀物為陽(yáng)性信號(hào)，每例切片分 別取3個(gè)高倍視野(x400),用image-pro plus6. 0圖像分 析系統(tǒng)測(cè)量組織細(xì)胞光密度值(0d)。

6、1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示，以excel數(shù)據(jù)庫(kù)整理后用spss13. 0統(tǒng)計(jì)軟 件包進(jìn)行方差分析及相關(guān)分析。以a =0. 05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)， p0. 05為無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2結(jié)果對(duì)照組注射天數(shù)之間心肌內(nèi)源性hsp70的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義(p>0.05)；尼可地爾預(yù)處理能誘導(dǎo)心肌內(nèi)源性hsp70 的表達(dá)，表達(dá)量在連續(xù)給藥9次之前隨著給藥次數(shù)的增加呈 遞增趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(p0. 05),連續(xù)給藥9次后, 其內(nèi)源性hsp70的表達(dá)量遞增趨勢(shì)不明顯，見(jiàn)表1。3討論自1967年世界首例人體原位心臟移植成功以來(lái)，心臟 移植技術(shù)業(yè)已基本成熟，但供心

7、資源短缺和供心保存效果仍 是目前心臟移植面臨的兩大難題。心臟不僅是高能量依賴(lài)的 器官，而且具有收縮功能，其生理和功能的特點(diǎn)，決定了供 心保護(hù)的復(fù)雜性和困難性3-5 o供心保存(冷缺血)的安全時(shí)限一般維持在46小時(shí) 6。在心臟移植過(guò)程中，供心從切取到移植入受體體內(nèi)缺 血、缺氧時(shí)間較長(zhǎng)，而且它在植入受體后要盡快恢復(fù)功能， 立即承載起全身其它臟器的供血功能。如何加強(qiáng)心肌保護(hù)， 安全、有效地延長(zhǎng)供心冷缺血時(shí)間，自然就成了影響心臟移 植廣泛開(kāi)展的瓶頸問(wèn)題。供心的保存效果評(píng)價(jià)及保存時(shí)間長(zhǎng) 短主要取決于心肌缺血性損傷，在供心的離體冷缺血保存期 間，良好的心肌保護(hù)可大大減少心臟的缺血性損傷。熱休克蛋白(hea

8、t shock protein, hsp)是一組高度 保守的多肽，普遍存在于生物體內(nèi)，是目前備受關(guān)注的應(yīng)激 蛋白和內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)。目前認(rèn)為hsp70心肌保護(hù)作用的可 能機(jī)理7-9有以下幾種可能：mc功能：hsp70可通過(guò)結(jié) 合因缺血而受損的蛋白，修復(fù)并維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而 減輕受損蛋白的破壞，達(dá)到心肌保護(hù)的作用。維護(hù)心肌鈣離子的穩(wěn)定：itsp70可通過(guò)改善缺血心肌鈣通道內(nèi)環(huán)境，減 輕心肌鈣離子超載，從而提高心肌收縮力，發(fā)揮心肌保護(hù)作 用。保護(hù)心肌線粒體功能、抗凋亡作用：hsp70具有很好 的膜穩(wěn)定性，可通過(guò)穩(wěn)定線粒體保障細(xì)胞能量代謝，從而減 輕缺血再灌注損傷。抑制炎性細(xì)胞因子釋放，發(fā)揮非特異 性免疫保護(hù)作用。hsp70可通過(guò)抑制免疫活性因子如il-1、 nf-kb的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗缺血再灌注損傷的效應(yīng)。調(diào)節(jié)敏感 性鉀通道活性，抑制細(xì)胞膜上快鈉通道開(kāi)放而抗再灌注心律 失常。保護(hù)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)血管平滑肌舒張功能。 改善心肌細(xì)胞能量代謝。蛋白降解功能。尼可地爾雖然在結(jié)構(gòu)上屬于硝酸鹽類(lèi)，具有硝酸酯樣作用，是臨 床上