大鼠視網(wǎng)膜急性光損傷后一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)元的改變

1、    大鼠視網(wǎng)膜急性光損傷后一氧化氮合酶 陽(yáng)性神經(jīng)元的改變        【關(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜；光損傷；一氧化氮合酶；一氧化氮中分類(lèi)號(hào)：R774.1R329.33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1005-1015(2000)03-0209-02一氧化氮(nitric oxide,NO)作為一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了重要的信使作用。此外，在某些情況下，NO具有一定的神經(jīng)毒性作用，可導(dǎo)致神經(jīng)元變性1。視網(wǎng)膜光性損傷也表現(xiàn)為神經(jīng)元變性過(guò)程。我們用NADPH黃遞酶組織化

2、學(xué)染色法研究了大鼠視網(wǎng)膜急性光損傷后一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)元的變化，以探討NO在視網(wǎng)膜急性光損傷發(fā)病機(jī)制中的作用。1材料和方法11動(dòng)物30只成年SD雌性大鼠(由同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重200250 g，其中6只為對(duì)照組，其余24只為實(shí)驗(yàn)組，均飼養(yǎng)在正常晝夜環(huán)境中。12視網(wǎng)膜急性光損傷模型實(shí)驗(yàn)組24只大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)全麻，以托吡酰胺散大瞳孔，用手術(shù)顯微鏡(YZT型，蘇州醫(yī)療器械廠，15 V，150 W)垂直照射大鼠瞳孔，分別照射左右眼100 min，角膜平面照度為14 000 lux(JD-IA型照度計(jì)，上海嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠)。光照后1、3、7、14 d

3、各處死6只大鼠，2只摘取眼球作病理組織切片，另外4只摘除眼球后分離視網(wǎng)膜作NADPH黃遞酶組織化學(xué)染色。13病理切片大鼠斷頭處死后，立即摘除眼球，作常規(guī)病理切片，HE染色，光鏡下觀察。14視網(wǎng)膜NADPH黃遞酶染色大鼠以4%多聚甲醛溶液心臟灌注固定后，立即摘除眼球，置入4%多聚甲醛溶液15 min，剝離視網(wǎng)膜，于4%多聚甲醛溶液后固定1 h，再移入0.1 M 磷酸緩沖液(PB，pH=7.4)中漂洗5 min后，將視網(wǎng)膜移入孵育液中進(jìn)行NADPH黃遞酶染色反應(yīng)。孵育液為1 ml 0.1 MPB中含5 l曲拉通X-100(Triton X-100,Sigma公司)，1 mg NADPH(Boehr

4、inger Mannheim公司)，0.5 mg氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT，上海前進(jìn)試劑廠)。37下孵育3 h，移入0.1 MPB中漂洗5 min，將視網(wǎng)膜平鋪于經(jīng)APES處理過(guò)的載玻片上，室溫干燥，常規(guī)脫水透明，樹(shù)膠封片。光鏡下隨機(jī)測(cè)量每400倍視野內(nèi)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS）陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目，取其平均數(shù)，以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果21病理切片觀察視網(wǎng)膜急性光損傷后，光感受器內(nèi)外節(jié)嚴(yán)重破壞，外核層細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，色素上皮及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞也不同程度受損。且隨時(shí)間延長(zhǎng)，光損傷的程度加重。22NADPH黃遞酶染色觀察NOS陽(yáng)性神經(jīng)元散在分布，胞體呈圓形或卵

5、圓形，并可見(jiàn)較長(zhǎng)的樹(shù)突。光照后1、3、7d組NOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布密度增加，分別為每400倍視野(10687 3±1.196 9)個(gè)，(10.172 3±0.815 8)個(gè)，(9.761 5±0.840 2)個(gè)，與正常對(duì)照組每400倍視野(8.743 7±0.994 9)個(gè)比較差異有顯著性。但14d組每400倍視野(9.2730±0.8985)個(gè)與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性。3討論視網(wǎng)膜光損傷機(jī)制極其復(fù)雜，目前認(rèn)為主要由光化學(xué)損傷所致。NO是一種自由基性質(zhì)的氣體，它參與機(jī)體多種生理和病理過(guò)程之中。內(nèi)源性NO由左旋精氨酸(L-arginine,L-Ar

6、g)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化下產(chǎn)生。用NADPH黃遞酶組織化學(xué)染色可反映NOS在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的分布情況，并間接了解NO的水平2，一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)NOS維護(hù)在低水平的持續(xù)表達(dá)狀態(tài)時(shí)，含NOS的部位NO可維持在低濃度發(fā)揮生理功能。一旦機(jī)體受刺激后NOS表達(dá)增加，可產(chǎn)生大量的NO，而高濃度的NO具有細(xì)胞毒性作用3。視網(wǎng)膜中的NOS陽(yáng)性神經(jīng)元主要為內(nèi)核層的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞層的移位無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞4,5，視網(wǎng)膜內(nèi)的NO參與血液循環(huán)的調(diào)節(jié)6及視覺(jué)信息的傳遞7。但在某些病理狀態(tài)下，視網(wǎng)膜內(nèi)NOS表達(dá)可能增加，產(chǎn)生過(guò)量的NO，對(duì)視網(wǎng)膜組織具有毒性破壞作用。自發(fā)性高血

7、壓大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)一氧化氮合酶表達(dá)增加，提示NO在視網(wǎng)膜缺氧缺血的情況下，可能參與神經(jīng)細(xì)胞損傷的過(guò)程8。用NOS抑制劑可減輕視網(wǎng)膜的缺血性損傷則從反面證實(shí)了NO對(duì)視網(wǎng)膜的毒性作用9。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，NO可能作為一種內(nèi)源性的神經(jīng)毒性因子參與視網(wǎng)膜急性光損傷。大鼠視網(wǎng)膜急性光損傷后1、3、7 d組視網(wǎng)膜中NO陽(yáng)性神經(jīng)元分布密度較正常對(duì)照組顯著增加。因此，在大鼠視網(wǎng)膜急性光損傷早期，NOS表達(dá)增加，從而釋放過(guò)量NOS作用于視網(wǎng)膜組織，造成光感受器細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的變性壞死。在這一過(guò)程中，羥自由基(OH*)可能起重要作用。視網(wǎng)膜在強(qiáng)光持續(xù)照射之下，視網(wǎng)膜中所含的視紫紅質(zhì)吸收光子，可激發(fā)電離，產(chǎn)生大量自由基

8、。這些自由基可能與NO結(jié)合生成更具毒性的羥自由基，加重對(duì)視網(wǎng)膜的損傷，14 d組NOS陽(yáng)性神經(jīng)元無(wú)明顯改變，提示在大鼠視網(wǎng)膜急性光損傷晚期，NO可能不參與視網(wǎng)膜的損傷。但在本實(shí)驗(yàn)中光損傷程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，與NOS陽(yáng)性神經(jīng)元改變并不一致，可能由于視網(wǎng)膜光損傷機(jī)制極其復(fù)雜，NO途徑僅僅是其中一個(gè)環(huán)節(jié)，其確切地位還需進(jìn)一步探索。作者單位：劉曉強(qiáng)（430022 武漢，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院眼科）丁正平（430022 武漢，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院眼科）呂源淑（430022 武漢，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院眼科）4參考文獻(xiàn)1，Dawson VL,Dawson TM,Bartley,DA,et al.

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