抗CD20人源化抗體的制備及生物學活性鑒定

1、收稿日期:2009207221;修回日期:2009209204基金項目:國家自然科學基金重點項目(30830109;“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2009ZX095032009作者簡介:楊揚(19802,女,本科,技師,主要從事基因工程抗體研究。通訊作者:李博華(E 2mail :bohuali 抗CD20人源化抗體的制備及生物學活性鑒定楊揚1,張大鵬1,2,吳蘭1,郭懷祖1,2,聶麗2,錢衛(wèi)珠1,2,王皓1,2,李博華1,2(1.第二軍醫(yī)大學腫瘤研究所,上海200433; 2.抗體藥物國家工程研究中心,上海201203摘要:在前期實驗中,我們制備了一株抗CD20的嵌合抗體c8F6并證實其可有

2、效殺傷CD20陽性的B 淋巴瘤細胞。為了進一步降低c8F6的免疫原性,在研究中我們采用同源模建的方法模擬8F6的三維結構,通過分析其空間結構,確定可能影響抗體與抗原結合的框架區(qū)(FR 氨基酸殘基,然后將鼠源抗體互補決定區(qū)(CDR 和FR 區(qū)的關鍵氨基酸移植到人源模板上,構建出人源化抗體hu8F6。此人源化抗體除CDR 區(qū)外,僅含有11個鼠源殘基,但具有與嵌合抗體相似的親和力和特異性。體外生物學功能實驗進一步表明,hu8F6具有與c8F6相似的補體依賴的細胞溶解作用(CDC 和抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC ,可有效殺傷人B 淋巴瘤細胞Raji 和Daudi ,提示hu8F6有望發(fā)展成為

3、一個用于B 淋巴瘤治療的低免疫原性抗體制劑。文獻標識碼:A文章編號:100122478(20090620491206非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin s lymp homa ,N HL 是臨床上最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤,其中B 細胞來源的約占85%。近年來,單克隆抗體及其導向治療N HL 的臨床試驗研究取得了重大進展,其中被廣泛使用且富有成效的是抗CD20的單抗制劑1。CD20抗原是一種B 細胞分化抗原,僅位于前B 細胞和成熟B 細胞,它在95%以上的B 細胞性淋巴瘤中表達,而在造血干細胞、血漿細胞和其他正常組織中不表達。更為重要的是,CD20分子在與單克隆抗體結合后,無顯著內化及脫落,

4、故成為治療B 細胞淋巴瘤的理想靶點2,3。c8F6是我們實驗室研制的一株以CD20為靶點的人/鼠嵌合基因工程抗體,包含了鼠單克隆抗體8F6的可變區(qū)基因和人抗體的恒定區(qū)基因。研究表明,c8F6具有對B 淋巴瘤細胞強大殺傷作用,包括補體依賴的細胞溶解作用(CDC 作用和抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC ,因而可望發(fā)展成治療B 細胞淋巴瘤的靶向抗體制劑(另文發(fā)表。但是人/鼠嵌合抗體的FR 區(qū)內仍含有較多的鼠源氨基酸參加,具有較高的免疫原性,可能會影響抗體在人體內的應用。在研究中,為了進一步降低c8F6抗體的免疫原性,我們將鼠源抗體的CDR 移植到人源抗體模板中,通過計算機輔助設計成功構建了高親

5、和力的8F6人源化抗體(hu8F6并鑒定了它的體外抗腫瘤活性。1材料與方法1.1載體、菌株和細胞pcDNA3.1(+和pcD 2NA3.1/ZEO (+載體購自美國Invit rogen 公司。含有人Ig G1重鏈恒定區(qū)(C H 及輕鏈恒定區(qū)(CL 的載體p GEM 2T/C H 和p GEM 2T/CL 由本室構建保存。大腸桿菌T G1由本室傳代保存。非洲綠猴腎細胞COS 27、中國倉鼠卵巢細胞CHO 2K1及人淋巴瘤細胞株Daudi 和Raji 購自美國A TCC 。1.2工具酶及主要試劑限制性內切酶購自Pro 2mega 公司;Taq DNA polymerase 購于美國In 2vit

