蠶絲蛋白生物高分子材料的應(yīng)用研究新進(jìn)展

1、蠶絲蛋白生物高分子材料的應(yīng)用研究新進(jìn)展鄧連霞,張海萍,楊明英,朱良均(浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所,浙江杭州310058摘要:本文綜述了浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所生物資源高分子材料實(shí)驗(yàn)室近5年來(lái)在蠶絲蛋白(絲素和絲膠高分子材料在高吸水材料、支架材料、醫(yī)用生物材料等領(lǐng)域的應(yīng)用研究成果。關(guān)鍵詞:蠶絲蛋白;絲素;絲膠;高分子材料中圖分類號(hào):S886.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0258-4069201403-005-04New Progress in Applied Research of Silk protein biopolymer materialsDENG Lian-xia,ZHANG Hai-

2、ping,YANG Ming-ying,ZHU Liang-jun (Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China Abstract:This paper summarized the application research achivement of silk protein biopolymer materials in superabsorbent polymer,scaffold,biomaterials and other fields of the laboratory of

3、 Bio-resources and Macromolecuar Material Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University in recent 5years.Key words:silk protein;fibroin;sericin;biopolymer materials基金項(xiàng)目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-22作者簡(jiǎn)介:鄧連霞(1986-,女,湖北荊州人,博士后,從事蠶絲蛋白生物資源高分子材料研究。E-mail :denglianxia2008 通信作者:朱良均,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail :ljzhu蠶絲蛋

4、白是一種性能優(yōu)良的天然蛋白,傳統(tǒng)上應(yīng)用于絲綢面料、纖維服飾等領(lǐng)域。隨著科技的進(jìn)步,蠶絲蛋白越來(lái)越多地被應(yīng)用于生物高分子材料領(lǐng)域,這對(duì)拓展蠶絲蛋白新用途、提高蠶絲行業(yè)整體經(jīng)濟(jì)效益等方面具有重要意義。浙江大學(xué)生物資源與生物高分子材料實(shí)驗(yàn)室,多年來(lái)致力于蠶絲蛋白的基礎(chǔ)研究12和蠶絲蛋白高分子材料的應(yīng)用研究,取得了一些階段性成果?，F(xiàn)把近5年來(lái)本實(shí)驗(yàn)室在蠶絲蛋白高分子材料應(yīng)用研究取得的一些進(jìn)展概述如下。1絲素方面1.1絲素基高吸水材料高吸水材料是一種具有較高吸水性能和保水性能的新型高分子材料3。高吸水材料經(jīng)適度交聯(lián)形成一定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),含有強(qiáng)親水基團(tuán),可通過(guò)水合作用迅速地吸收自重幾百倍乃至上千倍的水而

5、成凝膠狀聚合物4。與傳統(tǒng)的吸水材料不同,高吸水材料具有吸水倍率大,吸水速率快,保水能力強(qiáng),有效持續(xù)性強(qiáng)且無(wú)毒無(wú)味等優(yōu)點(diǎn)5。汪琦翀等6-7以具有良好生物分解性能的絲素蛋白(SF 為原料,將其與丙烯酸(AA 和丙烯酰胺(AM 共聚合成一種新型的絲素蛋白/丙烯酸/丙烯酰胺吸水材料(SF/AA/AM ,用紅外吸收光譜(FTIR 、掃描電鏡(SEM 、差示掃描量熱儀(DSC 對(duì)其結(jié)構(gòu)與性能進(jìn)行了分析,并對(duì)材料的吸水和保水性能進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明:SF/AA/AM 吸水材料在去離子水、自來(lái)水和0.9%NaCl 溶液中的吸水倍率分別為220308g/g ,135210g/g ,24.334.8g/g 。絲素

