生物化學第十五章DNA的生物合成

1、第十五章第十五章 DNA的生物合成的生物合成DNA的生物合成的生物合成19531993“We have discovered the secret of life!”We have discovered the secret of life!”第一節(jié)第一節(jié) 中心法則中心法則 （central dogma） 復制復制：是親代雙鏈DNA按堿基配對原則，準確形成兩個相同核苷酸序列的子代DNA分子的過程。兩條DNA鏈都可作為復制的模板。 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄：是以一條DNA鏈為模板，將DNA鏈上儲存的遺傳信息按堿基配對原則準確轉(zhuǎn)換成互補的mRNA的過程。 翻譯翻譯：是以mRNA為模板，將mRNA上的遺傳信息轉(zhuǎn)換成

2、蛋白質(zhì)的氨基酸序列的過程。 中心法則中心法則：遺傳信息由DNA mRNA PRO的流動途徑。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復制復制復制復制DNARNA中心法則中心法則：遺傳信息由DNA mRNA PRO的流動途徑。補充和完善之處：A：RNA作為遺傳物質(zhì)能自我復制，并作為mRNA指導PRO的合成。 B：RNA能以逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。 一、DNA的生物合成 DNA的生物合成有兩條途徑： DNA的復制（主要）；RNA的反向轉(zhuǎn)錄（次要）。 （一）DNA的半保留復制 提出背景： 1953年Watson和Crick在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎上提出了DNA半保留復制假說。 子代D

3、NA分子中總是保留一條來自親代DNA的復制方式稱為“半保留復制”。 1958年Meselson和Stahl首次用同位素標記法得到證實。DNA的的半保留復制的概念半保留復制的概念 DNA在復制時，兩條在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組模板鏈互補的新鏈，以組成新的成新的DNA分子。這樣新分子。這樣新形成的兩個形成的兩個DNA分子與親分子與親代代DNA分子的堿基順序完分子的堿基順序完全一樣。由于子代全一樣。由于子代DNA分分子中一條鏈來自親代，另子中一條鏈來自親代，另一

4、條鏈是新合成的，這種一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制復制方式稱為半保留復制。1515N-DNAN-DNA的密度大于的密度大于1414N-DNAN-DNA的密度的密度 （二）DNA復制的起始點和方向 1、起始點 DNA復制的起始點是含有100-200個堿基的一段DNA。先是DNA的兩條鏈在起始點分開形成叉子樣的“復制叉（replication fork）”，也叫“生長點（growing point）”隨著復制叉的移動完成DNA的復制過程。 細胞內(nèi)存在能識別起始點的特種蛋白質(zhì)。 2、方向 DNA復制可以朝一個方向（單向復制，unidirectional），也可以朝兩個相反方向進行（雙向

5、復制，bidirectional，主要）。 DNA復制一般是對稱的，兩條鏈同時進行，也有不對稱的，一條鏈復制完后再進行另一條鏈的復制。 在迅速生長的原核生物中，第一個染色體DNA分子的復制還未完成，第二個DNA分子就在同一個起始點上開始復制。 ( (二二) )與與DNA復制有關的酶和蛋白質(zhì)（原核生物）復制有關的酶和蛋白質(zhì)（原核生物）解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解鏈酶解鏈酶RNA引物引物引物酶和引引物酶和引發(fā)體發(fā)體DNA聚合聚合酶酶ISSB3 3 5 3 5 5 RNA引引物物1.1.DNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 polpol (1)(1) 具具5 35 3聚合酶活性聚合

6、酶活性 將脫氧核糖核苷三磷酸dNTP逐個添加到具有3OH末端的多核苷酸鏈上形成3， 5磷酸二酯鍵。 特點特點：A：底物為d NTP； B：DNA模板 (3 5)； C：引物：RNA引物 （帶3羥基） ； D：方向 5 3； F：產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同 。 DNA聚合酶催化的鏈延長反應聚合酶催化的鏈延長反應5 RNA引物引物子鏈3 355335533 5 模板鏈 (2) 具有具有3 5端核酸外切酶端核酸外切酶的活性的活性 有校對功能，能在3OH端將DNA鏈水解。以保證DNA復制的真實性。 DNADNA聚合酶的聚合酶的3 - 5 外切酶水解位點外切酶水解位點3 3 5 5 錯配堿基錯配堿基3

7、- 5 核酸外切核酸外切酶水解位點酶水解位點(3)(3) 具有具有5 5 33端核酸外切酶端核酸外切酶的活性的活性 由5端水解DNA鏈，主要是切去一小段DNA，包括RNA引物和損傷DNA部分。 polpol主要功能主要功能： 用于修復DNA雙螺旋區(qū)中的單鏈區(qū)，這些單鏈區(qū)是在DNA復制時或DNA受損傷后留下的?；钚愿??；钚愿?。 DNA聚合酶聚合酶5 - 3 外切酶活力外切酶活力5 - 3 核酸外切核酸外切酶水解位點酶水解位點單鏈缺口單鏈缺口5 DNADNA聚合酶聚合酶 polpol 具有3 5端核酸外切酶的活性,主要負責DNA的修復，在一定程度上參與DNA復制。活性活性低低。功能不十分清楚，是一