6、rogen 公司。RPM I 1640培養(yǎng)基、DM EM 培養(yǎng)基購自Invit rogen 公司;Lipofectamine2000Rea 2gent 購于G ibco BRL 公司;HRP 2goat anti 2human Ig G (H +L ,FITC 2goat anti 2humam Ig G (H +L 購自Zymed 公司,HRP 2goat anti 2human kappa 購自Sout hern Biotechnology Associates 公司,G oatanti 2human Ig G (Fc 購自KPL 公司,Human mye 2loma Ig G1,kapp

7、a 購自Sigma 公司,LD H 非放射性試劑盒購自Promega 公司。1.38F6單抗可變區(qū)(Fv 三維結構的同源模建利用Accelrys公司的Insight II程序包來模擬8F6單抗可變區(qū)的三維結構,具體步驟如下:(1用BL AST程序在蛋白質結構數據庫(Protein Data Bank,PDB中搜索目標蛋白的同源蛋白序列,以同源性最高的蛋白作為模板蛋白;(2利用結構疊合方法對模板蛋白進行結構相似性分析,確定模板蛋白的結構保守區(qū)(st ruct urally conserved re2 gions,SCR和無規(guī)則環(huán)區(qū)(loop;(3通過將目標蛋白序列與其同源模板序列聯(lián)配以確定目標蛋

8、白的SCR區(qū)和Loop區(qū);(4將模板蛋白的SCR區(qū)空間結構坐標賦予目標蛋白;(5計算模擬產生目的蛋白的Loop區(qū)并賦予空間坐標;(6采用能量最小化和分子動力學兩種方法對初始結構進行優(yōu)化,使預測的結構在能量和物化上趨于合理;(7對模建結構進行合理性驗證。1.4人源化抗體的設計分別選擇人免疫球蛋白重鏈III亞組(heavy chain subgroup III(hum III和Ig鏈I亞組(light chainsubgroup I,humkI的一致序列(consensus sequences作為8F6抗體輕重鏈的人源化模板,將8F6的重鏈和輕鏈CDR區(qū)分別移植到人源模板上,構成直接的CDR移植抗

9、體。將人源FR區(qū)中某些重要殘基回復突變成鼠源殘基以恢復抗體的活性。根據我們模建的8F6單抗的可變區(qū)三維結構,分析在CDR區(qū)周圍5!的空間范圍內可能影響原鼠源抗體CDR構象的FR區(qū)殘基。如果這些殘基在原鼠源和人源模板中不同,在人源化抗體中這些位置的殘基將保留為鼠源殘基。1.5人源化抗體表達載體構建人源化抗體輕鏈可變區(qū)(V L及重鏈可變區(qū)(V H基因均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,用Overlapping PCR將人源化抗體輕鏈可變區(qū)基因V L與人抗體輕鏈恒定區(qū)基因C L直接拼接起來,在人源化輕鏈基因的5端加上Hind III酶切位點,3端加上Eco R I位點,PCR產物經瓊脂糖凝膠電

10、泳純化回收并克隆到p GEM2T vector中,得p GEM T2V L C L,篩選陽性克隆測序。用Hind III和Eco R I雙酶消化,將V L C L從p GEM T2V L C L載體上切下,克隆到同樣酶解的pcDNA3.1/ZEO(+中,得pcDNA3.1/ ZEO(+2V L C L,經酶切鑒定構建的表達載體。用Overlapping PCR將人源化抗體重鏈可變區(qū)基因V H與人抗體重鏈恒定區(qū)基因C H直接拼接起來,在人源化重鏈基因的5端加上Hind III酶切位點,3端加上Eco R I位點,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到p GEM2T vector中,得p GE

