探討赤雹果多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

1、探討赤雹果多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響摘要：目的觀察赤雹果多糖對免疫抑制模型小鼠免疫功能的影響。方法采用環(huán)磷酰胺（CY）造模法制作小鼠免疫抑制模型，觀察赤雹果多糖對實(shí)驗(yàn)動物免疫 器官重量指數(shù)、碳粒廓清能力、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）、溶血素（IgM）含量的影響。 結(jié)果赤雹果多糖400, 200 mg- kg-1劑量組能顯著提高小鼠免疫臟器指數(shù)、單核 巨噬細(xì)胞的吞噬功能及小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，促進(jìn)溶血素的生成。結(jié)論赤雹果多 糖有顯著提高免疫抑制小鼠免疫功能的作用。關(guān)鍵詞：赤雹果；多糖；免疫功能；環(huán)磷酰胺赤雹果為葫蘆科，多年蔓生草本植物赤雹 Thladia ntha dubia Bunge的干燥成

2、熟果實(shí)，廣泛分布于華北、東北等地，具有理氣、降逆、祛痰、止血等作用， 民間用赤雹果水煎劑治療腰腿痛、風(fēng)濕痛、痛經(jīng)、軟組織扭傷等，療效顯著。前 期研究顯示赤雹果中富含多糖類成分，其水提物和醇提物具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛及 抗過敏作用，且無明顯的毒副作用2，3。多糖是多種中草藥的有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多方面的 藥理活性，赤雹果多糖的免疫增強(qiáng)功能可能是赤雹果抗炎機(jī)制的組成部分。本文考察了赤雹果多糖對免疫抑制模型小鼠免疫功能的影響，為赤雹果抗炎作用機(jī)制的研究及赤雹果的深入開發(fā)提供理論依據(jù)。1材料與儀器動物昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量 1822 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動 物中心提供，合格證號：

3、903014。試藥與儀器赤雹果，采自河北省青龍滿族自治縣 （20XX-10采集，由承德 醫(yī)學(xué)院中藥研究所趙春穎副研究員鑒定為葫蘆科植物Thladia ntha dubia Bunge的成熟果實(shí)，樣本保存于承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所）。三氯乙酸（天津大茂化學(xué)試劑 廠）;環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：08120521）;印度墨汁（CHROMA GMBH&CO綿羊紅細(xì)胞（承德醫(yī)學(xué)院動物中心提供）;HP-8453紫外可見分光光度 計（美國惠普公司）;AG-245型電子分析天平（瑞士 Mettler公司）。2方法與結(jié)果赤雹果多糖的提取稱取赤雹粗粉適量，置圓底燒瓶中，加入適量石油醚（6090

4、C）回流提取1 h，濾過，濾渣揮干溶媒，以80聽醇回流提取2次，1 h/ 次，濾過;濾渣置圓底燒瓶中，加入蒸餾水浸泡數(shù)小時后回流提取 2次，1 h/次， 濾過，兩濾液合并；合并液濃縮至小體積，加入體積比為 1 ：1的5%三氯乙酸溶 液，靜置2 h后離心、過濾，濾液用95聽醇調(diào)含醇量80%放冰箱內(nèi)(4 C)靜 置過夜，次日抽濾，濾渣以無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌數(shù)次，得白色粉末樣 物質(zhì)，60 C烘干，即得赤雹果多糖。實(shí)驗(yàn)動物分組與給藥取小鼠200只，每個實(shí)驗(yàn)50只，隨機(jī)分為5組，即 正常對照組、模型組、赤雹果多糖高劑量組(400 mg- kg-1 d -1) 中劑量組(200 mg- kg-1

5、d -1)和低劑量組(100 mg kg-1 d -1，每組10只。各實(shí)驗(yàn)組均每天 灌胃給藥1次，正常對照組和模型組用等體積的 生理鹽水灌胃，連續(xù)16 d,于 第15，16天灌胃給藥的同時腹腔注射 瀝磷酰胺，劑量為50 mg- kg-1，正常對 照組腹腔注射等體積的生理鹽水。小鼠免疫器官重量的測定第2次腹腔注射 燦磷酰胺24 h后，稱小鼠體質(zhì) 量，頸椎脫臼處死小鼠，取脾臟、胸腺稱其濕重，計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾指 數(shù)= 脾重量(mg)/體質(zhì)量(g);胸腺指數(shù)二胸腺重量(mg)/體質(zhì)量(g)。結(jié)果見表1表 1赤雹果多糖對CY致免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響單核巨噬細(xì)胞吞噬功能(碳粒廓清速率)的測

6、定第17天再給藥1次，給藥 后1 h，稱體質(zhì)量，各鼠均按-10g-1劑量由尾靜脈注入印度墨汁(以生理鹽水按 1 ：5稀釋)，注射后分別在2 min(、20 min(t2)從小鼠眼眶靜脈叢取血20卩l(xiāng)， 溶于ml的%Na2CO溶液中搖勻，放置20 min后于650 nm處測其吸光度值(A)， 以%Na2CO溶液做空白對照，將小鼠處死后取肝臟和脾臟，用濾紙吸干血跡后稱 重，根據(jù)公式計算廓清指數(shù) K值和校正廓清指數(shù)a值。結(jié)果見表2計算公式： K=(logA1-logA2)/(t2-t1);a =K1/3X體質(zhì)量 /(肝重 + 脾重)小鼠血清溶血素的檢測第2次腹腔注射 哪磷酰胺24 h后，摘眼取血，放

