DNA含量及S期細(xì)胞比值與肺癌生物學(xué)特性的關(guān)系

1、DNA含量及S期細(xì)胞比值與肺癌生物學(xué)特性的關(guān)系    【關(guān)鍵詞】  肺癌；流式細(xì)胞儀；DNA含量；生物學(xué)特征摘要：目的  研究流式細(xì)胞術(shù)DNA含量及S期細(xì)胞比值(SPF)測定及其與肺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。方法  應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FCM)對56例肺癌新鮮組織及36例非癌性病變的肺新鮮組織的DNA含量(DI)和SPF進(jìn)行測定，并結(jié)合臨床病理資料分析其意義。結(jié)果  肺癌病變組織DNA含量、SPF均顯著高于非癌性病變組織(P<0.01)。肺癌組異倍體率78.6%，而肺非癌性病變組異倍體率5.6%，兩組相比差異有顯著性

2、(P<0.01)；肺癌組織DNA含量與肺癌組織學(xué)類型和臨床分期無明顯關(guān)系(P>0.05)；肺癌異倍體組SPF高于二倍體組(P<0.05)。肺癌SPF與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；隨臨床分期增加，SPF均相應(yīng)增加(P<0.05)。結(jié)論  DNA含量改變、增殖活性的增加在肺癌組織中具有普遍意義。肺癌組織增殖活性越高，腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能越大。肺癌組織的FCM DNA含量及細(xì)胞增殖活性測定有助于進(jìn)一步研究肺癌的生物學(xué)行為。關(guān)鍵詞：肺癌；流式細(xì)胞儀；DNA含量；生物學(xué)特征Relation of FCM DNA content and Sphase fr

3、action to the biological characteristics of lung cancerABSTRACT: Objective  To investigate the relation of DNA content and SPF to the clinicopathological characteristic in lung cancer. Methods  Fresh specimens taken from 56 patients with lung cancer and 36 patients with nonmalignant pulmon

4、ary lesions were measured for DNA index(DI), Sphase fraction (SPF) by using FACSCalibur 4200 flow cytometry. Results  DNA index(DI) of lung cancer was 1.18±0.33, 0.99±0.07 in lung cancer and nonmalignant groups, respectively. The percentage of heteroploid was 78.6% in lung cancer, 5.6

5、% in nonmalignant. DI and the positive rate of heteroploid were significantly higher in lung cancer groups than that in nonmalignant group(P<0.01); Athough DI  increased as the pathological grade and TNM stage advanced, there were no significant difference(P>0.05); It was demonstrated tha

6、t SPF was significant higher in lung cancer groups than that in  nonmalignant group. The SPF of heteroploid tumors was higher than that of diploid tumors(P<0.05); SPF correlated with TNM stage and lymph node and distant metastasis(P<0.05). With the increase of TNM stage, the SPF increased

7、 (P<0.05). Conclusion  The increase of DNA content and proliferation ability improvement were common in lung cancer; With the proliferation ability improvement, the tendency of metastasis increased;Analysis of DNA content and SPF by FCM provid a beneficial method for the evaluation of tumor

8、biological behavior.KEY WORD: lung cancer; flow cytometry; DNA content; biological characteristic惡性腫瘤的染色體變化是腫瘤的基本生物學(xué)特征之一。研究表明，人類大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的染色體都有異常，表現(xiàn)為染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常。異倍體的出現(xiàn)是惡性腫瘤的特征之一12 。在細(xì)胞惡變過程中因染色體的畸變使細(xì)胞DNA含量發(fā)生改變，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中均具有重要意義。本研究對56例肺癌及36例肺非癌性病變的新鮮組織進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FCM)DNA含量、S期細(xì)胞比值(Sphase fraction, SP

9、F)測定，并分析DNA含量、SPF與肺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。1  材料與方法1.1  觀察對象  選擇2002年3月至2002年12月在我院手術(shù)切除和經(jīng)纖支鏡活檢的肺癌標(biāo)本共56例(手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本15例，經(jīng)纖支鏡活檢的肺癌標(biāo)本41例)，其中男性44例，女性12例。年齡30-78歲，平均55歲。病理類型：鱗癌33例、腺癌11例、小細(xì)胞癌12例。術(shù)前均未行任何放、化療。TNM分期：期2例、期20例、期23例、期11例。36例非癌性病變(手術(shù)切除標(biāo)本15例，經(jīng)纖支鏡活檢標(biāo)本21例)，其中男性17例，女性19例。年齡13-69歲，平均46歲。均經(jīng)病理檢查證實(shí)為非癌性病