8、種修復酶修復酶。 DNADNA聚合酶聚合酶 polpol 是使DNA鏈延長的主要聚合酶，目前已知全酶是由7種多肽形成的復合物，含有10種共22個亞基組分（22222222222）和Zn原子。 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶全酶的結(jié)構(gòu)和功能全酶的結(jié)構(gòu)和功能 延長因子延長因子DNADNA聚合酶聚合酶 兩個兩個 亞基夾住亞基夾住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶異二聚體異二聚體核心酶核心酶校對校對引物的結(jié)引物的結(jié)合和識別合和識別促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化（1）亞基：具5 3端聚合酶活性（需模板和引物）；（2）亞基具3 5端核酸外切酶的活性。校對作用，以提高保真性；（3）、亞基相連形成核心

9、酶pol，亞基起組建作用；（4）核心酶+亞基后成為二聚體，稱為pol；（5）pol與、亞基結(jié)合，形成pol，、亞基可增強酶與模板的結(jié)合；（6）pol與亞基結(jié)合形成全酶，亞基猶如夾子，夾住DNA向前滑動，不脫離，提高持續(xù)合成能力。 大腸桿菌三種大腸桿菌三種DNA聚合酶比較聚合酶比較DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每個細胞的分子統(tǒng)計數(shù)每個細胞的分子統(tǒng)計數(shù)5 -3 聚合酶作用聚合酶作用3 -5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用5 -3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶聚合酶109，000400+1120，000100+-0 .05400，00010-20+-50比較項目比較項目DNA聚

10、合酶聚合酶切除引物切除引物修復修復修復修復復制復制功能功能 1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶年發(fā)現(xiàn)聚合酶 和和，它們涉及，它們涉及DNA的錯誤傾向的錯誤傾向修復（修復（errooune repair） pol pol不是不是DNADNA復制酶復制酶，理由：，理由： A A、該酶合成該酶合成DNADNA速度太慢，只是細胞速度太慢，只是細胞內(nèi)內(nèi)DNADNA復制速度的復制速度的1%1%； B B、持續(xù)合成能力較低，而細胞內(nèi)持續(xù)合成能力較低，而細胞內(nèi)DNADNA復制不會頻繁中止；復制不會頻繁中止； C、許多基因突變都會影響許多基因突變都會影響DNA復制，復制，但都與但都與polpol無關。無關。 DNADNA聚合

11、酶聚合酶 pol polpol pol 1999年發(fā)現(xiàn) ，涉及DNA的錯誤損傷修復。能在DNA許多損傷部位繼續(xù)復制，而正常的pol、pol、pol在此部位不能形成正確堿基配對而停止復制，在跨越損傷部位時造成錯誤傾向的復制。 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶：有六種聚合酶：有六種：在DNA復制中起主要作用，與隨后鏈合成有關；：在DNA復制中起主要作用，與領頭（前導）鏈合成有關，具有3 5端核酸外切酶的活性；：修復功能； ：位于線粒體中，與線粒體DNA復制有關；：具3 5端核酸外切酶的活性； 附屬蛋白：具3 5端核酸外切酶的活性。 2. 解螺旋酶解螺旋酶（helicase） 使DNA雙螺旋的

12、兩條鏈分開。條件條件：ATP提供能量，有單鏈DNA存在。 隨后鏈：解旋酶結(jié)合于它的模板上，移動方向是5 3； 領頭鏈：另一種解旋酶叫rep蛋白，移動方向是3 5。 3.3.拓撲異構(gòu)酶（拓撲異構(gòu)酶（DNADNA松弛酶）松弛酶） （topoisomerase） 涉及超螺旋的松弛，復制后又涉涉及超螺旋的松弛，復制后又涉及到它們的再次形成。及到它們的再次形成。 正超螺旋（左）：雙螺旋DNA處于擰緊狀態(tài)時形成的超螺旋，使DNA解開雙螺旋困難： 負超螺旋（右）：雙螺旋DNA處于擰松狀態(tài)時形成的超螺旋。 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶 解開解開DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)。包含兩種：的超螺旋結(jié)構(gòu)。包含兩種：拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶

