(整理)微生物實(shí)驗操作

1、精品文檔油鏡的使用和維護(hù) 目的：掌握油鏡的使用與維護(hù)， 熟悉油鏡的使用原理。 材料：顯微鏡，拭鏡紙，液體石蠟油，二甲苯 原理：油鏡的透鏡極小，工作焦距最短，光線通過玻 璃和空氣，由于介質(zhì)密度不同發(fā)生折射，射入鏡筒的 光線極少，視野暗，物象不清晰。 如在玻片與鏡頭 （透 鏡）之間加上折光率和玻片（ n=1.52 ）相近的香柏油 （n=1.515）就可減少光線的折射，加強(qiáng)視野的亮度， 獲得清晰的物象。步驟：顯微鏡油鏡的使用和維護(hù)1. 將顯微鏡平穩(wěn)地安放在實(shí)驗臺適宜處。 識別油鏡頭： 標(biāo)有 100×、 OIL、HI 等字樣。2. 打開電源， 用低倍鏡對光， 打開光圈， 調(diào)節(jié)聚光鏡 的位置，

2、使視野光線充足。3. 標(biāo)本上加鏡油一滴， 轉(zhuǎn)動粗螺旋， 使油鏡頭緩緩下 降，用眼從側(cè)面觀察，直到油鏡頭浸入油中接近玻片 為止。4. 從目鏡觀察， 同時徐徐轉(zhuǎn)動粗螺旋提升， 見模糊物 象后再用細(xì)螺旋調(diào)節(jié)，直到見到清晰物象為止。5. 觀察完畢， 粗螺旋提高鏡頭， 取下標(biāo)本片， 油鏡頭 使用后立即用擦鏡紙擦凈鏡頭上的油。如油已干，可 在擦鏡紙上滴少許二甲苯擦拭，并立即用另一擦鏡紙 擦去二甲苯，因二甲苯能溶解鏡頭上的固定膠以致使 鏡頭脫落。6. 將鏡頭轉(zhuǎn)呈“八”字，調(diào)低聚光器，對號送入柜子 內(nèi)存放。革蘭染色 目的：掌握革蘭染色的原理及操作。 材料：干凈玻片，接種環(huán)，葡萄球菌和大腸桿菌 18-24h 培

3、養(yǎng)后的混合菌液，酒精燈，一套革蘭染液 原理：主要為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異。 G+三維肽聚糖結(jié)構(gòu) 的交聯(lián)度大，通透性低，脂質(zhì)少或無，酒精作用使孔 徑縮??；而 G-肽聚糖為二維疏松結(jié)構(gòu)，薄，外膜含大 量脂質(zhì)，易被酒精溶解，使細(xì)胞壁通透性增高，結(jié)晶 紫-碘復(fù)合物被酒精溶解而脫色。步驟：1. 細(xì)菌標(biāo)本的制作（1）涂片：無菌操作。取一接種環(huán)混合細(xì)菌懸液，涂 布成直徑約 1cm的涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。（2）干燥：涂片最好在室溫中自然干燥。 必要時可將 標(biāo)本面向上，放在酒精燈上方微火處干燥。（3）固定：標(biāo)本面向上， 在酒精燈火焰外焰按鐘擺的 速度來回通過 3 次，放置待冷后染色。固定的目的是 殺死細(xì)菌，使細(xì)菌與玻

4、片黏附較牢固。菌體蛋白質(zhì)變 性后，提高與染料的親和力。2. 革蘭染色（1）初染：滴加結(jié)晶紫染液 1-2 滴于涂片上， 1min 鐘后用自來水緩緩沖洗。（2）媒染：滴加碘液 1-2 滴， 1min 后用自來水緩緩 沖洗。（3）脫色：加 95%酒精數(shù)滴，擺動玻片使酒精與細(xì)菌 充分接觸，約 20-30s 后，立即用自來水緩緩沖洗。（4）復(fù)染：滴加稀釋碳酸品紅液， 30-60s 后，自來 水緩緩沖洗。用吸水紙吸干后，用油鏡觀察。鏡檢后，載片放入消 毒缸。細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)的觀察 目的：觀察并掌握細(xì)菌的形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)。 材料：細(xì)菌鞭毛、芽孢、莢膜的標(biāo)本片；革蘭陽性菌、 革蘭陰性菌染色標(biāo)本片示教： 革蘭陽性菌：