11、M T2V H C H,篩選陽性克隆測序。用Hind III 和EcoR I雙酶消化,將V L C L從p GEM T2V H C H載體上切下,克隆到同樣酶解的pcDNA3.1(+中,得pcDNA3.1(+2VHCH,經酶切鑒定構建的表達載體。1.6COS21細胞的瞬時轉染于24孔組織培養(yǎng)板中接種0.8×105/孔的COS21細胞,用10%FCS 的RPMI1640/DM EM混合培養(yǎng)基(16/DM培養(yǎng)基培養(yǎng)至90%95%融合度時進行轉染:取質粒1g(輕鏈表達載體0.6g;重鏈表達載體0.4g和2l Lipofectamine2000Reagent分別溶于50l 無血清16/DM培

12、養(yǎng)基,室溫靜置5min,將以上2種液體混合,室溫孵育20min以使DNA2脂質體復合物形成,其間用0.5ml無血清的16/DM培養(yǎng)基替換24孔板中的含血清培養(yǎng)基,然后將形成的DNA2脂質體復合物加入到孔中,CO2孵箱培養(yǎng)4h 后補加0.5ml含20%FCS的16/DM培養(yǎng)基,置于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng),72h后取培養(yǎng)上清進行分析,采用EL ISA確定培養(yǎng)上清中抗體的含量。1.7E LISA法檢測篩選高表達克隆采用EL ISA 確定培養(yǎng)上清中抗體的含量:G oat anti2human Ig G(Fc包被于EL ISA板,4過夜,用2%BSA2 PBS于37封閉2h,加入待測的培養(yǎng)上清和標準品(H

13、uman myeloma Ig G1,37孵育2h,加入HRP2goat anti2human kappa進行結合反應, 37孵育1h,加入TMB于37作用5min,最后用H2SO4終止反應,測A450值。1.8人源化抗體在CHO細胞中的穩(wěn)定表達于3.5cm組織培養(yǎng)皿中接種3.5×105的C HO細胞,細胞培養(yǎng)至90%95%融合時進行轉染:取質粒10g(重鏈表達質粒4g,輕鏈表達質粒6g和20l Lipofectamine2000Reagent分別溶于500l無血清DM EM培養(yǎng)基,室溫靜置5min,將以上2種液體混合,室溫孵育20min以使DNA2脂質體復合物形成,其間用3ml無血

14、清的DM EM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基,然后將形成的DNA2脂質體復合物加入到板中,CO2孵箱培養(yǎng)4h后補加3ml含10%血清的DM EM完全培養(yǎng)基,置于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染進行24h后細胞換含600g/ml G418和250g/ml Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆,用有限稀釋法進行亞克隆。取細胞培養(yǎng)上清用EL ISA檢測篩選高表達克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),用ProteinA親和柱分離純化人源化抗體,將純化抗體用PBS進行透析,最后以紫外吸收法定量。1.9抗原結合活性檢測將人Raji細胞用2% FCS2PBS重懸成1×106cells/m

15、l,分別加入不同稀釋度的含人源化抗體的COS細胞培養(yǎng)上清,置于4孵育60min,用2%FCS2PBS洗細胞2遍,再加入FITC2goat anti2human Ig G(H+L于4孵育60min,洗細胞后用FCM分析并計算細胞的熒光強度。Human Ig G為一純化的抗CD3人源化單克隆抗體,不與CD20+細胞結合,作為對照。1.10競爭抑制實驗將固定的亞飽和濃度的熒光標記抗體FITC28F6和系列稀釋的未標記純化抗體分別混合后加入到靶細胞Raja(1×106/ml中,4孵育60min,1%FCS2PBS洗細胞2遍,流式細胞儀檢測并用Cellquest軟件分析。Human Ig G作

16、為對照。競爭抗體的每個濃度設3個復管,計算半數抑制濃度IC50值,最大熒光強度表示在沒有競爭抗體時獲得的平均熒光強度。1.11CDC和ADCC分析同濃度的對照抗體、嵌和抗體及人源化抗體分別和細胞(Raji和Daudi于無酚紅DM EM培養(yǎng)基中在CO2培養(yǎng)箱孵育1h 后,按10%體積比加入人血清(用于測定CDC或按效靶比501加入新鮮分離的人外周血單個核細胞(用于測定ADCC,于CO2培養(yǎng)箱孵育4h后, LD H非放射性試劑盒顯色。0.2%Triton X2100作用作為100%殺傷的對照。2結果2.18F6單抗可變區(qū)(Fv三維結構的同源模建用BL AST程序在PDB庫中分別搜索8F6重鏈和輕鏈