13、（轉(zhuǎn)環(huán)酶）（轉(zhuǎn)環(huán)酶）：在：在DNA的特定部位將的特定部位將雙鏈中的雙鏈中的一條一條切開，使鏈的末端沿螺旋軸松解的切開，使鏈的末端沿螺旋軸松解的方向轉(zhuǎn)動，然后將切口封閉，使方向轉(zhuǎn)動，然后將切口封閉，使DNA分子呈松弛分子呈松弛狀態(tài)。（不需要狀態(tài)。（不需要ATP供能）。供能）。拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶（旋轉(zhuǎn)酶）：（旋轉(zhuǎn)酶）：將將DNA特定部位的特定部位的兩兩條條鏈均切開，使鏈均切開，使DNA分子去除超螺旋，變?yōu)樗沙诜肿尤コ菪優(yōu)樗沙跔顟B(tài)。（需要狀態(tài)。（需要ATP供能）。供能）。 拓撲異構(gòu)酶對DNA的超螺旋進行精確調(diào)節(jié)，從而在DNA重組修復和DNA其它轉(zhuǎn)變中起作用。分為兩類：拓撲異構(gòu)酶：可瞬時打開

14、雙螺旋的一條鏈，然后再連接。不需能量，同轉(zhuǎn)錄相關。拓撲異構(gòu)酶；使DNA雙鏈同時斷裂，然后再連接。需能量ATP，同復制相關。 拓撲異構(gòu)酶可除去負超螺旋，拓撲異構(gòu)酶可引入負超螺旋，消除復制前產(chǎn)生的正超螺旋，協(xié)同作用控制DNA拓撲結(jié)構(gòu)，有利于DNA解開雙螺旋。4. 引發(fā)酶（引物合成酶）引發(fā)酶（引物合成酶） 引物的合成由引發(fā)酶催化完成，這些酶在模板單鏈DNA上識別特殊序列，合成RNA引物。它本身沒有活性，需要與“引發(fā)前體”結(jié)合在一起，形成“引發(fā)體”后才有活性。 復制早期易發(fā)生堿基參入錯誤，用復制早期易發(fā)生堿基參入錯誤，用RNA較好，然后通過較好，然后通過polpol的的5 3端端核酸外切酶的活性切去，

15、代之以核酸外切酶的活性切去，代之以dNMP，可可消除最初階段的錯誤。消除最初階段的錯誤。 5. 其它蛋白因子其它蛋白因子(1)(1)、單鏈結(jié)合蛋白、單鏈結(jié)合蛋白（single-strand binding protein，SSB） 結(jié)合在單鏈DNA分子上，功能是穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復性和保護單鏈不被核酸酶降解。 (2)(2)、引發(fā)前體、引發(fā)前體 由六種蛋白質(zhì)組成（DnaB、DnaC、Dnan、Dnan、Dnan、Dnai），與RNA引物合成酶結(jié)合，組裝成引發(fā)體（primosome） 。 功能：識別合成起始位點功能，可沿模板鏈方向移動，移動到一定位置即可引發(fā)RNA引物合成，從而合成領頭

16、鏈和岡崎片段。 引發(fā)體成分引發(fā)體成分6. DNADNA連接酶連接酶 催化子代雙鏈DNA中的切口處的相鄰3OH和5磷?；g形成磷酸二酯鍵。但不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來。 同時該酶要求含有3OH和5磷酰基的DNA片段能以氫鍵與互補鏈結(jié)合。 DNA3OHP5DNAATP（NAD+） DNA3OP5DNAAMPPPi（NMN） E,coli連接酶連接酶催化下的連接機制催化下的連接機制連連接接酶酶連連接接切切口口Mg2+連接酶連接酶ATP或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口

17、33555533模板鏈模板鏈模板鏈模板鏈 ( (三三) )、DNA的復制過程（原核生物）的復制過程（原核生物） DNA的合成是以四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dCTP、dTTP為前體，在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3OH端添加脫氧核苷酸，在DNA的3OH與添加的脫氧核苷酸的5磷?；g形成3，5磷酸二酯鍵，反應中脫去一個焦磷酸基團。 合成方向：5 3 添加到鏈上的每個核苷三磷酸是按照模板鏈的順序由堿基互補配對原則選擇的。 反應的通式可寫為：（NMP）n3OHdNTP （NMP）n13OHPPi 復制的條件 （1）DNA親鏈（模板）：復制前DNA先解螺旋、解鏈形成兩條單鏈，兩條單鏈都

18、可以作為模板； （2）四種三磷酸脫氧核苷（dNTP）作為底物； （3）一系列酶； （4）一小段寡核苷酸鏈作為“引物”。DNA聚合酶催化的鏈延長反應聚合酶催化的鏈延長反應5 RNA引物引物子鏈3 355335533 5 模板鏈1.1.雙鏈的解開（起始）雙鏈的解開（起始） (1)(1)、復制原點、復制原點 ( (ori ori 或或o)o) DNA分子復制的特定位置，是一段指示復制起始的序列，多富含A、T的區(qū)段。 E.coli E.coli的復制原點由的復制原點由245245個堿基對組成，個堿基對組成，關 鍵 是 成 串 排 列 的關 鍵 是 成 串 排 列 的 3 3 個個 1 31 3 b p

