試驗(yàn)一-DNA提取

1、實(shí)驗(yàn)一-DNA提取實(shí)驗(yàn)一 DNA 的小量制備小量法提取植物基因組 DNACTAB 法1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模弘S著基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)的迅速開展及廣泛應(yīng)用,人們經(jīng)常需要提取高分子量的植物 DNA,用于構(gòu)建基因文庫(kù)、 基因組 southern 分析、 酶切及克隆等,這是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的重要步驟.本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)從植物材料中提取和測(cè)定DNA的原理并掌握 CTAB提取 DNA 的方法,進(jìn)一步了解 DNA 的性質(zhì).2 實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞中的 DNA 絕大多數(shù)以 DNA-蛋白復(fù)合物DNP的形式存在于細(xì)胞核內(nèi).提取 DNA時(shí),一般先破碎細(xì)胞釋放出 DNP,再用含少量異戊醇的氯仿除去蛋白質(zhì),最后用乙醇把 DNA從抽提

2、液中沉淀出來(lái).DNP 與核糖核蛋白R(shí)NP在不同濃度的電解質(zhì)溶液中溶解度差異很大,利用這一特性可將二者別離.以 NaCl 溶液為例：RNP 在 0.14mol/LNaCl 中溶解度很大,而 DNP 在其中的溶解度僅為純水中的 1%.當(dāng) NaCl 濃度逐漸增大時(shí),RNP 的溶解度變化不大,而DNP的溶解那么隨之不斷增加.當(dāng)NaCl濃度大于1mol/L時(shí),DNP的溶解度最大,為純水中溶解度的 2 倍,因此通常可用 1.4mol/LNaCl 提取 DNA.為了得到純的 DNA 制品,可用適量的RNase 處理提取液,以降解 DNA 中攙雜的 RNA.關(guān)于植物總 DNA 的提取主要有兩種方法：1.CTA

3、B 法：CTAB十六烷基三甲基澳化俊,hexadecyltrimethylammoniumbromide,簡(jiǎn)稱 CTAB:是一種陽(yáng)離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜,它能與核酸形成復(fù)合物,在高鹽溶液中0.7mol/LNaCl是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度0.3mol/LNaCl時(shí)從溶液中沉淀,通過(guò)離心就可將 CTAB 與核酸的復(fù)合物同蛋白、 多糖類物質(zhì)分開,然后將 CTAB 與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中,再參加乙醇使核酸沉淀,CTAB 能溶解于乙醇中.2.SDS 法：利用高濃度的陰離子去垢劑 SDS 十二烷基磺酸鈉,Sodiumdodecylsulfate,簡(jiǎn)稱 SDS使 DNA 與蛋白質(zhì)

4、別離,在高溫5565C條件下裂解細(xì)胞,使染色體離析,蛋白變性,釋放出核酸,然后采用提升鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀,離心后除去沉淀,上清液中的 DNA 用酚/氯仿抽提,反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA.一般生物體的基因組DNA為107109bp,在基因克隆工作中,通常要求制備的大分子 DNA 的分子量為克隆片段長(zhǎng)度的 4 倍以上,否那么會(huì)由于制備過(guò)程中隨機(jī)斷裂的末端多為平末端,導(dǎo)致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,嚴(yán)重影響克隆工作.因此有效制備大分子 DNA 的方法必須考慮兩個(gè)原那么：1盡量去除蛋白質(zhì)、RNA、次生代謝物質(zhì)如多酚、類黃酮等、多糖等雜質(zhì),并預(yù)防和抑制內(nèi)源

5、 DNase 對(duì) DNA 的降解.2盡量減少對(duì)溶液中 DNA 的機(jī)械剪切破壞.幾乎所有的 DNase 都需要 Mg2+或 Mn2+為輔因子,故實(shí)現(xiàn)1盡量去除蛋白質(zhì)的要求,需參加一定濃度的螯合劑,如 EDTA、檸檬酸,而且整個(gè)提取過(guò)程應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行(一般利用液氮或冰浴).為實(shí)現(xiàn)(2)需要在 DNA 處于溶解狀態(tài)時(shí),盡量減弱溶液的渦旋,而且動(dòng)作要輕柔,在進(jìn)行 DNA 溶液轉(zhuǎn)移時(shí)用大口(或剪口)吸管.提取的 DNA 是否為純潔、雙鏈、高分子的化合物,一般要通過(guò)紫外吸收、化學(xué)測(cè)定、熔點(diǎn)(meltingtemperature,Tm)測(cè)定、電鏡觀察及電泳別離等方法鑒定.本實(shí)驗(yàn)采用 CTAB 法提取 D

6、NA 并通過(guò)紫外吸收法鑒定.3 材料和試劑：3.1 長(zhǎng)春花葉片3.2 試劑(1)CTAB 提取緩沖液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA-Na2,1.4mol/LNaCl(如表 1),2%CTAB,使用前參加 0.1%(V/V)的,琉基乙醇.表 1CTAB 提取緩沖液配制試劑名就M.W.配制 1000mL配制 500mLTas1211412114 反60%EDTA-嗎372.247.-H48e土 72Mg&N5caSESE444481.816g用 HCl 調(diào) pH 值.(2)TE 緩沖液：10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA(pH8.

