(完整版)β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化畢業(yè)設(shè)計.doc

1、摘要從土壤中篩選出一株產(chǎn)-半乳糖苷酶的枯草芽孢桿菌，并對菌株和其產(chǎn)生的 -半乳糖苷酶進行了測定。單菌落的最佳生長時間是 10h，最佳接種量是 2.0% ，最佳培養(yǎng)時間 24h；該菌株產(chǎn)生的 -半乳糖苷酶的最適 pH 是 6.5，最適生長溫度為 37，酶的穩(wěn)定性較高， 4h 后相對酶活仍能維持 85% 以上； Mg 2+對酶活性的促進作用最強，當(dāng)濃度為 10 mmolL 時，酶活力可達 112.24， Cu2+對酶活性抑制作用最強，少量 Cu2+（1mmolL）就可使酶失活。本實驗還進行了-半乳糖苷酶的固定化實驗。以海藻酸鈉為栽體、戊二醛為交聯(lián)劑， 對乳糖酶進行固定化。 研究了海藻酸鈉濃度、 氯

2、化鈣濃度、戊二醛濃度、固定化時間對酶固定化的影響，并對固定化酶酶促反應(yīng)的最適 pH 、溫度等進行了測定。結(jié)果表明，4的海藻酸鈉，在溫度 37、pH67、氯化鈣濃度 1、戊二醛濃度 0.1% 下對乳糖酶的固定化率最高。 酶促反應(yīng)特性測定結(jié)果表明，固定化后乳糖酶的穩(wěn)定性增強，最適溫度范圍較非固定化乳糖酶大，最適 pH 范圍與非固定化乳糖酶大致相同。但固定化酶珠體機械強度較差，尚待改進。關(guān)鍵詞： -半乳糖苷酶酶活性酶的固定化AbsractA strain isolated from soil in producing -galactosidaseof Bacillussubtilis, and st

3、rains and -galactosidase were measured which produces. Asingle colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was 2.0%,the best culture time 24h; optimum pH -galactosidase enzyme produced by this strain is 6.5, the optimum temperature is 37 , enzyme be maintained above 85%; Mg 2+ on the ac

4、tivity of promoting the strongest,when the concentration of 10 mmolL, the enzyme activity of up to 112.24%,Cu2+2+inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu (1mmolL)can inactivate the enzyme.The experiments were also -galactosidaseimmobilization experiments. The lactase was immobilized

5、on sodium alginate carrier by cross-link with glutaraldehyde. The effects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of the immobilized lactase were studied. The results show that the of enz

6、yme目錄摘要 .IAbsract .II目錄 .III第 1 章 緒論 .71.1研究背景 .71.2課題研究目的和意義 .錯誤！未定義書簽。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 .錯誤！未定義書簽。1.4-半乳糖苷酶的來源及其特性 .錯誤！未定義書簽。1.4.1細菌產(chǎn)生的 -半乳糖苷酶 .錯誤！未定義書簽。1.4.2酵母菌產(chǎn)生的 -半乳糖苷酶 .錯誤！未定義書簽。1.4.3霉菌產(chǎn)生的 -半乳糖苷酶 .錯誤！未定義書簽。1.5-半乳糖苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用.錯誤！未定義書簽。1.5.1水解牛乳和其它乳制品中的乳糖.錯誤！未定義書簽。1.5.2生產(chǎn)低聚半乳糖 (Galactooligosacchar

7、ide) .錯誤！未定義書簽。1.5.3分析食品中乳糖含量 .錯誤！未定義書簽。1.5.4-半乳糖苷酶在制藥工業(yè)中的應(yīng)用.錯誤！未定義書簽。1.5.5-半乳糖苷酶在酶聯(lián)免疫反應(yīng)(EIA) 中的應(yīng)用 .錯誤！未定義書簽。第 2 章 材料和方法 .錯誤！未定義書簽。2.1材料 .錯誤！未定義書簽。2.1.1材料與試劑 .錯誤！未定義書簽。2.1.2儀器與設(shè)備 .錯誤！未定義書簽。2.1.3培養(yǎng)基 .錯誤！未定義書簽。2.2產(chǎn) -半乳糖苷酶菌的篩選 .72.2.1菌株篩選方法 .72.2.2分離純化 .72.2.3菌種生理生化鑒定 .72.2.4-半乳糖苷酶粗酶液制備 .82.2.5鄰硝基苯酚（ O