19、b p 序 列序 列（GATCTNTTNTTTTGATCTNTTNTTTT）和間隔排列的和間隔排列的4 4個個9 9bpbp序序列列（TTATCCACATTATCCACA，是是DnaADnaA蛋白結(jié)合位點）蛋白結(jié)合位點）大腸桿菌大腸桿菌復制起點成串排列的重復序列復制起點成串排列的重復序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三個三個13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白結(jié)合位點蛋白結(jié)合位點四個四個9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大腸桿菌大腸桿菌DNA復制起點在起始階段的結(jié)構(gòu)模型復制起點在起始階段的結(jié)構(gòu)模型 E.coli 的

20、的oriC結(jié)構(gòu)模式結(jié)構(gòu)模式a OriC內(nèi)富含A-T序列和4個9堿基對重復序列的分布b在oriC處復制起始模式 原核生物：只有一個復制原點。第二次復制可在第一次復制完成之前開始復制。 真核生物；可在DNA鏈上的多個不同位點同時起始復制。 真核生物真核生物DNA的多起點復制的多起點復制 (2)(2)、復制叉、復制叉（replication forks） 復制叉復制叉：復制中的DNA分子，未復制的部分是親代雙螺旋，而復制好的部分是分開的，由兩個子代雙螺旋組成，復制正在進行的部分叫做復制叉。 DnaADnaA蛋白蛋白是關鍵成分，大約是關鍵成分，大約2020個與復制原個與復制原點的點的4 4個個9 9b

21、pbp序列結(jié)合，使序列結(jié)合，使DNADNA連續(xù)不斷變性，啟連續(xù)不斷變性，啟動解鏈過程動解鏈過程 復制子復制子：基因組能獨立進行復制的單位。每個復制子含有控制復制起始的起點，可能還有中止復制的終點。 果蠅胚胎中復制果蠅胚胎中復制DNA的電子顯微鏡照片的電子顯微鏡照片 從圖中可以看到大量的復制叉，左下角為照片的示意圖從圖中可以看到大量的復制叉，左下角為照片的示意圖 方向方向：復制叉從起始點出發(fā)，沿DNA移動，移動方向與前導鏈的延長方向相同。 復制可能是單向的，也可能是雙向的，兩個方向的復制速度不一定相同。大多數(shù)大多數(shù)是雙向的。是雙向的。 眼狀結(jié)構(gòu)眼狀結(jié)構(gòu)：線狀DNA分子上的正在復制的部分形成； 結(jié)

22、構(gòu)結(jié)構(gòu)：環(huán)狀DNA分子上的正在復制的部分形成。 DNA的雙向和單向復制的雙向和單向復制環(huán)狀環(huán)狀 DNA復制時復制時所形成的所形成的Q結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)起始點起始點復制叉的推進復制叉的推進復制叉復制叉起始點起始點起始點起始點起始點起始點復制叉復制叉復制叉復制叉未復制未復制DNA單向復制單向復制雙向復制雙向復制兩種復制模式兩種復制模式（a）單向復制模式單向復制模式 （b）大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體DNA雙向復制模式雙向復制模式單向復制單向復制i雙向復制雙向復制觀察到的放射觀察到的放射自顯影圖象自顯影圖象18%質(zhì)粒ColE1的單向復制示意圖單向復制單向復制最早研究DNA復制起點和方向的是J.Cairns（1

23、963年）。型型DNA Replication 2. RNARNA引物的合成引物的合成 引發(fā)酶與引發(fā)前體結(jié)合形成引發(fā)體，引發(fā)體在復制叉上移動，識別合成的起始點，引發(fā)RNA引物的合成，該過程需ATP提供能量。 方向：以DNA為模板，5 3 長度：幾個至10個核苷酸，5端含3個磷酸殘基，3端為游離羥基。 為什么需要為什么需要RNARNA引物、而且最后要切除？引物、而且最后要切除？ 1 1、DNADNA聚合酶有校正功能，每引入一個核聚合酶有校正功能，每引入一個核苷酸都要復查一次，無誤后方繼續(xù)下去，它苷酸都要復查一次，無誤后方繼續(xù)下去，它不能從無到有合成新的鏈，因為在未核實前不能從無到有合成新的鏈，因