6、蛋白與丙烯酸和丙烯酰胺聚合良好,絲素蛋白引入后,使材料的熱分解溫度升高,材料具有較高的熔融溫度,吸水比表面增加。本研究為進(jìn)一步研發(fā)具有生物分解性的新型高吸水材料提供參考。第45卷第3期2014年8月Vol.45No.3Aug.,2014Bulletin of Sericulture··51.2新型絲素支架材料的體內(nèi)降解8絲素材料因其良好的生物相容性、可降解吸收性和能制備成多種形態(tài)的材料等性能,在組織工程支架材料方面的應(yīng)用被人們廣泛關(guān)注。目前在支架材料制備及材料與各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的相容性研究等方面已經(jīng)取得諸多成果。隨著對(duì)絲素支架材料研究向組織構(gòu)建和修復(fù)應(yīng)用方面的深入,調(diào)控絲素

7、支架材料在體內(nèi)的降解吸收過(guò)程顯得十分重要。將冷凍干燥法制備的新型絲素支架材料植入兔耳皮下進(jìn)行體內(nèi)降解試驗(yàn)。肉眼外觀觀察發(fā)現(xiàn)植入絲素支架材料部位的皮膚無(wú)明顯紅腫,經(jīng)過(guò)28周左右皮下材料植入部位的突起逐漸消失;組織切片觀察發(fā)現(xiàn)絲素支架材料引起的組織反應(yīng)較弱;掃描電鏡在28周時(shí)只觀察到將近消失的絲素支架材料種植腔,表明材料已基本降解。相比之下28周時(shí)絲素膜仍完好,無(wú)明顯降解。研究結(jié)果表明,冷凍致孔新型絲素支架材料有望開發(fā)成為一種生物相容性優(yōu)良的可降解吸收性組織工程支架材料。1.3羥基磷灰石/絲素復(fù)合支架9,10骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2是轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子(TGF-家族成員之一,具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、誘

8、導(dǎo)骨組織再生的能力,目前已廣泛應(yīng)用于骨組織工程研究之中。羥基磷灰石(HA是天然骨組織的主要無(wú)機(jī)成分,具有骨誘導(dǎo)性,能夠誘導(dǎo)新生骨的血管化,促進(jìn)新骨的形成,且植入體內(nèi)后不會(huì)引起炎癥反應(yīng),常用作骨修復(fù)材料。絲素蛋白(SF因其良好的生物相容性、降解性及獨(dú)特的力學(xué)性能等,廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。張艷紅等在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2的表達(dá),并通過(guò)體外復(fù)性獲得了rhBMP-2重組蛋白。利用該重組蛋白與HA/SF支架復(fù)合,制備了新型復(fù)合支架材料。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,該材料的生物相容性良好,是一種潛在的骨修復(fù)材料。1.4絲腺絲素支架材料相比于從繭殼里采取一些化學(xué)試劑溶解的方

9、法提取絲素,直接從絲腺里提取絲素更加環(huán)保。楊明英等11采用直接從絲腺里提取的絲素制備了支架材料。絲素取自五齡第7d的家蠶的中部絲腺。用冷凍干燥的方法制備了多孔支架。SDS-PAGE分析表明絲素分子量多在200kDa以上。SEM(掃描電鏡分析顯示支架孔徑均一且孔徑大小隨著絲素溶液濃度的增大而減小。通過(guò)力學(xué)萬(wàn)能測(cè)試機(jī)測(cè)試,支架的壓縮模量達(dá)6.9±0.4MPa。另外通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明,絲素支架具有較高的細(xì)胞粘附能力和增殖能力,同時(shí)也顯示出較高的堿性磷酸酶活性。絲腺絲素支架良好的抗壓能力和生物相容性使其有望應(yīng)用于骨組織工程。1.5絲素/殼聚糖復(fù)合支架施李楊等12以絲素和殼聚糖為原料,采用冷

10、凍干燥法制備絲素/殼聚糖支架,通過(guò)預(yù)礦化使羥基磷灰石(HA沉積,形成多孔羥基磷灰石-絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架。對(duì)復(fù)合支架進(jìn)行紅外吸收光譜(FT-IR、X射線衍射(XRD、掃描電子顯微鏡(SEM、熱重分析(TGA、力學(xué)性能和空隙率表征;采用WST-1方法檢測(cè)MG-63骨肉瘤細(xì)胞在復(fù)合支架上的增殖情況,評(píng)價(jià)其細(xì)胞相容性。結(jié)果顯示,沉積的HA結(jié)構(gòu)屬于弱結(jié)晶態(tài)范疇,主要位于孔壁上,且隨著預(yù)礦化循環(huán)次數(shù)的增加沉積量增多,使預(yù)礦化復(fù)合支架的彈性模量得到極顯著地提高,其孔隙率保持在90%左右的較高水平;WST-1檢測(cè)表明,含有HA的預(yù)礦化復(fù)合支架對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用,具有良好的細(xì)胞相容性。1.6海綿狀