7、0).(3)氯仿/異戊醇：將氯仿和異戊醇按體積 24:1 的比例混勻,置棕色瓶中,4c 保存.4 儀器設(shè)備離心機(jī)、3 離心管、紫外分光光度計(jì)、微量移液器、吸頭、吸水紙、水浴鍋、冰箱、電子天平、高壓滅菌鍋、一次性手套、電泳儀等.5 方法與步驟：5.1 在提取過(guò)程中用到的吸頭,提取緩沖液等先高壓滅菌(121C,20min),取出后待用；5.2 取大約指甲蓋大小的植物葉片,放入1.5ml的EP管中,參加液氮,用鋼珠研磨成粉末狀,再參加 600 人的 CTAB 提取緩沖液,；5.3 65c 水浴鍋中水浴 40min,參加等體積的氯仿：異戊醇(24:1),輕輕混勻,顛倒幾次,乳化 1min.4C,11,

8、000rpm 離心 10min；5.4 吸上清到新離心管中(約 400l),參加等體積預(yù)冷異丙醇,混勻,-20C 放置 20min沉淀 DNA;5.5 5000rpm 常溫離心 15min,倒掉上清液；5.6 用 75%乙醇(900Nl)洗沉淀,11,000rpm 離心 2min,倒掉乙醇,再用乙醇同樣處理一次；5.7 置于枯燥儀枯燥 10min,將水分蒸干；5.8 參加 50 人去離子水,融解 DNA,同時(shí)參加 RNA 酶(按每 50 人 DNA 參加 1 山RNase),37c30min；5.9 利用分光光度計(jì)檢測(cè) OD260,同時(shí)進(jìn)行 1%凝膠電泳檢測(cè)；5.10 瓊脂糖電泳檢測(cè) DNA:

9、制作 1%的瓊脂糖凝膠,吸取提取的 DNA 溶液 5 小電泳檢測(cè)；5.11 -20C 保存 DNA 備用；5.12 提取的 DNA 的濃度檢測(cè)：取少量待測(cè) DNA 樣品,用蒸儲(chǔ)水稀釋 1,000 音；用蒸儲(chǔ)水做空白,分別在 260nm、280nm 測(cè) DNA 樣品的吸光值.【考前須知】1 .葉片磨得越細(xì)越好.2 .注意移液器的正確使用.3 .由于植物細(xì)胞中含有大量的 DNA 酶,因此,除在抽提液中參加 EDTA 抑制酶的活性外,第一步的操作應(yīng)迅速,以免組織解凍,導(dǎo)致細(xì)胞裂解,釋放出 DNA 酶,使 DNA 降解.6 .思考題1.制備的DNA在什么溶液中較穩(wěn)定？2 .為了保證植物DNA的完整性,

10、在吸取樣品、抽提過(guò)程中應(yīng)注意什么？7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果計(jì)算DNADNA濃度(PgniLgniL)=)=一稀樣倍數(shù)0.020L0.020L式中OD260nm為260nm處的光密度；L為比色杯光徑(cm);0.020為1itg/mLDNA鈉鹽的光密DNA的紫外吸收頂峰為260nm,吸收低峰為230nm,而蛋白質(zhì)的紫外吸收頂峰為280nm.上述DNA溶液適當(dāng)稀釋后,在751分光光度計(jì)上測(cè)定其OD260nm、OD230nm和OD280nm.如OD260nm/OD230nrr2OD260nm/OD280nrr1.8,表示RNA已經(jīng)除凈,蛋白含量不超過(guò)0.38 實(shí)驗(yàn)分析:傳統(tǒng)DNA1取方法CTAB 法、SD