24、為在未核實前一個核苷酸處于正確配對狀態(tài)時是不會進行一個核苷酸處于正確配對狀態(tài)時是不會進行聚合反應的；聚合反應的； 2、RNA引物是從新開始合成的，錯配的引物是從新開始合成的，錯配的可能性大，在完成引物功能后即將它刪除，可能性大，在完成引物功能后即將它刪除，而代之以高保真的而代之以高保真的DNA鏈。鏈。 primer復制的起始位置3. DNADNA鏈的延長鏈的延長 在一個復制叉內(nèi)兩條鏈的復制方向、合成方式、復制速度是不同的。 前導鏈（領頭鏈） （leading strand)： 以一條鏈（3 5）為模板時，子代鏈的合成方向是5 3，合成是連續(xù)的，合成速度較快。 隨后鏈（后隨鏈） （lagging

25、 strand） ；以另一條親代鏈（5 3）為模板時，子代鏈的合成方向不能按照3 5方向進行，因為迄今沒有發(fā)現(xiàn)這樣的DNA聚合酶，因此只能合成方向為5 3方向的許多DNA小片段（約1000-2000dp，7-10S），為1968年日本人岡崎等人發(fā)現(xiàn)，叫岡崎片段，然后在DNA連接酶催化下，連接起來形成一條子代鏈。 合成是不連續(xù)的，合成速度較慢。當一段新的岡崎片段合成后，pol行使5 3核酸外切酶活性切除引物，再合成一段DNA作為替換，缺口由DAN連接酶封口。 原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程復制叉的復制叉的移動方向移動方向解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解鏈酶解鏈酶RNA引物引物引物體引

26、物體DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前導鏈前導鏈隨后鏈隨后鏈3 5 復制的起始復制的起始DNADNA鏈的延長鏈的延長DNADNA鏈終止鏈終止5 RNA引物引物3 3 大腸桿菌復制體結(jié)構(gòu)示意圖大腸桿菌復制體結(jié)構(gòu)示意圖1 機制：后隨鏈的模板在全酶上繞轉(zhuǎn)180。形成一個小環(huán)，使岡崎片段合成方向與前導鏈合成方向一致，與復制叉移動方向一致，最后形成大環(huán)再釋放，當然，每合成一個岡崎片段都需起始一次，由引物酶合成一個引物。 聚合酶聚合酶III核心酶核心酶大腸桿菌復制大腸桿菌復制體結(jié)構(gòu)示意圖體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶III核心酶核心酶滯后鏈滯后鏈前導鏈前導鏈解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成

27、酶RNA引物引物引發(fā)體引發(fā)體拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶II -夾子夾子 -聚體聚體 -夾子夾子 -復合物復合物RNA引物引物單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白（SSB）復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物引物體引物體引物體引物體解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶參與參與DNA復制叉移動的蛋白質(zhì)復制叉移動的蛋白質(zhì) 前導鏈和滯后鏈的合成前導鏈和滯后鏈的合成 半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制：在DNA復制過程中，一條鏈的合成是連續(xù)的，另一條鏈的合成是不連續(xù)的。 pol全酶同時負責前導鏈和后隨鏈的合成。 4. 終止終止 有有

28、終止子位點終止子位點（22bp），），有一種有一種蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)稱為終止利用基質(zhì)終止利用基質(zhì)與終止位點與終止位點結(jié)合，抑制解螺旋酶的活性，阻止復結(jié)合，抑制解螺旋酶的活性，阻止復制子通過終止位點。制子通過終止位點。 大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體復制的終止復制的終止oric復制叉復制叉2復制叉復制叉1終止復制叉終止復制叉2終止復制叉終止復制叉1復制叉復制叉1復制叉復制叉2完成復制完成復制DNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶連鎖染色體連鎖染色體(1)(1)、前導鏈、前導鏈連續(xù)復制完畢后：（1）pol：切除引物，表現(xiàn)5 3核酸外切酶活性；（2）pol：催化合成一段DNA填補上，表現(xiàn)5 3聚合酶活性； （3）在

29、DNA連接酶作用下，連接上述兩種DNA片段。 (2)(2)、后隨鏈、后隨鏈當新形成的岡崎片段延長至一定長度時：（1）pol：在DNA片段與引物RNA之間切斷，表現(xiàn)5 3核酸外切酶活性；（2）pol：催化合成一段DNA填補上，表現(xiàn)5 3聚合酶活性；（3）連接修復：在DNA連接酶作用下，連接上述兩種DNA片段。 pol：修復錯配堿基。 5. 復制后復制后DNADNA再加工再加工 兩組反應： 1、起修飾作用的甲基化酶催化堿基甲基化，以防止DNA被限制性內(nèi)切酶降解； 2、由多種不同的DNA修復機制組成。 DNA的復制的分子機制的復制的分子機制 包括三個階段： （1）復制的起始）復制的起始 起始點：DN