5、葡萄球菌，紫色 革蘭陰性菌：大腸桿菌，紅色細(xì)菌鞭毛細(xì)菌芽孢細(xì)菌莢膜細(xì)菌的分布 目的：了解細(xì)菌在自然界中的分布情況。材料： 普通瓊脂平板培養(yǎng)基、血平板、鑷子、無菌棉 拭子、革蘭染液。操作步驟：1. 空氣中細(xì)菌的檢查（1）采用沉降法： 取普通瓊脂平板培養(yǎng)基 1 只，任意 置一處，啟蓋約 15 分鐘，再蓋上，37oC培養(yǎng) 24 小時， 觀察有無細(xì)菌生長。（2）結(jié)果判定： 培養(yǎng)基表面可見多種大小、 形態(tài)不一 的菌落。2. 皮膚表面細(xì)茵檢查（1）采用涂抹法 : 先在平板底面用記號筆分成兩區(qū)， 作 標(biāo)記，將未消毒的手指在平板的 12 處表面輕輕涂抹 劃線，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮膚，用消毒后的 手指在平

6、板另一 12 處進(jìn)行涂抹，操作完畢，置 37 培養(yǎng) 24 小時后，取出觀察結(jié)果。(2) 結(jié)果判定：培養(yǎng)基表面有幾種大小及形態(tài)不同的菌 落生長，注意比較消毒前后細(xì)菌的生長情況。3. 咽喉部細(xì)茵檢查(1) 用無菌棉拭子在咽喉部涂抹后， 涂在血平板上， 并 劃線分離， 37oC培養(yǎng) 24 小時后觀察結(jié)果。注意觀察 平板上菌落種類以及是否有溶血現(xiàn)象，并可挑取菌落 進(jìn)行革蘭染色檢查?？谇晃⑸餀z查也可用無菌牙簽 直接挑取少量牙垢，制成涂片，進(jìn)行革蘭染色檢查。(2) 結(jié)果判定：血平板表面有大小和形態(tài)不同的菌落， 有的菌落周圍可見溶血環(huán)。牙垢涂片鏡檢可見革蘭陽 性菌和革蘭陰性菌。紫外線殺菌實(shí)驗 目的：掌握紫

7、外線殺菌的原理，熟悉紫外線殺菌實(shí)驗 的操作。材料：大腸桿菌，瓊脂平板，無菌回形狀紙 片，接種環(huán)，鑷子，紫外燈 . 原理：紫外線波長范圍為 240280nm,最適的波長為 260nm，這與 DNA吸收光譜范圍相一致。 其殺菌原理是 紫外線易被核蛋白吸收，使 DNA的同一條螺旋體上相 鄰的堿基形成胸腺嘧啶二聚體， 從而干攏 DNA的復(fù)制， 導(dǎo)致細(xì)菌死亡或變異。紫外線特點(diǎn)：紫外線的穿透能 力弱，不能通過普通玻璃、塵埃。步驟：1. 平板密集劃線接種。2. 在平板上貼無菌回形紙片。3. UV 照射 30min（打開平板蓋子）。4. 取出回形紙，將回形紙放入消毒缸中 5.37oC 培養(yǎng) 24h 后觀察結(jié)果