17、可變區(qū)蛋白的模板蛋白。我們選取同源性最高的抗體2E27的重鏈(同源性84%和1F H5的輕鏈(同源性94%分別作為8F6重鏈和輕鏈的模板用Insight II軟件進行同源模建。利用Insight II程序模建出8F6可變區(qū)的三維結構(圖1。2.28F6人源化抗體的設計人免疫球蛋白重鏈III亞組的一致序列與8F6抗體重鏈的同源性為52%,人免疫球蛋白Ig鏈I亞組的一致序列與8F6抗體輕鏈的同源性為61%。首先將8F6的重鏈和輕鏈CDR區(qū)分別直接移植到人源模板上,構成CDR移植抗體,重鏈為hu8F6V Ha,輕鏈為hu8F6VLa。其序列如圖2所示,將輕重鏈達載體共轉染COS27細胞,用流式細胞術

18、測定抗體的抗原結合活性,結果發(fā)現與8F6嵌合抗體相比,hu8F6V Ha和hu8F6VLa組成的人源化抗體(hu8F6V Ha/hu8F6VLa的活性幾乎完全喪失(圖3 。394 圖3流式細胞術檢測抗CD20人源化抗體的抗原結合活性1×106cells/ml人Raji細胞分別加入不同稀釋度的含人源化抗體的COS細胞培養(yǎng)上清,4孵育60min,用2%FCS2 PBS洗細胞后,加入FITC2goat anti2human Ig G(H+L于4孵育60min,洗細胞后用FCM分析并計算細胞的熒光強度。Human Ig G為一純化的抗CD3人源化單克隆抗體,不與CD20+細胞結合,作為對照。

19、通過分析模建的8F6單抗可變區(qū)的三維結構,我們發(fā)現關鍵FR區(qū)殘基有11個,分別為L3、L4、L46、L49和H30、H48、H49、H68、H72、H74、H79,氨基酸序數參照Kabat方法標識5。將這些鼠源氨基酸殘基保留在構建的CDR 移植抗體中可得到人源化抗體(hu8F6V Hb/ hu8F6VL b。其序列如圖2所示。將其表達載體基因共轉染COS細胞,用流式細胞術測定抗體的抗原結合活性,發(fā)現其與CD20陽性細胞Raji的結合活性與8F6嵌合抗體相似(圖3,將這個人源化抗體(hu8F6V Hb/hu8F6VL b命名為hu8F6。2.3競爭抑制實驗實驗結果如圖4所示,抗體hu8F6和c8

20、F6都能有效地競爭抑制熒光標記抗體FITC28F6與Raji細胞的結合?？贵whu8F6的IC50值(1.753±0.122與c8F6的IC50值(1.724±0.145無顯著性差異(P>0.5,表明人源化抗體hu8F6和嵌和c8F6具有相似的親和力及特異性。2.4抗CD20抗體介導的CDC和ADCC作用CDC試驗結果(圖5A表明人源化抗體hu8F6具有與嵌合抗體c8F6相似的CDC活性,在10g/ml 濃度時hu8F6對Daudi細胞和Raji細胞的殺傷率分別為92%和85%,而c8F6的殺傷率分別為91%(Daudi細胞和86%(Raji細胞。圖5B顯示了不同濃度下

21、hu8F6和c8F6介導的ADCC作用,由結果可以看出它們具有相似的ADCC活性,在10g/ml濃度時,hu8F6可以殺傷55%的Daudi 細胞和25%的Raji細胞,而c8F6對Daudi細胞和Raji細胞的殺傷率分別為56%和24% 。3討論自從1975年K ohlor等5應用雜交瘤技術首次制備出了單克隆抗體,人們就希望能利用單抗的特異性對惡性腫瘤等難治性疾病進行靶向治療。但雜交瘤技術生產的鼠源單抗用于人類疾病的治療時存在著嚴重缺陷6,最主要的問題是引起HAMA,其可加快血清中鼠源單抗的清除,阻斷單抗的治療效果。由于采用傳統(tǒng)的雜交瘤技術難以獲得合乎需要的人源抗體,單抗導向治療曾一度陷入低