11、絲素敷料因絲素蛋白良好的生物相容性,早在2500年前,絲素就被作為手術(shù)縫合線應(yīng)用于生物醫(yī)用材料方面。閔思佳等13采用納米銀顆粒和1.255.0%(v/v縮水甘油醚混合,再與絲素溶液共混冷凍干燥后得到海綿狀的絲素敷料。對(duì)敷料的力學(xué)性能,透氣性和吸濕性能進(jìn)行表征,發(fā)現(xiàn)材料具有良好的拉伸強(qiáng)度和彈性,敷于傷口上發(fā)現(xiàn)材料透氣性和吸濕性能均不錯(cuò)。吸濕率能每小時(shí)達(dá)到101g/m2,在干態(tài)和濕態(tài)下的吸濕倍率分別達(dá)到595.2%和251.9%。敷料中的納米銀在PBS緩沖液中處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài),抗菌性能良好。用新西蘭兔做實(shí)驗(yàn),將敷料敷于其背部創(chuàng)傷皮膚,發(fā)現(xiàn)17.7±2.4d后創(chuàng)傷完全愈合,明顯快于作對(duì)照的

12、豬皮敷料。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,海綿狀絲素敷料有巨大潛力應(yīng)用于人體皮膚創(chuàng)傷方面。目前這一研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。2絲膠方面2.1海綿狀純絲膠凝膠支架絲膠在自然狀態(tài)下能夠形成凝膠,但機(jī)械性能較差,不能滿足生物材料的要求。通過(guò)與其他生物高分子(如聚乙烯醇等復(fù)合或用交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)修蠶桑通報(bào)2014年第45卷第3期··6飾,可以明顯地提高絲膠凝膠的機(jī)械性能。而化學(xué)試劑的添加容易降低材料的生物相容性,因此若能少用或不用化學(xué)試劑來(lái)研制絲膠凝膠材料將是一個(gè)重要突破。張海萍等14以沸水法提取的普通繭層絲膠為原料,在不添加化學(xué)交聯(lián)劑的條件下,采用冷凍解凍的方法制備出一種新型的海綿狀絲膠凝膠支架材

13、料。通過(guò)對(duì)不同制備條件(如絲膠濃度、冷凍時(shí)間、冷凍溫度和冷凍解凍次數(shù)等下絲膠凝膠生成率的比較分析,確定了效率最高的絲膠凝膠制備工藝條件。并對(duì)不同條件下制備絲膠凝膠的多孔結(jié)構(gòu)、孔徑大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了研究,為開發(fā)實(shí)用性凝膠支架材料建立了基礎(chǔ)。2.2絲膠/甘油混合膜15一直以來(lái),由于絲膠的力學(xué)性能欠佳,限制了其在組織工程等方面的應(yīng)用。為改善絲膠膜的力學(xué)特性,在絲膠溶液中添加適量甘油以期能改變其性能。結(jié)果表明,不論在干態(tài)還是濕態(tài)下,均可以通過(guò)調(diào)節(jié)甘油的量來(lái)調(diào)節(jié)絲膠膜的拉伸性能。ATR-FTIR(傅里葉紅外光譜全反射和熱分析(TGA和DSC均表明甘油的加入促進(jìn)了膜的無(wú)定形結(jié)構(gòu)的形成。SEM(掃描電鏡