30、A的復制并非在DNA分子的任何部位都可以起始，而是在特定的起始部位開始的。 原核細胞的環(huán)狀DNA一般只有一個起始點。真核細胞染色體DNA分子比原核細胞DNA分子大得多，其線狀DNA具有多個復制起始點，甚至多達上千個，從而形成許多獨立復制的核苷酸序列，稱為“復制單位”或“復制子”。 復制開始時，先由拓撲異構(gòu)酶和解鏈酶與DNA的復制起始部位結(jié)合，使該部位解螺旋、解鏈，形成復制點，同時單鏈結(jié)合蛋白與該處解開的兩條模板鏈牢固結(jié)合，使其保持可復制狀態(tài)。每個復制點結(jié)構(gòu)猶如叉狀，稱為“復制叉”。 引物酶具有辨別DNA模板鏈起始點的能力，在此處由模板鏈指導，按照A-U、G-C的堿基配對原則聚合三磷酸核苷（NT

31、P），形成RNA引物。 細菌的RNA引物較長，一般含有50-100個核苷酸殘基，哺乳動物的RNA引物較短，一般含有10個左右的核苷酸殘基。 （2）DNA片段的合成與延伸片段的合成與延伸 RNA引物形成之后，在兩條DNA模板鏈的指導下，在DNA聚合酶的催化下，按照A-T、G-C的堿基配對原則在引物的 3-OH端逐個聚合三磷酸脫氧核苷，形成兩段DNA片段。在復制中，拓撲異構(gòu)酶和解鏈酶不斷向前推進，復制叉就不停地向前移行，新合成的DNA片段也就相應的延伸。合成的方向為5 3。 前導鏈：在復制叉的起點處復制時，一條子鏈的延伸方向與復制叉前進方向相同，稱為“前導鏈”。 后隨鏈：另一條子鏈的延伸方向與復制

32、叉的前進方向相反，稱為“后隨鏈”。 復制開始后，隨著復制叉向前移行，前導鏈向復制叉移行方向連續(xù)延伸；而后隨鏈沿著復制叉移性的反方向斷續(xù)合成，開始合成的是一段一段的DNA片段（岡崎片段）。 當一個岡崎片段合成后，隨著復制叉的前移，在新分叉處又合成一段RNA引物，在引物的3-OH端再合成一段岡崎片段，如此進行下去便合成了一條RNA引物-岡崎片段相間排列的序列。 復制到了一定程度，DNA聚合酶的核酸外切酶活性便將RNA引物切除，同時它的DNA聚合酶活性催化岡崎片段由3-OH端延長（每個核苷酸單位被切除后立即被與模板鏈上相應位置堿基互補的脫氧核苷酸補上），直達前一個岡崎片段的5-末端為止。 （3 3）

33、完成子代）完成子代DNADNA分子的形成分子的形成 復制進行到一定程度，核酸外切酶將前導鏈的RNA引物切除，由DNA聚合酶催化其延長補缺；DNA連接酶將相鄰的兩個崗崎片段連接起來，使之成為完整的長鏈。兩條子鏈分別與兩條親鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，生成兩個與親代DNA完全相同的子代DNA。DNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能聚合酶聚合酶錯配鹼基錯配鹼基復制方向復制方向正正 確核確核苷酸苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除錯配切除錯配核苷酸核苷酸 DNA聚合酶的聚合酶的“校對校對”作用作用 在大腸桿菌的DNA復制中，每聚合109-1010個堿基對僅有一個誤差。 原因：DNA聚合酶

34、具有三種不同的酶活性，其核酸外切酶活性是校對新生DNA鏈和改正聚合酶活性所造成“錯配”的一種方法。當“錯配”一個核苷酸時，酶能識別這種“失誤”并立即從新鏈的3-OH端切除所配錯的核苷酸，然后再按5 3方向和正常復制的過程在新DNA鏈的3加上正確的核苷酸。所以當復制叉沿模板鏈移動時，隨加入的每個脫氧核苷酸單位都會受到檢查。 (四四)、真核細胞、真核細胞DNADNA復制復制 不十分清楚，與原核生物DNA復制比較： 1. 一致：一致： 1、基本機制相似。如半保留復制、半不連續(xù)復制。 2、所需酶相似。2. 區(qū)別區(qū)別 真核生物真核生物 原核生物原核生物復制起始點 多個 一個復制方向 雙向 單向復制速度

35、較快 較慢起始點是否連續(xù)復制 不 是催化DNA鏈延長的酶 兩種酶（pol、） 一種酶（pol）引物酶的結(jié)合情況 與DNA聚合酶 與解旋酶 DNA DNA復制具有高度的真實性，以保證遺復制具有高度的真實性，以保證遺傳信息一代一代傳遞，物種不會改變。主傳信息一代一代傳遞，物種不會改變。主要有要有三個因素三個因素：1 1、具有、具有3 53 5核酸外切酶活性的核酸外切酶活性的polpol、polpol切除參入的錯誤堿基；切除參入的錯誤堿基；2 2、復制體的組成。各種酶、蛋白質(zhì)在性質(zhì)、復制體的組成。各種酶、蛋白質(zhì)在性質(zhì)、活性上相互依賴，形成網(wǎng)絡，保證反應過活性上相互依賴，形成網(wǎng)絡，保證反應過程極高精確