8、。細(xì)菌代謝產(chǎn)物觀察和生長現(xiàn)象目的：掌握細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測和結(jié)果的判斷。熟悉 細(xì)菌在各種培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象。材料：各種生化管，大腸桿菌、傷寒桿菌、產(chǎn)氣桿菌、 變形桿菌等。原理：不同菌的酶系統(tǒng)不同，對底物的代謝產(chǎn)物也不 同，用生化的實(shí)驗方法可將產(chǎn)物檢測出來，從而對細(xì) 菌鑒定。步驟：一、細(xì)菌代謝產(chǎn)物觀察1. 糖發(fā)酵實(shí)驗將大腸桿菌、傷寒桿菌分別接種在葡萄糖發(fā)酵管精品文檔精品文檔內(nèi)，37培養(yǎng) 18-24h 進(jìn)行觀察。 培養(yǎng)基中指示劑為溴 甲酚紫。如能分解葡萄糖，則產(chǎn)酸，培養(yǎng)基由原來的紫色變?yōu)?黃色，記錄符合為“ +”。如同時還產(chǎn)生氣體，則其中 倒置的小管中有氣泡出現(xiàn)，記錄符合為“”。 如能分解乳糖，則產(chǎn)

9、酸，培養(yǎng)基由原來的紫色變?yōu)辄S 色，記錄符合為“ +”。如同時還產(chǎn)生氣體，則其中倒 置的小管中有氣泡出現(xiàn)，記錄符合為“”。如培養(yǎng) 基未變色，仍為紫色，則表明細(xì)菌不能分解乳糖不能 分解乳糖。記錄符合“ - ”。2. 枸櫞酸鹽利用實(shí)驗 該培養(yǎng)基中提供的唯一碳源是枸櫞酸鈉。指示劑是澳 麝香草酚蘭。分別接種大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌， 37培 養(yǎng) 24h 進(jìn)行觀察 .若斜面有菌落出現(xiàn)，培養(yǎng)基由原來的綠色變?yōu)樯钐m色， 表明細(xì)菌能利用枸櫞酸鈉， 記錄符合 “ +”，反之“ - ”。3. 靛基質(zhì)吲哚產(chǎn)生實(shí)驗 能產(chǎn)生色氨酸酶的細(xì)菌，可分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的 色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)。將大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌分別接 種在蛋白胨水培

10、養(yǎng)基中， 37培養(yǎng) 48h 后，每管各加 吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛） 3-4 滴，若出現(xiàn)紅 色化合物 - 玫瑰色吲哚，表明靛基質(zhì)產(chǎn)生陽性“ +”； 精品文檔精品文檔反之為陰性：“ - ”。4. 硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗 有的細(xì)菌能分解含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸)產(chǎn) 生硫化氫。將大腸桿菌和變形桿菌分別接種在這樣的 培養(yǎng)基中， 37培養(yǎng) 18-24h。若培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色沉 淀物即為陽性 “+”，表明產(chǎn)生的硫化氫與培養(yǎng)基中的 鉛鹽(或鐵鹽 ) 結(jié)合，生成黑色的硫化鉛 (或硫化鐵) 。 二、細(xì)菌生長現(xiàn)象1、在液體培養(yǎng)基上生長情況(1) 表面生長：液體清晰，細(xì)菌生長在液面形成菌膜。 如枯草桿菌。(2) 混濁

11、生長： 液體均勻混濁， 或有少量沉淀。 如大 腸埃希菌。(3) 沉淀生長： 液體清晰， 細(xì)菌生長在管底， 形成沉 淀。如鏈球菌。2、在固體培養(yǎng)基上的生長情況(1) 菌苔：在瓊脂斜面培養(yǎng)基上長成菌苔。(2) 菌落：在平板上形成肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)， 稱為菌 落。觀察時要注意菌落的大小、形狀、表面形狀、邊 緣是否整齊、透明度、顏色等，可作為鑒別細(xì)菌的依 據(jù)之一。(3) 色素：水溶性色素和脂溶性色素。3、在半固體培養(yǎng)基上的生長情況有鞭毛的細(xì)菌，由于能運(yùn)動，在半固體培養(yǎng)基內(nèi)沿穿刺線彌漫性生長，使穿刺線變得模糊不清。無鞭毛的 細(xì)菌，因為不能運(yùn)動，接種生仍沒穿刺生長，穿刺線 與周圍界限清楚。凝集實(shí)驗（玻片法

