噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建與初步鑒定

1、噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建與初步鑒定    【摘要】目的：運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建抗人?淀粉樣肽(A)特異性單鏈抗體的抗體庫(kù)并進(jìn)行初步鑒定.方法：從A免疫的BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞中提取總RNA，分離純化mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成其總cDNA.以PCR方法分別擴(kuò)增出抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因片段，再經(jīng)重組PCR將兩基因片段由編碼十五肽(Gly4Ser)3的接頭連在一起，克隆到噬菌粒載體pCANTAB5E中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1，經(jīng)輔助噬菌體M13KO7超感染后回收全部重組噬菌體，構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)，SDS?PAGE鑒定純度.結(jié)果：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，

2、RT?PCR方法擴(kuò)增的抗體VH和VL基因片段大小約350bp和325bp，與預(yù)期VH，VL基因片段理論值相符.經(jīng)重組PCR得到大小約750bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段經(jīng)雙酶切后成功定向克隆到噬菌粒載體，回收后構(gòu)建成庫(kù)容量為1.1×108的噬菌體抗體庫(kù)，經(jīng)SDS?PAGE鑒定，得到Mr約為30000ku，純度較好的ScFv抗體.結(jié)論：成功構(gòu)建了庫(kù)容量大的特異性噬菌體抗體庫(kù)，為抗人A特異性抗體的篩選、生物活性鑒定、臨床實(shí)驗(yàn)診斷方法建立和治療應(yīng)用打下基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】噬菌體展示技術(shù);單鏈抗體;阿爾茨海默病;?淀粉樣肽0引言阿爾茨海默病(alzheimer?sdisease,AD)

3、，又稱早老性癡呆癥，是一種以記憶喪失、行為失常、人格改變、思維能力下降和認(rèn)知功能障礙等為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病.有研究報(bào)道?淀粉樣肽(?amyloidpeptide,A)與AD的發(fā)病直接相關(guān)1-2.目前國(guó)內(nèi)僅有制備A42多克隆抗體的相關(guān)工作，有關(guān)建立良好的血液標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究報(bào)道還較少見.本實(shí)驗(yàn)通過噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)3-4構(gòu)建抗A的單鏈抗體庫(kù)，為檢測(cè)血液或腦脊液中A水平并用于診斷AD5-6和抗人A特異性抗體的篩選、生物活性鑒定以及臨床治療應(yīng)用打下基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料雌性BALB/c純系小鼠20只，67wk齡(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);cDNA第一鏈合成回收試劑盒(美國(guó)Fermen

4、tas公司);鼠ScFv噬菌體抗體展示系統(tǒng)(瑞典Amershampharmacia公司);Trizol試劑(美國(guó)Gibco公司);DNA多聚酶，QIAquickPCR純化試劑盒(荷蘭Qiagen公司);SfiI內(nèi)切酶，NotI內(nèi)切酶(美國(guó)NEB公司);T4DNALigase(美國(guó)Invitrogen公司);A(美國(guó)Americanpeptide公司).1.2方法1.2.1動(dòng)物免疫將0.5mL的A42(150mg/L)與等量的完全福氏佐劑混合乳化，直到油包水的狀態(tài)，取5只小鼠用A42進(jìn)行免疫.第一次基礎(chǔ)免疫：每只小鼠自后足墊注射0.1mL.基礎(chǔ)免疫后2wk再按上述方法用等量的抗原與不完全福氏佐劑

5、乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只小鼠腹腔注射0.1mL，共加強(qiáng)免疫2次.45d后引頸法處死免疫小鼠，取其脾臟.1.2.2總RNA抽提與mRNA的純化用TRIzol試劑抽提小鼠脾細(xì)胞的總RNA，并立即純化mRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度.1.2.3cDNA第一鏈的合成取兩個(gè)滅菌的0.5mL的離心管，在每一管中依次加入mRNA2L，Oligo(dT)18引物1L，去RNase水9L，混勻，置于70水浴5min，立即置于冰中，在冰上再加入5倍稀釋緩沖液4L，核糖核酸酶抑制劑1L，dNTP(10mmol/L)mix2L，混勻，室溫靜置5min后再加入M?MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(2×108U/L)1

6、L，總反應(yīng)體積為20L.42水浴60min，70水浴10min滅活，立即置于冰中5min，完成cDNA第一鏈的合成.1.2.4PCR擴(kuò)增抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)片段取兩個(gè)滅菌的0.5mL的離心管，在輕鏈PCR擴(kuò)增管中分別依次加入cDNA模板20L，輕鏈引物2L，dNTP(10mmol/L)5L，10倍稀釋緩沖液10L，DNA聚合酶1L，ddH2O62L.重鏈PCR管：cDNA模板20L，重鏈引物12L，重鏈引物22L，dNTP(10mmol/L)5L，10倍稀釋緩沖液10L，DNA聚合酶1L，ddH2O60L.95熱啟動(dòng)5min后，進(jìn)行如下循環(huán)：9430s，5345s，7260s，共30個(gè)循環(huán)，