8、NP ）標(biāo)準(zhǔn)曲線 .82.2.6-半乳糖苷酶酶活力測定 .82.3-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) .82.3.1菌種生長曲線測定 .82.3.2培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶能力的影響.92.3.3接種量對菌株 BGJ222 產(chǎn)酶能力的影響 .錯誤！未定義書簽。2.3.4 pH 值對 -半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響.錯誤！未定義書簽。2.3.5溫度對 -半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響。.錯誤！未定義書簽。2.3.6不同金屬離子及離子濃度對-半乳糖苷酶的影響。 .錯誤！未定義書簽。第 3 章 -半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) .錯誤！未定義書簽。3.1高產(chǎn) -半乳糖苷酶細菌的篩選 .錯誤！未定義書簽。3.2鄰硝基苯酚（ ONP ）

9、標(biāo)準(zhǔn)曲線 .錯誤！未定義書簽。3.3菌株生長曲線測定 .錯誤！未定義書簽。3.4培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶能力的影響.錯誤！未定義書簽。3.5接種量對菌株產(chǎn)酶能力的影響.錯誤！未定義書簽。3.6 pH 對酶活性和穩(wěn)定性的影響.錯誤！未定義書簽。3.7溫度對酶活性和穩(wěn)定性的影響.錯誤！未定義書簽。3.8不同金屬離子及離子濃度對-半乳糖苷酶的影響 .錯誤！未定義書簽。第 4 章酶的固定化研究 .錯誤！未定義書簽。4.1固定化酶簡介 .錯誤！未定義書簽。4.2酶的固定方法 .94.2.1包埋法 .94.2.2吸附法 .104.2.3吸附法 .104.2.4交聯(lián)法 .104.3固定化酶反應(yīng)器的類型 .114.

10、3.1連續(xù)操作攪拌式反應(yīng)器(Continuous Flow Stirred Tand Reactor ，CSTR).114.3.2固定床反應(yīng)器 (Packed Bed Reactor ， PBR) .124.3.3流化床反應(yīng)器 (Fluidzed Bed Reactor ， FBR) .134.3.4中空纖維反應(yīng)器 (Hollow Fiber Reactor) .144.4固定化乳糖酶國內(nèi)外研究進展.154.4.1國外研究進展 .154.4.2國內(nèi)研究進展 .174.5-半乳糖苷酶的固定 .184.5.1包埋材料選擇 .184.5.2-半乳糖苷酶固定方法.184.5.3固定酶活力測定 .184

11、.6固定化的最適條件 .184.6.1海藻酸鈉濃度的確定 .184.6.2 CaCl2 濃度的確定 .194.6.3固定化時間的確定 .204.6.4戊二醛交聯(lián)試驗 .214.7固定化酶的酶學(xué)性質(zhì) .224.7.1固定化酶的最適 pH .224.7.2固定化酶的最適溫度 .234.8固定化酶的催化反應(yīng)機理探討.244.8.1固定化酶對反應(yīng)體系的影響.244.8.2影響固定化酶的動力學(xué)因素.254.9固定化酶保護劑的篩選 .26參 考 文 獻 .28致謝.28第1章緒論1.1 研究背景- 半 乳 糖 苷 酶 （ -galactosidase）， 全 名 為-D- 半 乳 糖 苷 水 解 酶（ -