12、）目的：掌握抗原抗體反應(yīng)的基本原理和特異性，熟悉 凝集反應(yīng)的操作。材料：傷寒桿菌 AF群 O多價血清、志賀氏痢疾多價 血清、生理鹽水、未知菌、玻片。原理：顆粒性抗原（凝集原）與相應(yīng)的抗體（凝集素） 直接結(jié)合，在一定的條件下形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 如紅細(xì)胞 ABO血型的測定，測定細(xì)菌的細(xì)菌凝集實(shí)驗。步驟：1. 取清潔載物玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號 碼。于第一格和第二格內(nèi)各加約 30ul 傷寒桿菌 AF 群 O 多價血清及志賀氏痢疾多價血清，第三格內(nèi)滴加 約 30ul 生理鹽水。2. 用接種環(huán)挑取待檢菌種少許，分別均勻地涂抹于1、2、3 格內(nèi)的液體中。接種環(huán)每次使用前后均需經(jīng) 酒精燈火焰

13、燒灼滅菌。3. 輕輕搖動玻片， 數(shù)分鐘后用肉眼觀察結(jié)果， 出現(xiàn)灰 白色凝集顆粒者即為陽性反應(yīng)；仍為均勻混懸液者為 陰性反應(yīng)。如結(jié)果不夠清晰，可將玻片放于低倍顯微 鏡下觀察。沉淀反應(yīng)（雙擴(kuò)散）目的：掌握抗原抗體反應(yīng)的基本原理和特異性，熟悉 沉淀反應(yīng)的操作。材料：干凈玻片，玻璃蠟筆、打孔 器、微量加樣器、正常人血清 IgG、羊抗人 IgG 原理：將抗原與抗體分別加到電解質(zhì)凝膠板相鄰的兩 孔中，抗原與抗體雙方自由擴(kuò)散，在最適當(dāng)比例處形 成抗原抗體復(fù)合物（沉淀線）。步驟：1. 制板：取干凈玻片一片，用蠟筆分為三格，用吸管 將 45ml 加熱溶化的 1.5%食鹽瓊脂充盈中格，制備 瓊脂板。2. 打孔：待

14、瓊脂板凝固后， 用打孔器打孔。 孔間距約 為 5mm。3. 封底：將打好孔的瓊脂板凝板過火焰三次。4. 加樣：用微量加樣器在三孔中加入生理鹽水， 正常 人血清 IgG 和馬抗人 IgG。每孔加入約 10l 。注意： 加樣時勿使液體溢出和孔內(nèi)出現(xiàn)氣泡。5. 擴(kuò)散：將瓊脂板放入濕盤內(nèi)，置 37溫箱中（均 保持水平位置），于 24 小時后觀察結(jié)果。藥敏實(shí)驗 （ 紙片法 ）目的：掌握紙片法藥敏實(shí)驗方法，熟悉微生物培養(yǎng)， 了解抗生素對細(xì)菌的作用機(jī)制。了解含藥紙片的制備 材料：大腸埃希菌，普通瓊脂培養(yǎng)基，無菌鑷子，打 孔器 （ 直徑 6cm），抗生素紙片。原理：藥物在瓊脂上擴(kuò)散，形成濃度涕度，在一定的 濃度下，對細(xì)菌抑制或殺死，濃度過低，則不能抑制 或殺死。從而形成一定大小的抑菌圈。步驟：1. 平板上密集劃線接種。2. 貼 4-5 種含抗生素的紙片于平板上。藥片與平板邊 緣相距至少 1.5cm，藥片之間相距至少 2cm。3. 37oC培養(yǎng) 24h 后觀察結(jié)果。測量抑菌圈直徑大小， 判斷敏感性。消毒劑對細(xì)菌的影響 目的：掌握含藥紙片的制備。熟悉微生物培養(yǎng)，了解 消毒劑對細(xì)菌的作用機(jī)制。材料：大腸埃希菌，普通瓊脂培養(yǎng)基，無菌鑷子，打 孔器（ 直徑 6cm），濾紙紙片 （ 直徑約 6 mm），70%酒精， 金星消毒水，紫藥水、紅藥水。原