14、結(jié)果表明甘油的量在10wt%時(shí),絲膠和甘油混合得比較均一。絲膠膜拉伸性能的改善對(duì)其力學(xué)性能是一個(gè)優(yōu)化,增加了絲膠基高分子材料在組織工程應(yīng)用的可能性。2.3絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料16復(fù)合骨支架是重要的骨組織修復(fù)材料。用氫氧化鈣和磷酸濕法合成羥基磷灰石,按一定的比例加入到濃縮后的絲膠溶液中,經(jīng)冷凍干燥制備絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合骨支架材料。通過(guò)SEM、XRD、FTIR、DSC及力學(xué)性能等檢測(cè)方法,探討了制備工藝條件對(duì)絲膠/羥基磷灰石復(fù)合支架材料的影響及結(jié)構(gòu)性能。結(jié)果表明,絲膠/羥基磷灰石復(fù)合支架材料的孔隙分散均勻且孔與孔之間相互貫通,孔隙率為33.0%62.5%;為弱結(jié)晶,與人體骨中晶體

15、態(tài)相似;分子呈結(jié)構(gòu),熱分解溫度提高,熱學(xué)性能發(fā)生變化;彈性模量最大為15.64MPa。具有較好的力學(xué)性能。2.4絲膠蛋白基復(fù)合吸水材料目前廣泛使用的聚丙烯酸類高吸水材料生物降解性能差,對(duì)生態(tài)環(huán)境造成危害,同時(shí)其原料來(lái)源于日益枯竭的石油資源。因此,研究可生物降解吸水材料,對(duì)于減少環(huán)境污染等具有重要意義。絲膠蛋白是一種天然高分子,一般作為制絲生產(chǎn)的廢棄物。絲膠蛋白的氨基酸中含有大量極性基團(tuán)(如-OH、-COOH、-NH2等,具有較好的親水性、反應(yīng)活性和生物降解性。如能將絲膠蛋白變廢為寶作為生物資源加以利用,研制絲膠蛋白基可生物降解吸水材料,不僅豐富了吸水材料類型,也為絲膠蛋白資源利用提供了一條新途

16、徑17。本實(shí)驗(yàn)室在絲素蛋白基吸水材料的基礎(chǔ)上,以絲膠(Sericin為原料,丙烯酸(AA和丙烯酰胺(AM為單體,合成了具有生物降解性能的Sericin/PAA-AM復(fù)合吸水材料。研究了Sericin/PAA-AM復(fù)合吸水材料的合成條件如絲膠蛋白用量、單體配比、交聯(lián)劑用量、引發(fā)劑用量、中和度、反應(yīng)溫度、溶液pH等對(duì)復(fù)合吸水材料吸水性能的影響,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)五因素四水平正交試驗(yàn)獲得了最適宜的制備條件:反應(yīng)溫度60°C,反應(yīng)時(shí)間2h,絲膠與單體的配比為12,AA和AM的配比為2,引發(fā)劑用量為單體用量的2%,交聯(lián)劑用量為單體用量的0.3%,中和度為70%,pH為7。復(fù)合吸水材料的

17、吸收去離子水倍率為483g/g,吸收自來(lái)水倍率為296g/g,吸收0.9%NaCl溶液倍率為52g/g18?？紤]到Sericin/PAA-AM復(fù)合吸水材料吸水量的不足,嘗試把熱水沸煮提取的絲膠蛋白再用堿性蛋白酶進(jìn)一步水解得到不同分子量分布的絲膠溶液,并研究酶解改性處理?xiàng)l件對(duì)絲膠蛋白分子量分布的影響。研究表明,酶解濃度越高,絲膠蛋白分子量越小。在此基礎(chǔ)上,選擇合適的酶解改性絲膠蛋白,進(jìn)一步與丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合單體進(jìn)行接枝共聚,研制具有生物降解性的酶解絲膠/丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合吸水材料,研究不同酶解改性絲膠蛋白復(fù)合吸水材料的結(jié)構(gòu)與性能差異,闡明絲膠蛋白結(jié)構(gòu)差異對(duì)復(fù)合吸水材料的接枝率、吸水性、保水