7、最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72延伸10min，然后取5LPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，用紫外分析儀檢測(cè)電泳結(jié)果，鑒定PCR產(chǎn)物片段大小.1.2.5重鏈和輕鏈可變區(qū)片段與Linker的連接擴(kuò)增出的抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)的PCR產(chǎn)物按Qiagen公司的QIAquickPCR純化試劑盒中的說明書進(jìn)行回收純化.用瓊脂糖凝膠電泳，純化后的VH和VL與標(biāo)準(zhǔn)濃度的VHmarker分別按11和12稀釋后上樣電泳進(jìn)行比較定量，根據(jù)條帶的亮度來(lái)估計(jì)基因片段的含量.以相同和接近等摩爾濃度的抗體VH和VL基因混合進(jìn)行重組PCR反應(yīng)，按Pharmacia公司的重組噬菌體抗體庫(kù)系統(tǒng)(RPAS)操作手

8、冊(cè)進(jìn)行與Linker的連接PCR反應(yīng).然后在PCR產(chǎn)物加上酶切位點(diǎn)后，取5LPCR產(chǎn)物用15g/L的瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，用紫外分析儀檢測(cè)電泳結(jié)果，鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物片段的大小.1.2.6連接片段的克隆取一滅菌的0.5mL的離心管，在每一管中依次加入純化的PCR產(chǎn)物17L，SfiI1L，10倍稀釋緩沖液2L，50溫育2h，酶切產(chǎn)物膠回收純化.另取一滅菌的0.5mL的離心管，在每一管中依次加入SfiI酶切后的ScFv片段40L，NotI1L，BAS0.5L，10倍稀釋緩沖液5L，ddH2O4.5L，37溫育3h，酶切產(chǎn)物膠回收純化.1.2.7質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選取4個(gè)滅菌0.5mL

9、的離心管，在每一管中依次加入純化的酶切后ScFv40L，pCANTAB5E質(zhì)粒5L，ATP(10mmol/L)5L，T4DNA連接酶1L，5倍稀釋緩沖液6L，ddH2O3L，24溫育1h，每個(gè)連接產(chǎn)物分別進(jìn)行回收純化.1.2.8感受態(tài)細(xì)菌的制備用劃線法將大腸桿菌TG1接種于基本培養(yǎng)基平皿上，于37倒置培養(yǎng)過夜，再用無(wú)菌牙簽挑取一個(gè)單菌落至5mL的培養(yǎng)液中，37振蕩(250r/min)過夜培養(yǎng).次日取菌液1mL接種至含有100mL培養(yǎng)液的500mL燒瓶中，37振蕩培養(yǎng)至吸光度(A600nm)達(dá)到0.40.5時(shí)(約需23h)，4，2500r/min離心15min，棄上清液，再加10mL預(yù)冷的TSS

10、重懸菌體，完成制備感受態(tài)大腸桿菌，23h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化.1.2.9質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將4種純化連接產(chǎn)物分別按以下方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后收集的噬菌體抗體合并到一起組成噬菌體抗體庫(kù).在無(wú)菌狀態(tài)下分別取1mL新鮮感受態(tài)大腸桿菌TG1至兩個(gè)預(yù)冷的50mL離心管中，置于冰中.其中一個(gè)加入50L純化的連接產(chǎn)物，另一個(gè)加入500pg未經(jīng)酶切的pUC18質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物.冰浴45min.將試管置于42水浴2min使細(xì)胞熱休克，然后立即置于冰中，轉(zhuǎn)化后，用質(zhì)粒pUC18來(lái)檢查其轉(zhuǎn)化效率.取100L轉(zhuǎn)化后至含有900L的LBG(含20mol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)液)的試管中，37振蕩(250r/min)培養(yǎng)1h，分別取

11、100，10，1L的培養(yǎng)物在SOBAG瓊脂板(含100mg/L氨芐青霉素和2g/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基)上鋪盤，同樣方法另取100L未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌TG1在SOBAG平板上鋪盤作為對(duì)照組.37倒置培養(yǎng)過夜，次日計(jì)算菌落數(shù).1.2.10噬菌體抗體庫(kù)的擴(kuò)增取900L轉(zhuǎn)化的大腸桿菌至一無(wú)菌的50mL試管中，加入9.1mL含10g/L葡萄糖培養(yǎng)液，37振蕩(250r/min)培養(yǎng)1h后，再加50L的20g/L氨芐青霉素和4×1010pfu的M13KO7輔助噬菌體，37振蕩(250r/min)培養(yǎng)1h，1000g離心10min，棄去上清，用10mL的不含葡萄糖的培養(yǎng)液重懸，37振蕩(