12、D-galactoside- galcagalcato。-液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2% ，酵母粉 0.5% ，乳糖 2% ，NaCl0.5% ，蒸餾水 200ml，pH 自然。2.2 產(chǎn) -半乳糖苷酶菌的篩選2.2.1 菌株篩選方法取土樣，稀釋10 倍，置于 80水浴鍋中加熱30min，以去除不產(chǎn)芽孢的菌體。搖床振蕩，使土壤顆粒被打散，混合均勻，用無菌水將上述溶液稀釋成 10-3、 10-4、10-5、10-6 梯度，各取 200L均勻涂布于乳糖篩選平板上， 3540培養(yǎng) 2028 小時。2.2.2 分離純化培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)的藍色菌落，通過平板劃線進行分離純化，重復(fù)三次；對分離菌株進行培養(yǎng)形

13、態(tài)觀察和鏡檢，確定純培養(yǎng)。2.2.3 菌種生理生化鑒定在細菌形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，對所篩菌株進行初步的生理生化鑒定。2.2.4 -半乳糖苷酶粗酶液制備將純化菌株按體積分?jǐn)?shù)為1的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37靜置培養(yǎng) 24h。將培養(yǎng)好的菌液以5000rmin 離心 10 min，棄掉上清液沉淀經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，在冰浴中進行超聲波破碎。裂解后的菌液在 4下以 12000rmin 離心 10min，收集上清液， 即為粗酶液。2.2.5 鄰硝基苯酚（ ONP）標(biāo)準(zhǔn)曲線用檸檬酸 -Na2HPO 4 緩沖 溶液 (pH6.8) 配制5mmolml 鄰硝基苯 酚（ ONP）。取 7 支試管分別

14、吸取 0，0.01，0.02，0.03，0.04 ，0.05 ，0.10 ，0.15 ，0.20， 0.25， 0.30 ，0.35， 0.40 ，0.50， 0.60mL 5mmolml ONP，補 上 述 緩 沖液 至 0.5mL ， 然 后 40 保 溫 15min ， 加 入 2mL ， 1molLNaCO 3，以第一管為空白，于 420nm 測定吸光度，以 ONP 的量為橫坐標(biāo)，以A420 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.6 -半乳糖苷酶酶活力測定取 0.1mL 粗酶液與 0.9mL 濃度為 0.01 molL 鄰硝基苯 -D- 半乳吡喃糖苷 (ONPG) 的 005 molL 磷酸鈉

15、緩沖液 (pH 值為 6 5)混勻， 37 反應(yīng) 10 min 后，加入 1.5 mL 濃度為 0.4 molL 的 Na2CO 3 終止液靜置 5 min，于 420nm 比色測定生成鄰硝基苯酚(ONP) 濃度。1 個酶活性單位 (u)定義為在 37下每分鐘分解出1mol ONP所需的酶量。2.3-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)2.3.1 菌種生長曲線測定在篩選平板上挑一單菌落接種于裝液量30 mL培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中， 37、 225rmin恒溫搖床培養(yǎng)，分別于 0、2、4、6、8、10、 12、14、24、30、36、48、60h取樣。每個處理重復(fù) 3次。以未接種的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為空白對照。測

16、定菌液的吸光度 OD 595 (即生物量 )。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)； OD 595為縱坐標(biāo)繪制生長物線。2.3.2 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶能力的影響將種子菌液以 2的比例接種到裝有 30 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中在 37、 225 rmin 的條件下培養(yǎng)，分別于 0、2、4、6、8、10、12、14、 24、 30、36、48、 60ofenzymes)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)

17、使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點。固定化酶不僅在化學(xué)、生物學(xué)及生物工程、醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的研究異?；钴S，得到迅速發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，而且因為具有節(jié)省資源與能源、減少或防治污染的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求。4.2 酶的固定方法4.2.1 包埋法載體 (如聚丙烯酰胺凝膠、矽酸鹽凝膠、藻酸鹽、角叉菜聚糖等)在有酶的存在下發(fā)生聚合、沉淀或凝膠化。此法最簡單，但固定后的酶活力不高，固定酶的牢度不強。4.2.2 吸附法通過非特異性物理吸附法或生物物質(zhì)的特異吸附作用將酶固定到載體 (如硅藻土、陶瓷、塑料等 )表面，方法簡便，酶活力不受影響，但是吸附的靜電作用力容易受到反應(yīng)液中 pH