22、谷。進494現代免疫學2009年第29卷第6期入上世紀90年代以后,隨著人源化抗體及人源抗體制備技術的不斷發(fā)展,已有多個抗體藥物通過美國FDA的批準上市或進入了臨床研究,展示出美好的應用前景。最早的人源化抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)和人源抗體的恒定區(qū)組成的嵌合抗體,其抗原親和力保持得很好,同時免疫原性也得到了一定程度的下降?？贵w的可變區(qū)是由CDR區(qū)和FR區(qū)組成的, CDR是高度可變的區(qū)域。FR區(qū)相對保守,它是可變區(qū)中產生免疫原性的主要區(qū)域。嵌合抗體由于保留了全部的鼠可變區(qū),臨床應用時仍可能發(fā)生強烈的HAMA反應。為了進一步降低嵌合抗體的免疫原性,人們考慮將鼠CDR區(qū)直接移植到人源抗體可變區(qū)中的FR

23、區(qū)上,得到人源化抗體7,8。在研究中,為了進一步降低抗CD20嵌合抗體c8F6的免疫原性,我們采用CDR移植的方法對它進行了人源化改造。首先,我們將鼠源抗體的CDR區(qū)直接移植到人源抗體模板中,結果發(fā)現這種簡單CDR移植構建的人源化抗體的親和力基本完全喪失。這并不奇怪,因為抗體可變區(qū)中的框架區(qū)(FR不僅提供了CDR的空間構象環(huán)境,有時還直接參與抗原抗體的相互結合,單純的CDR移植往往降低甚至喪失原抗體的親和力,只有將FR中某些與CDR緊密接觸的重要殘基回復突變成鼠源殘基才能恢復抗體的活性911。計算機輔助分子設計可用于鑒定這些重要的FR區(qū)殘基。因此,我們采用計算機輔助分子設計系統(tǒng)模建了8F6單抗

24、可變區(qū)的三維結構并對可能影響抗體結合活性的FR區(qū)殘基進行了分析鑒定。發(fā)現在CDR區(qū)周圍5!的空間范圍內可能影響原抗體CDR構象而又與人源模板中相應位置不同的FR區(qū)殘基有11個,分別為L3、L4、L46、L49和H30、H48、H49、H68、H72、H74、H79。將這些鼠源氨基酸殘基保留在構建的CDR移植抗體中得到了高親和力的人源化抗體hu8F6,它和Raji細胞的結合活性與嵌合抗體相似。在競爭抑制實驗中,可以通過比較IC50值來對抗體的相對親和力進行評價12。在本研究中, hu8F6與其嵌合抗體c8F6的IC50值接近,表明它們具有相似的相對親和力。體外生物學功能分析進一步表明hu8F6具

25、有與c8F6相似的CDC和ADCC 作用,為以后的體內抗腫瘤作用研究奠定了基礎。作為人源化單克隆抗體,當用于臨床治療時, hu8F6可能比它的鼠源抗體或嵌合抗體具有更好的治療效果。參考文獻1Maloney D G.Immunot herapy for non2Hodgkins lymphoma:monoclonal antibodies and vaccinesJ.J Clin Oncol,2005,23:642126428.2Tedder TF,Streuli M,Schlossman SF,et al.Isolation andstructure of a cDNA encoding t

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31、a cells Raji and Daudi , suggesting t hat it might be a p romising t herapeutic agent fo r B2cell lymp homa. Key words : humanizatio n ; immunogenicity ; molecular modeling ; monoclonal antibody ; 8 F6 ric version. Furt her st udies showed t hat hu8 F6 was as effective as c8 F6 in mediating complement2dependent cytoto xicity ( CDC Preparation and characterization of a humanized anti2human CD20 mon2 oclonal antibody M e dical U ni versi t y , S han g hai 200433 , Chi na; 2 . N ational En gi neeri n g Research Center f or A n