36、性；程極高精確性； 3、使用、使用RNA引物而不是引物而不是DNA引物，可消引物，可消除初期容易發(fā)生的錯誤（錯配堿基）。除初期容易發(fā)生的錯誤（錯配堿基）。 （五）、（五）、DNA的損傷修復的損傷修復 突變突變 基因組DNA的堿基順序發(fā)生突然而永久性的改變。 1 1、點突變：、點突變：指一個或幾個堿基對被置換。有兩種形式：轉(zhuǎn)換：一個嘌呤堿基或一個嘧啶堿基轉(zhuǎn)換為另一個嘌呤或嘧啶堿基。如TA被CG替換。顛換：嘌呤堿基變成嘧啶堿基或嘧啶堿基變成嘌呤堿基。如TA被AT替換。 2 2、結(jié)構(gòu)畸變、結(jié)構(gòu)畸變 DNA的大段堿基發(fā)生改變。包括：插入、缺失、倒位、易位。 -T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G

37、- -A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換野生型基因野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換顛換堿基對的置換堿基對的置換(substitution)移碼突變移碼突變(framesshift mutation) -T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入插入 -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失A

38、T 造成造成DNADNA損傷的原因可能是生物因素、物理損傷的原因可能是生物因素、物理因素或是化學因素；可能來自細胞內(nèi)部，也可因素或是化學因素；可能來自細胞內(nèi)部，也可能來自細胞外部；受到破壞的可能是能來自細胞外部；受到破壞的可能是DNADNA的堿基、的堿基、糖基或是磷酸二酯鍵糖基或是磷酸二酯鍵。物理誘變劑：如紫外線、X射線等。生物誘變劑：如噬菌體、抗菌素等。化學誘變劑：直接作用于DNA模板的誘變劑， 如亞硝酸、烷化劑等。 堿基類似物：如5溴尿嘧啶。 移碼誘變劑：如普魯黃。 DNA的損傷修復系統(tǒng)的損傷修復系統(tǒng) 1 1、直接修復、直接修復（direct repair） 對由紫外線引起的胸腺嘧啶二聚體

39、的光復活作用是一種高度專一的直接修復方式，只作用于由紫外線引起的胸腺嘧啶二聚體。 這種結(jié)構(gòu)不能形成堿基配對，使DNA鏈喪失了模板的功能。 用強的可見光照射受損傷的細胞，可見光將光裂合酶激活，此酶與二聚體結(jié)合并將其恢復成兩個單獨的嘧啶堿。胸腺嘧啶的形成示意圖DNA紫外線損傷的光裂合酶修復紫外線損傷的光裂合酶修復1、形成嘧啶二聚體、形成嘧啶二聚體2、光復合酶結(jié)合于、光復合酶結(jié)合于損傷部位損傷部位3、酶被可見光激活、酶被可見光激活4、修復后酶被釋放、修復后酶被釋放 2 2、切除修復、切除修復（excision repair） 是在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為

40、模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復正常結(jié)構(gòu)的過程。 包括兩個過程：一是由細胞內(nèi)特異的酶找到DNA的損傷部位，切除含有損傷結(jié)構(gòu)的核酸鏈；二是修復合成并連接。 DNA的損傷和切除修復的損傷和切除修復堿基丟失堿基丟失堿基缺陷或錯配堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷結(jié)構(gòu)缺陷切開切開 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶核酸外切酶切除切除DNA聚合酶聚合酶DNA連接連接酶酶AP核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶核酸外切酶切開切開切除切除修復修復連接連接糖苷酶糖苷酶插入酶插入酶堿基取堿基取代代 細胞含有的DNA糖基化酶能使不正確的堿基或發(fā)生改變的堿基的糖苷鍵斷裂，切除堿基，產(chǎn)生一個只保留有脫氧核糖磷酸部分脫氧核糖磷酸部分

41、的位點。稱為AP位點（無嘌呤或無嘧啶的位點）。 一旦AP位點形成后，即有AP核酸內(nèi)切酶在AP位點附近將DNA鏈切開。 在在AP位點必須切除若干核苷酸后才能進行位點必須切除若干核苷酸后才能進行修復合成，細胞內(nèi)沒有酶能在修復合成，細胞內(nèi)沒有酶能在AP位點直接將堿位點直接將堿基插入，因為基插入，因為DNA合成的前體物質(zhì)是核苷酸而合成的前體物質(zhì)是核苷酸而不是堿基。不是堿基。 3 3、錯配修復、錯配修復（mismatch repair） 復制過程中，DNA多聚酶將不正確的 堿 基 參 入 D N A 鏈 而 形 成 一 些 非WatsonCrick配對形式。當DAN多聚酶和的校正功能不能糾正這種錯誤時，