18、 的影響。4.2.3 吸附法通過非特異性物理吸附法或生物物質(zhì)的特異吸附作用將酶固定到載體 (如硅藻土、陶瓷、塑料等 )表面，方法簡便，酶活力不受影響，但是吸附的靜電作用力容易受到反應(yīng)液中 pH 的影響。4.2.4 交聯(lián)法交聯(lián)法又稱為架橋法，是借助于雙功能或多功能試劑與酶分子中的氨基或羧基發(fā)生反應(yīng)，使酶蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)，結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而制成固定化酶。最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛。與共價結(jié)合法一樣，由于酶的功能團 (如氨基、巰基和咪唑基 )參與反應(yīng)可能引起酶活性中心結(jié)構(gòu)的改變，使酶活力下降。雖然固定化方法及固定化載體較多，并用于多種酶，但是迄今為止，幾乎沒有一種固定化技術(shù)或載體能普遍適用于每一種酶，

19、因為各種酶的化學(xué)特性和組成差別很大，底物和產(chǎn)物性質(zhì)不同，產(chǎn)物的用途也不一樣。因此，對任何一種酶的固定化， 其載體和方法的選擇都更多的依賴實驗結(jié)果。根據(jù)酶的特殊性和應(yīng)用目的 (如工業(yè)生產(chǎn)、 醫(yī)學(xué)應(yīng)用或是生物學(xué)模型系統(tǒng) )，可以從許多方法中選擇。表 4-2為各種酶的固定化方法比較：表 4-2 固定化方法及優(yōu)劣比較方法優(yōu)點缺點吸附法制作條件溫和、簡便、成本結(jié)合力弱，對 pH、離子強度、低、可再生、可反復(fù)利用溫度等因素敏感，酶易脫落，酶的裝載容量較小包埋法包埋材料、包埋方法可選擇僅可用于低分子量的底物， 不適余地大，固定化酶的使用面用于柱系統(tǒng)，常有擴散限制問題廣，包埋條件溫和共價法載體與歐聯(lián)方法可選擇

20、性偶聯(lián)條件激烈，易引起酶失活，大；酶的結(jié)合力強，非常穩(wěn)成本高，某些偶聯(lián)試劑有一定毒定性交聯(lián)法可用的交聯(lián)試劑多，技術(shù)簡交聯(lián)條件激烈，機械性差易，酶的結(jié)合力強，穩(wěn)定性高4.3 固定化酶反應(yīng)器的類型4.3.1 連續(xù)操作攪拌式反應(yīng)器(Continuous Flow Stirred TandReactor，CSTR)該反應(yīng)器內(nèi)裝有攪拌器，能使反應(yīng)組分與固定化酶顆?；旌暇?，如圖 4-3-1 所示。具有結(jié)構(gòu)簡單、 溫度和 pH 值容易控制、能處理膠體底物和不溶性底物及催化劑更換方便等優(yōu)點， 因而常被用于飲料和食品加工工業(yè)。其缺點是由于攪拌漿產(chǎn)生的剪切力較大，常會引起固定化酶的破壞。在CSTR 的液體出口處

21、設(shè)置過濾器，可以把固定化顆粒保存在反應(yīng)器內(nèi)，或直接選用磁性固定化酶，借助磁場吸力固定。此外還可將載有酶的圓片聚合物，固定在攪拌軸上或者將固定化酶放置在與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動的金屬網(wǎng)筐內(nèi)，這樣既能保證反應(yīng)液攪拌均勻，同時又不致?lián)p壞固定化酶。適合于有底物抑制的催化反應(yīng)。圖 4-3-1 連續(xù)操作攪拌式反應(yīng)器4.3.2 固定床反應(yīng)器 (Packed Bed Reactor， PBR)把固定化顆粒填充在固定床(填充床 )中的反應(yīng)器叫做固定床反應(yīng)器，如圖 4-3-2 所示。這是一種使用的最廣泛的固定化酶反應(yīng)器。它具有單位體積的催化劑負荷高、結(jié)構(gòu)簡單、容易放大、剪切力小、催化效率高等優(yōu)點。缺點是溫度和pH 值難控