7、 置1 h，離心，分離血清。血清用生理鹽水稀釋 250倍，從中取1 ml加至反應(yīng) 管中，再加入ml的10%SRBC加入補(bǔ)體1 ml(以生理鹽水1 : 10稀釋過的豚鼠 血清作為補(bǔ)體)，移至37 C恒溫水浴鍋中，保溫30 min，取出后置冰浴中以終 止反應(yīng)，用2 000 r - min-1離心10 min，取上清液1 ml，加入3 ml都氏試劑 混勻，10 min后在540 nm處進(jìn)行比色，記錄各樣品的吸收值(OD)。另設(shè)10%ml， 加4 ml都氏試劑，同法測出SRBC半數(shù)溶血吸收值，按照下列公式計算每個樣品 的半數(shù)溶血值(HC50 )。結(jié)果見表2表2赤雹果多糖對CY致免疫抑制小鼠碳粒 廓清及

8、血清溶血素的影響對遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響第15，16天小鼠腹腔注射磷酰胺后， 每鼠腹腔注射2% SRBC ml致敏，致敏后第4天，于小鼠右側(cè)足墊皮下注射 20%SRB懸液50卩l(xiāng),左側(cè)注射50卩l(xiāng)生理鹽水，分別于3, 24 h后用游標(biāo)卡 尺測定小鼠左右足趾厚度之差為腫脹程度。同一部位測量3次，取平均值。結(jié)果見表3表3赤雹果多糖對CY致免疫抑制 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響由表3可知，與模型組相比，赤雹果多糖 400, 200 mg- kg-1 d-l劑量組 能顯著增強(qiáng)SRBC攻擊后3, 24 h小鼠出現(xiàn)的腫脹反應(yīng)，使 CY抑制的反應(yīng)趨于恢 復(fù)正常，說明赤雹果多糖可增強(qiáng) CY所致免

9、疫抑制模型小鼠的體液免疫和細(xì)胞免 疫反應(yīng)能力。3討論大量的藥理和臨床研究表明，多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活 免疫細(xì)胞，提高機(jī)體的免疫功能，而對正常細(xì)胞沒有明顯毒副作用。 臨床所見的 多種疾病多伴有免疫功能低下，本實(shí)驗(yàn)采用了免疫抑制小鼠模型觀察赤雹果多糖 的免疫調(diào)節(jié)作用，更加接近于臨床應(yīng)用。環(huán)磷酰胺(CY)是一種作用較強(qiáng)的免疫抑制劑，常用于制備免疫低下模型。 本實(shí)驗(yàn)中，正常對照組和 CY模型組實(shí)驗(yàn)指標(biāo)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明成功制 造出了免疫抑制小鼠模型。脾臟和胸腺是人體重要的免疫器官，兩者相對重量的變化在免疫評價中占 有重要的地位。赤雹果多糖組的脾臟和胸腺指數(shù)顯著高于模型組，表明其能

10、改善 CY引起的脾臟和胸腺萎縮，對免疫器官有一定的免疫促進(jìn)作用。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一。印度 墨汁通過靜脈注入小鼠血循環(huán)后，迅速被單核巨噬細(xì)胞所清除，主要被定居在肝臟和脾臟的巨噬細(xì)胞所吞噬，若印度墨汁量恒定，則從血流中清除的速率可 反映單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能。赤雹果多糖能夠明顯激活、增強(qiáng)CY所致免疫抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，表明其對 CY所致免疫抑制模型小鼠的非特異 性免疫功能有增強(qiáng)作用。溶血素測定法是影響特異性免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法之一。由于致敏小鼠血清 中的抗體一一溶血素(IgM)，與綿羊紅細(xì)胞一起體外溫育，在補(bǔ)體參與下，可產(chǎn) 生溶血反應(yīng)，而血清中溶血

11、素的含量可通過溶血過程中釋放的血紅蛋白來檢測， 用分光光度計比色測定。赤雹果多糖能明顯增加CY所致免疫抑制模型小鼠血清溶血素含量，拮抗CY所致的體液免疫抑制，說明赤雹果多糖能夠提高其體液免 疫能力。在SRBC誘導(dǎo)的DTH模型中，一般認(rèn)為SRBC攻擊后3 h正常小鼠出現(xiàn)的腫 脹反應(yīng)是由特異性抗體介導(dǎo)的反應(yīng)，攻擊后 24h出現(xiàn)的腫脹反應(yīng)則是T細(xì)胞介 導(dǎo)的反應(yīng)，它們分別反應(yīng)了體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的狀況。赤雹果多糖高、中 劑量組能顯著增強(qiáng)SRBC攻擊后3, 24 h小鼠出現(xiàn)的腫脹反應(yīng)，表明其具有增強(qiáng) 小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。赤雹果中富含多糖類成分，植物赤雹藥源豐富、易于種植，具有巨大的研究

12、價值與應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】宋立人,洪 恂,丁緒亮,等.現(xiàn)代中藥學(xué)大學(xué)辭典,上冊M.北京：人民衛(wèi) 生出版社,20XX:1022.劉建東.赤雹果乙醇提取物的抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中國醫(yī)藥指南,20XX, 7(2) :40.佟繼銘,李蘭芳,宋利萍,等.滿藥赤雹果水溶性提取物鎮(zhèn)痛作用的研究J. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報,20XX,23:338.余薇,汪 暉,吳基良中藥多糖的研究進(jìn)展J.咸寧學(xué)院學(xué)報,20XX,21(6):548.沈關(guān)心,周汝麟.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)M.武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,20XX:6.徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991:1233.李義奎,王欽茂.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)M.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1989 : 159.譚