12、250r/min)培養(yǎng)過夜.1000g離心20min，將含有重組噬菌體的上清液轉(zhuǎn)入一無(wú)菌的50mL離心管中，0.45m過濾后分裝保存于28備用，此濃縮后的噬菌體抗體庫(kù)可用于富集篩選、純化和鑒定.1.2.11ScFv基因噬菌體抗體庫(kù)表達(dá)抗體的初步鑒定純化后的單鏈抗體用SDS?PAGE電泳鑒定其純度，同時(shí)設(shè)分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色.2結(jié)果2.1總RNA的提取及mRNA的純化從A免疫后小鼠脾細(xì)胞中抽提總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得總RNA濃度為5.16g/L，純化后的mRNA的A260nm/A280nm為1.90，濃度為1.28g/L.2.2抗體VL和VH基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示，VH基因片

13、段約為350bp，VL基因片段約為325bp，與預(yù)期VH，VL基因片段理論值大小相符(圖1).M1:VHmarker;M2:DNAmarker;1:VHPCR產(chǎn)物;2:VLPCR產(chǎn)物.圖1VH和VL基因片段的瓊脂糖凝膠電泳分析(略)2.3ScFv基因的連接結(jié)果如圖2所示，可見約750bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小符合預(yù)期結(jié)果，沒有明顯的非特異性條帶，表明加入VH，VL和Linker引物的濃度準(zhǔn)確，并引入了用于在噬菌粒載體pCANTAB5E中進(jìn)行克隆的限制性內(nèi)切酶SfiI和NotI位點(diǎn).M1:ScFvmarker;M2:DNAmarker;S:ScFvPCR產(chǎn)物.圖2ScFv基因片段的瓊脂糖凝膠電泳分

14、析(略)2.4抗體ScFv基因的克隆及噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建酶切后抗體ScFv基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠與標(biāo)準(zhǔn)濃度的ScFvmarker比較，ScFv的濃度約20mg/L.在連接反應(yīng)中，插入的ScFv基因片段與噬菌粒載體pCANTAB5E的量為31效果最理想.ScFv基因片段通過連接反應(yīng)成功定向克隆至pCANTAB5E噬菌粒載體的SfiI和NotI位點(diǎn)中.噬菌體載體成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1，經(jīng)過兩次培養(yǎng)，收集所有重組噬菌體，成功構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)，合并計(jì)算，噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容量達(dá)1.1×108.2.5抗體ScFv基因的噬菌體抗體庫(kù)表達(dá)抗體的初步鑒定濃縮提取的ScFv，經(jīng)蛋白質(zhì)L?瓊脂糖親和純化

15、得到Mr約為30ku，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，純化后單鏈抗體的表達(dá)量約為1.1mg/L，還原性SDS?PAGE結(jié)果顯示純度較好的ScFv(圖3).1:濃縮上清培養(yǎng)液;M:marker;2:純化ScFv.圖3純化ScFv的SDS?PAGE(略)3討論目前已知A蛋白在人類大腦中的沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)的產(chǎn)生是AD的主要組織病理學(xué)標(biāo)志2，并揭示了細(xì)胞內(nèi)A在大腦內(nèi)沉積的現(xiàn)象以及A具有毒性的作用機(jī)制7-8.由于臨床對(duì)AD診斷較為困難，尤其是發(fā)病早期，采用血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的方法還沒有完全建立起來(lái).因此建立新的臨床試驗(yàn)診斷方法，尤其是檢測(cè)血液中的標(biāo)記物，并且能夠區(qū)分AD和正常衰老以及其它癡呆的試驗(yàn)方法已成為熱

16、點(diǎn).噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的建立是基因工程抗體研究領(lǐng)域的一次重大突破，使傳統(tǒng)的mAb的制備完全改觀，為重組抗體的設(shè)計(jì)、篩選及生產(chǎn)等方面的不斷革新及改進(jìn)提供了高效、可靠的技術(shù)和方法，極大地推動(dòng)了重組抗體在科研、臨床診斷及治療等方面的應(yīng)用10-11.此方法簡(jiǎn)單、快速，而雜交瘤技術(shù)從脾細(xì)胞融合到獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株至少需數(shù)月12.噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)可以繞過運(yùn)用雜交瘤細(xì)胞免疫制備抗體，在大腸桿菌中分泌表達(dá)，通過發(fā)酵大量生產(chǎn)，具有大規(guī)模生產(chǎn)、成本低等特點(diǎn)，克服了雜交瘤細(xì)胞通過mAb腹水或大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)制備抗體的局限性，同時(shí)能夠保存和傳代穩(wěn)定性，避免了雜交瘤細(xì)胞株在傳代過程中明顯的不穩(wěn)定性，我們的研究結(jié)果顯示，直接利用人外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建“天然抗體庫(kù)”，篩選出目的噬菌體抗體，使制備全人抗體，尤其是制備自身抗原和其