22、制；底物和產(chǎn)物會產(chǎn)生軸向分布，易引起相應(yīng)的酶失活程度也呈軸向分布；更換部分催化劑相當(dāng)麻煩；柱內(nèi)壓降相當(dāng)大，底物必須加壓后才能進入。適合于存在有產(chǎn)物抑制的催化反應(yīng)。圖 4-3-2 定床反應(yīng)器4.3.3 流化床反應(yīng)器 (Fluidzed Bed Reactor，F(xiàn)BR)流化床反應(yīng)器是一種裝有較小顆粒的垂直塔式反應(yīng)器，如圖4-3-3 所示。底物以一定的流速從下向上流過，使固定化酶顆粒在流體中維持懸浮狀態(tài)并進行反應(yīng)，這時的固定化顆粒和流體可以看作是均勻混合的流體。流化床反應(yīng)器具有傳熱與傳質(zhì)特性好、不堵塞、壓降較小等優(yōu)點，也很適合排氣供氣的反應(yīng)，但它需要較高的流速才能維持粒子的充分流態(tài)化，故放大較困難。

23、目前，流化床反應(yīng)器主要被用來處理一些粘度高的液體和含有固體顆粒的底物，如用于水解牛奶中的蛋白質(zhì)。圖 4-3-3 流化床反應(yīng)器4.3.4 中空纖維反應(yīng)器 (Hollow Fiber Reactor)中空纖維反應(yīng)器是把酶結(jié)合于半透性的中空纖維，這種中空纖維的半透膜，只允許底物和產(chǎn)物等小分子量的物質(zhì)通過，而分子量較大的酶則不能，如圖4-3-4 所示。它可以提供較大的催化表面，結(jié)構(gòu)類似于列管換熱器。在這種反應(yīng)器中，酶與中空纖維可按不同的方式安排。例如，酶可被包埋于中空纖維內(nèi)，然后再把纖維束放置于反應(yīng)器內(nèi)。操作時，底物流經(jīng)纖維外表面，并擴散進入纖維內(nèi)腔，再在腔內(nèi)發(fā)生酶促反應(yīng)，生成的反應(yīng)產(chǎn)物又?jǐn)U散返回流動

24、主體。另一種方式是把酶保留在纖維的外側(cè)，而底物則流經(jīng)纖維內(nèi)腔。其缺點是制作成本高，膜容易堵塞。此外還有螺旋卷膜式反應(yīng)器以及不同反應(yīng)器結(jié)合的類型，但并不存在一種通用的、理想的反應(yīng)器。在生產(chǎn)中，必須根據(jù)具體情況，針對系統(tǒng)的特點，選擇使用適合的反應(yīng)器。圖 4-3-4 中空纖維反應(yīng)器4.4 固定化乳糖酶國內(nèi)外研究進展4.4.1 國外研究進展美國、日本、意大利等國對固定化-半乳糖苷酶分解乳糖進行了廣泛的研究。 Bodalo等人對不同固定化-半乳糖苷酶進行了比較， 他們所選用的固定化方法有：多孔玻璃共價結(jié)合法、GCP- 醛交聯(lián)法、 GCP- 芳香胺交聯(lián)法、凝膠包埋法以及物理吸附法等。具體結(jié)果如表4 所示：

25、固定化方法VmaxKm （mM ）相對活性酶活力（ uml）（% ）（U）GCP- 交聯(lián)法237.60.2680.44253.9GCP- 芳香胺交聯(lián)203.770.3969.06146.7法卡拉膠包埋法46.880.1215.89156.11物理吸附法105.300.1235.69112.924游離酶295.070.28可見 GCP 一醛交聯(lián)法效果最好。Saito 和 Yoshida(1994)用多孔陶瓷作載體固定-半乳糖苷酶，固定化酶 70處理 3 小時，活力沒有下降。固定化酶的特性幾乎與游離酶相同，在巴氏消毒牛奶中 65固定化酶的半衰期為 450 小時，體現(xiàn)了工業(yè)用于生產(chǎn)低乳糖牛奶的前景。