42、它可以通過錯配修復機制來消除。錯配修復（錯配修復（mismatch repair） 錯配修復實際上是一種特殊的核苷酸切除修錯配修復實際上是一種特殊的核苷酸切除修復，它專門用來修復在復，它專門用來修復在DNA復制中出現(xiàn)的新合成復制中出現(xiàn)的新合成DNA鏈上的錯配的堿基。但如何避免將鏈上的錯配的堿基。但如何避免將DNA鏈上鏈上正確的堿基切除呢？這就需要將正確的堿基切除呢？這就需要將old strand 和和new strand區(qū)分開來。區(qū)分開來。 原核生物利用甲基化區(qū)分原核生物利用甲基化區(qū)分old strand 和和new strand，因此原核細胞中的錯配修復也，因此原核細胞中的錯配修復也稱甲基化

43、指導的錯配修復（稱甲基化指導的錯配修復（methyl-directed mismatch repair）。原核細胞）。原核細胞DNA的甲基化的甲基化位點位于位點位于5GATC序列中腺嘌呤堿基的序列中腺嘌呤堿基的6位位N原子上，催化甲基化的酶為原子上，催化甲基化的酶為Dam甲基化酶甲基化酶（Dam methylase），剛合成的），剛合成的DNA新鏈上新鏈上的的GATC序列還沒有來得及甲基化，而作為序列還沒有來得及甲基化，而作為模板的模板的old strand早已被甲基化了，利用這早已被甲基化了，利用這種差別區(qū)分種差別區(qū)分old strand 和和 new strand。 一旦發(fā)現(xiàn)錯配堿基，即將

44、未甲基化的鏈切除，一旦發(fā)現(xiàn)錯配堿基，即將未甲基化的鏈切除，并以甲基化的鏈為模板進行修復合成。并以甲基化的鏈為模板進行修復合成。 錯配修復是一個非常耗能的過程。錯配修復是一個非常耗能的過程。錯配的堿基距離錯配的堿基距離GATC序列越遠，被切序列越遠，被切除的核苷酸就越多，重新合成新鏈所除的核苷酸就越多，重新合成新鏈所需要消耗的脫氧核苷三磷酸單體就越需要消耗的脫氧核苷三磷酸單體就越多。無論消耗多少多。無論消耗多少dNTPs，目的都是，目的都是為了修復一個錯配的堿基，這說明機為了修復一個錯配的堿基，這說明機體為了維護遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性可以說體為了維護遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性可以說不惜一切代價。不惜一切代價。

45、錯配修復機制是建立在DNA出現(xiàn)的甲基化的基礎上，在復制過程中，含有所需要甲基化的堿基的親代鏈充分甲基化。由于DNA甲基化滯后于DNA的合成，新的子代DNA鏈在合成的大部分時期里，保持著非甲基化。錯配修復系統(tǒng)具有既能識別非甲基化序列又能識別新合成的子代鏈中的錯配堿基對的能力。被識別的非甲基化序列就作為修復的目標鏈。 修復過程包括切除一段含有錯配堿基的非甲基化序列，然后重新合成一段正確的堿基序列來替換被切除的堿基序列。 4 4、重組修復、重組修復 有時在進行DNA修復之前，受損環(huán)的DNA鏈常常還能進行復制。在這種情況下，受損親代鏈的復制受損壞堿基的干擾，跨過這段損壞序列后，此時在新的一個起點繼續(xù)開

46、始復制，此時新合成的子代鏈的堿基序列就有了一個缺口。這種缺口可以通過重組修復機制糾正。 過程：從同源DNA的母鏈上將相應核苷酸序列片段以至子鏈缺口處，然后用再合成的序列來補上母鏈的空缺。 在重組修復過程中，DNA鏈的損傷部位可能被切除，也可能未被切除。 DNA的重組修復的重組修復胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚體二聚體復制復制核酸酶及核酸酶及重組蛋白重組蛋白修復復制修復復制DNA聚合酶聚合酶DNA連接酶連接酶重組重組 5 5、應急反應（、應急反應（SOSSOS）和易錯修復和易錯修復 SOS反應是細胞DNA受到損傷或復制受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的應急效應。 DNA聚合酶具有3 5核酸外切酶活性而表現(xiàn)出校對功能，它在DNA損傷部位進行復制時，由于新合成鏈的核苷酸不能和模板鏈的堿基配對而被切除，再