11、S 法是在裂解細(xì)胞的根底上,屢次苯酚氯仿等有機(jī)溶劑抽提使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相,而核酸保存在水相,到達(dá)別離核酸的目的； 參加 RNA 酶除去核酸中的 RNA;然后參加異丙醇、乙醇等沉淀 DNA;用 70%乙醇漂洗沉淀,除去別離過(guò)程中殘留的有機(jī)溶劑和鹽離子,以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反響,最后用 TE 溶解 DNA 備用.CTAB是一種陽(yáng)離子去污齊1J,能與核酸形成復(fù)合物,此復(fù)合物在高鹽(0.7mol/L)濃度下可溶,并穩(wěn)定存在,但在低鹽濃度(0.10.5mol/LNaCl)下 CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀,而大局部的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中.通過(guò)有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白

12、、多糖、酚類等雜質(zhì)后參加乙醇沉淀即可使核酸別離出來(lái).經(jīng)離心棄上清后,CTAB-核酸復(fù)合物再用70%酒精浸泡可洗脫掉CTAB.SDS 是一種陰離子去垢劑,在高溫(5565C)條件下能裂解細(xì)胞,使染色體離析、蛋白變性,同時(shí) SDS 與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物,釋放出核酸；提升鹽(KAc 或NH4Ac)濃度并降低溫度(冰浴),使 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式,使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全,離心后除去沉淀；上清液中的 DNA 用酚/氯仿抽提,反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNAoSDS 法操作簡(jiǎn)單,溫和也可提取到高分子量的 DNA,但所得到的產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多.基因組 DNA 經(jīng)典

13、的提取方法由于無(wú)需昂貴儀器和藥品,提取的 DNA 純度能夠滿足一般分子生物學(xué)的需要,一直作為 DNA 提取的常規(guī)方法.但這種方法操作步驟復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng),易交叉污染,殘留在 DNA 溶液中有機(jī)物質(zhì)對(duì) DNA 聚合酶有抑制作用.另外,酚、 氯仿等有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染,有損操作者健康.DNA 提取新方法近年來(lái)出現(xiàn)了以螯合樹脂、特異性 DNA 吸附膜、離子交換純化柱及磁珠或玻璃粉吸附等根底 DNA 提取新方法.這些方法主要應(yīng)用于提取病毒、微生物、人和動(dòng)物細(xì)胞、包埋組織樣品、古生物標(biāo)本及土壤環(huán)境樣品 DNA.已有多篇利用純化柱和玻璃粉純化植物基因組 DNA的報(bào)道.馬小軍等將CTAB液提取和氯仿抽提兩步的上

14、清液直接通過(guò) Wizard 純化系統(tǒng)純化得到的 DNA,RAPD 擴(kuò)增效果良好,產(chǎn)率達(dá)2250ggg.張博等用硅珠(SiO2)顆粒吸附 DNA 純化方法,從不同樹木葉片中均得到了高質(zhì)量的 DNA 樣品.黃椰林等對(duì)常規(guī) CTAB 法提取的 DNA 用玻璃粉懸浮液純化,所獲 DN 的 APCR 產(chǎn)物能直接測(cè)序比擬適用于富含黏多糖、單寧、多酚和菇類化合物等次生代謝物的植物樣品和長(zhǎng)期保存的標(biāo)本材料.袁長(zhǎng)春等也用玻璃粉吸附法從富含酚類的茶類植物中提取純潔的總 DNA.目前國(guó)內(nèi)外開發(fā)了多種商品化的 DNA 提取純化試劑盒,具別離原理有的利用核酸的分子量差異,有的利用特異性膜與 DNA 結(jié)合到達(dá)別離、回收的

15、目的,如離子交換柱、磁珠等.這些試劑盒針對(duì)不同的材料來(lái)源設(shè)計(jì)了不同的提取方法,操作簡(jiǎn)單、高效,DNA 質(zhì)量較高,但價(jià)格昂貴,提取量少.著名的國(guó)外的試劑盒生產(chǎn)廠家有 Sigma2Aldrich、 Promega、 Invitrogen、 TaKaRa、 Whatman等,它們針對(duì)不同來(lái)源的材料如微生物、動(dòng)物體液、血液和組織、植物、加工產(chǎn)品、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品等開發(fā)出一系列的試劑盒.國(guó)內(nèi)的生物公司開展迅速,如上海生工、北京大為、北京博奧等也開發(fā)了系列試劑盒,質(zhì)量與國(guó)外廠家相當(dāng),價(jià)格較低.除此之外,由于核酸提取純化試劑盒制作門檻低,還有大量的生物公司提供試劑盒產(chǎn)品,使用者一定要慎重選擇.DNA 試劑盒經(jīng)過(guò)了幾十年的開展,已經(jīng)不再局限于單純的提取純化,有些廠家推出了 DNA 提取一擴(kuò)增 PCR 試劑盒,將 DNA 提取和 PCR 擴(kuò)增結(jié)合起來(lái),極大的提升了工作效