26、Papayannokos和 Markas(1993)將黑曲霉來源的-半乳糖苷酶通過吸附和分子內(nèi)交聯(lián)固定在多孔陶瓷上，固定化后沒有酶脫落現(xiàn)象。固定化酶水解乳糖的最適pH 和最適溫度同游離酶相同。固定化酶的半衰期是180天，而游離酶僅為24 天。Tomoska和 Gemeiner(1995)選用聚乙烯亞胺和戊二醛活化的果膠酸鈣(CPG) 和海藻酸鈣 (CAG) 作載體固定克魯維酵母屬 Marxianus CCYeSY2 。在半連續(xù)反應(yīng)器中循環(huán) 25 次以上，水解率能夠維持在 80% 以上。固定化細胞在 4儲存 2 個月，水解效率不變。Peterson，等將來源于米曲霉的乳糖酶固定在由聚氯乙烯和硅膠

27、組成的毛細管填充床上，在30，停留時間 7min，80% 的脫脂乳能被水解。用纖維素包埋酵母乳糖酶已有工業(yè)規(guī)模應(yīng)用，用其間歇處理預(yù)先超高溫消毒的牛奶。 采用 Coming Glass Systerm用鹽酸把經(jīng)巴氏滅菌的待處理液調(diào) pH 值為 3.8，通過酶反應(yīng)器反應(yīng)約 15min，最初反應(yīng)溫度為 37，逐漸升高到 60，以補償酶活力的損失。在 pH3.5、3035的條件下處理濃縮乳清，乳清濃縮程度取決于終產(chǎn)物的抑制作用和反應(yīng)器的壓降，所用固定化酶的裝置曾成功地運轉(zhuǎn)了兩年。每日循環(huán)一次，20 小時進行水解，4 小時用于清洗。Millert 根據(jù)乳糖酶與乳糖分子的大小不同，牛奶先經(jīng)過超濾，濾過液(

28、主要是乳糖 )與乳糖酶在反應(yīng)器中反應(yīng)，然后再經(jīng)過一次超濾，乳糖、葡萄糖、半乳糖等小分子物質(zhì)通過，而大分子的乳糖酶被截流住，重新回到反應(yīng)器中繼續(xù)循環(huán)使用，第二次的濾過液和第一次的濾過液混合，就制成低乳糖牛奶。該系統(tǒng)連續(xù)反應(yīng) 6 周，總酶的活性下降不明顯，在 10下反應(yīng)，可減少微生物的污染 15。4.4.2 國內(nèi)研究進展我國的學(xué)者對 -半乳糖苷酶的固定化也展開了一些研究，但尚未見到進行工業(yè)化生產(chǎn)低乳糖奶的報道。李文英等人 (1990)對利用不同載體，不同方法固定化的 -半乳糖苷酶活力進行了比較，實驗結(jié)果顯示聚丙烯酰胺凝膠包埋活力回收率高。李緒淵等人將來自鷹嘴豆 B 一半乳糖苷酶固定在聚丙烯酰胺上，

29、 活力回收率為 72% 。與游離酶相比具有更寬的 pH 值范圍和更好的熱穩(wěn)定性。凍干固定化酶室溫保存 60 天，仍具有較高活力， 重復(fù)使用數(shù)次后， 仍具有操作穩(wěn)定性，酶活力沒有損失。孫淑芳等人 (1999)將 -半乳糖苷酶固定在 D202 載體上，用戊二醛作交聯(lián)劑，與游離酶相比具有更寬的 pH 范圍。反應(yīng)動力學(xué)參數(shù) Ea、Km 變大， Vmax 變小。該來源的酶具有水解牛奶中乳糖特點。 潘道東 (1991)，用卡拉膠包埋法制備固定化脆壁酵母 -半乳糖苷酶， 活力回收率可達 83% ，可以在實驗條件下有效水解乳清、脫脂乳和全脂乳中的乳糖，在45下，水解半衰期均在 1 69-200 小時，但是卡拉