18、性、生物降解性等的影響機(jī)制。研究表明,當(dāng)堿性蛋白酶和絲膠的質(zhì)量比為5mg/g時(shí),酶解絲膠/丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合吸水材料的接枝率、吸水率、保水率、生物降解均達(dá)到最大。在此條件下,經(jīng)冷凍干燥的酶解絲膠/丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合吸水材料吸收去離子水倍率達(dá)到896g/g,吸收自來(lái)水倍率為424g/g,吸收0.9%NaCl 溶液倍率為83g/g。本研究對(duì)于絲膠蛋白基生態(tài)功能材料研發(fā)具有參考意義。2.5絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合膜王雪云等19以乙醇處理的家蠶絲膠膜為模板,鄧連霞,等:蠶絲蛋白生物高分子材料的應(yīng)用研究新進(jìn)展··7參考文獻(xiàn)1張海萍,閔思佳,朱良均.用熱水解法制備不同分子質(zhì)量絲膠粉

19、的溶解性差異及其成因探討J.蠶業(yè)科學(xué),2008,34(3:477481.2Mingying Yang,Wen He,Yajun Shuai,et al.Nucleationof hydroxyapatite crystals by self-assembled bombyx mori silk fibroin.Journal of polymer science part b-polymerphysicsJ.2013,51(9:742748.3M.J.Zohuriaan-Mehr,A.Pourjavadi,H.Salimi,et al.Protein-and homopoly(aminoaci

20、d-based hydrogels withsuper-swelling propertiesJ.Polymers for AdvancedTechnologies,2009,20(8:655671.4K Prudnikova,M Utz.Electromechanical EquilibriumProperties of poly(acrylic acid/acrylamidehydrogelsJ.Macromolecules,2012,45(2:10411045.5P.C.Parvathy,A.N.Jyothi.Synthesis,characterizationand swelling

21、behaviour of superabsorbent polymers fromcassava starch-graft-poly(acrylamideJ.Starch-Stärke2012,64(3:207218.6汪琦翀,朱良均,閔思佳,等.絲素蛋白/丙烯酸/丙烯酰胺復(fù)合吸水材料的吸水性能探討J.蠶業(yè)科學(xué),2009,35(3:661665.7Qichong Wang,Liangjun Zhu,Sijia Min,et al.Synthesisand characterization of silk fibroin/acrylic acid/acrylamide superabs

22、orbent polymerJ.Polymer Materials Science and Engineering.2010,26(9:128131.8楊磊,陳宇,朱良均,等.一種新型絲素支架材料的體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)J.蠶業(yè)科學(xué),2011,37(4:713718.9張艷紅,姚菊明,朱良均.載入骨形態(tài)發(fā)生蛋白的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合支架的細(xì)胞相容性研究J.蠶業(yè)科學(xué),2011,37(4:700705.10Yanhong Zhang,Yinsun Ma,Mingying Yang,et al.Expression,purication,and refolding of a recombinant hum

23、anbone morphogenetic protein2in vitroJ.Protein Expression and Purication.2011,75:155160.11Mingying Yang,Yajun Shuai,Wen He,et al.Preparationof porous scaffolds from silk fibroin extracted from thesilk gland of bombyx moriJ.International Journal ofmolecular sciences.2012,13,77627775.12施李楊,鄧連霞,張海萍,等.預(yù)

24、礦化絲素/殼聚糖復(fù)合支架的性能及細(xì)胞相容性J.高分子材料科學(xué)與工程,2013.13Sijia Min,Xin Gao,Chunmao Han,et al.Preparation of asilk fbroin spongy wound dressing and its therapeutic efficiency in skin defectsJ.Journal of Biomaterials Science-Polymer Edition,2012,23(1-4:97110.14Haiping Zhang,Mingying Yang,Sijia Min,et al.Preparation a

25、nd characterization of a novel spongy hydrogel fromaqueous bombyx mori sericinJ.E-polymers,2008:66.15Haiping Zhang,Lianxia Deng,Mingying Yang,et al.Enhancing Effect of Glycerol on the Tensile Properties ofBombyx mori Cocoon Sericin FilmsJ.International Journal of Molecular Sciences.2011,12:31703181.16王琳婷,楊明英,朱良均,等.絲膠蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料的制備及性能研究J.蠶業(yè)科學(xué),2010,36(4:639644.17Lianxia Deng,Haiping Zhang,Liangjun Zhu,et al.Synthesis and characterization of silk sericin/acrylic acid/acrylamide superabsorbent polymerJ.Journal of fiberbioengimeering&am