30、膠的機械強度差， 不適合工業(yè)化應(yīng)用。4.5-半乳糖苷酶的固定4.5.1 包埋材料選擇包埋材料有瓊脂、瓊脂糖、 k-卡拉膠、明膠、海藻酸鈉、聚丙烯酰胺、纖維素等，其中海藻酸鈉包埋法簡單、無毒、安全、價格低廉，材料易得，是最常用的方法。本文以海藻酸鈉為包埋載體，戊二醛為交聯(lián)劑，對乳糖酶進行固定化嘗試，探討了固定化的最適條件及固定化酶的部分性質(zhì)。4.5.2-半乳糖苷酶固定方法將一定濃度海藻酸鈉與酶液按l：l 比例混合，吸入 7 號注射器內(nèi)，再逐滴滴入氯化鈣溶液中， 即成規(guī)則球形， 球體在一定范圍內(nèi)不受滴落高度、速度及接觸溶液濃度的影響，操作完畢后，放入4冰箱中硬化 2h，過濾洗滌，加入戊二醇溶液交聯(lián)

31、4h，洗滌，抽濾 3 次，測定酶活力。4.5.3 固定酶活力測定與 2.2.4 所描述的酶的測定方法相同， 只是不加游離酶，而加固定化酶。4.6 固定化的最適條件4.6.1 海藻酸鈉濃度的確定分別配制濃度為 1% ，2% ，3% 。 4% ， 5% 的海藻酸鈉，各取 5mL，放置于 5 個燒杯中，每個燒杯中各加入 5mL 酶液，混勻靜置 30min，用注射器吸取 lmL 混合液逐滴滴入 20mL 2的 CaCl 2 溶液中，于室溫下固定30min，用蒸餾水洗滌，抽濾三次，獲得固定化酶。將固定化酶加入5mLONPG 底物溶液中（ 37預(yù)熱），反應(yīng) 10min 后加入 2mL Na2CO 3 溶液

32、中止反應(yīng)，在離心機中以 120rnin 離心 23min，取上清液在 420nm 下測定吸光值，結(jié)果見圖 4-6-1?？芍Ｔ逅徕c固定化酶的酶活有不同程度損失，海藻酸鈉濃度低時， 酶泄漏嚴(yán)重， 清洗酶珠時，酶損失較多， 酶活力下降，海藻酸鈉濃度高時， 微環(huán)境效應(yīng)和擴散陰力對反應(yīng)影響更大。 且不易操作，很難將酶液從注射器中擠出，綜合各種因素，確定海藻酸鈉濃度為 4，酶液與海藻酸鈉的體積比為 l：l(海藻酸鈉實際濃度為 2 )。0.60.5值 0.4光 0.3吸 0.2 0.1 0123456海藻酸鈉濃度（ %）圖 4-6-1 海藻酸鈉濃度對固定化酶酶活的影響4.6.2 CaCl2 濃度的確定分別配置濃度為1% ，2% ， 3% ，4% ，5% 的 CaCl 2 溶液各 20mL 置于燒杯中，在相同條件下用4海藻酸鈉進行酶固定化處理，固定時間為1h，固定化酶與底物精確反應(yīng)10min，加入 Na2CO 3 溶液中止反應(yīng)，測吸光值，結(jié)果見 4-6-2?？梢钥闯?l% CaCl 2 濃度固定化酶的酶活高些，確定為最適濃度。0.50.4值 0.3光吸 0.2 0.1 0123456CaCl2濃度（ %）圖 4-6-2 CaCl 2 濃度 固定化酶酶活的影響4.6.3 固定化時間的確定取 4的海藻酸鈉與