10、變，其中符合結(jié)核肉芽腫10例，血管瘤2例，炎性假瘤6例，支氣管黏膜慢性炎15例，鱗狀化生2例，黏膜急性炎1例。1.2  主要儀器與試劑  OLMPUS BP40纖支鏡(日本)，OLMPUS CLEIU冷光源(日本)，F(xiàn)ACScalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，分析用 Macintosh計算機(jī)(美國蘋果公司)，Allegra 21R臺式低溫離心機(jī)(美國Coulter公司)。PBS緩沖液(美國Beckmancoulter公司)，組織培養(yǎng)液(美國BD公司)，溶血素(美國BD公司)，DNA試劑盒(美國BD公司)。 1.3  實(shí)驗(yàn)方法1.3.1  樣本制備&

11、#160; 由手術(shù)切除和經(jīng)纖支鏡活檢的新鮮標(biāo)本約0.5g，立即置培養(yǎng)液中4冰箱保存，于1h內(nèi)制成單細(xì)胞懸液(flow cytometry, FCM)備DNA檢測。所有患者同時同部位另取標(biāo)本置10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液中固定送病理檢查。1.3.2  流式細(xì)胞術(shù)DNA含量及細(xì)胞周期分析  將手術(shù)或纖支鏡所取標(biāo)本離體后立即置2mL培養(yǎng)液中，將組織用銳利的剪刀切碎至1mm大小，放在180目銅網(wǎng)上輕搓，邊搓邊以PBS液緩慢沖下，收集細(xì)胞懸液，以1000r/min離心沉淀5min，去上清液，加入溶血素2mL作用10min，PBS漂洗2次，離心沉淀(1000r/min，5min)，棄上清

12、液，加入95%(體積分?jǐn)?shù))冰乙醇，配成終濃度為70%的細(xì)胞懸液固定，置4冰箱待檢。測定前用PBS洗滌3次，棄上清液，加入A溶液250L(內(nèi)含30mg/L胰蛋白酶)混勻后靜置10min，再加入B溶液(內(nèi)含100mg/L Rnase A)200L，混勻后靜置10min，最后加入C溶液200L，混勻后避光靜置10min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106，上機(jī)檢測。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本檢測，測定前使用標(biāo)準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器的CV值在3以內(nèi)。1.3.3  分析指標(biāo)  以DNA指數(shù)(DI值)表示DNA含量，依據(jù)DI值判定DNA倍體，0.9DI1.1 為DNA二倍體；DI<0.9或&

13、gt;1.1為異倍體。DNA異倍體的判定：在DNA直方圖上出現(xiàn)明顯的兩個峰且異倍體細(xì)胞群至少應(yīng)含5%-10%的細(xì)胞或核同時DI<0.9或DI>1.1。同時測定SPF。DI=腫瘤細(xì)胞G0/G1峰道數(shù)/正常二倍體細(xì)胞G0/G1峰道數(shù)SPF(%)=S÷(G0/G1+S+G2M)×100% 1.3.4  病理切片的制備  以常規(guī)石蠟切片程序制片，HE染色,由病理診斷醫(yī)師按照WHO肺癌國際組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn),對肺癌的細(xì)胞類型、分化進(jìn)行分類。1.4  統(tǒng)計學(xué)處理  應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，

14、兩樣本率間比較采用2檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用spearmans法。應(yīng)用單因素方差分析(OneWay ANOVA)比較肺癌各細(xì)胞類型、臨床分期、病理分級間DI、SPF的差異，兩兩比較采用LSD法。百事通 2  結(jié)果2.1  不同類型組織DNA含量和增殖性  56例肺癌病變組織DI為0.61-2.23，平均為1.18±0.32；SPF為3.17-30.44，平均為10.44±6.23；DNA異倍體陽性率為78.6%(44/56)；CV值2.98-8.01,平均6.13±1.42。36例非癌性病變組DI 0.90-1.18，平均為0.99

15、7;0.07；SPF 0.3-6.24，平均為2.33±1.31；DNA異倍體陽性率為5.6%(2/36)，CV 3.48-7.80，平均6.37±1.73。 肺癌組與非癌性病變組相比，DI 、SPF、DNA異倍體陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。56例肺癌中，二倍體肺癌組SPF平均為6.34±2.39,異倍體肺癌組SPF平均為11.56±6.50，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。2.2  肺癌組織DNA含量、增殖性與肺癌組織學(xué)類型、組織分化程度以及臨床TNM分期的關(guān)系  56例肺癌中小細(xì)胞肺癌者12例,D

16、I、SPF平均為1.28±0.39、13.96±9.71；非小細(xì)胞肺癌44例，DI、SPF平均為1.16±0.30、9.48±4.60，兩組相比差異無顯著性(P>0.05)。44例非小細(xì)胞肺癌中有8例由于取材原因組織分化程度難以判定，僅對其中36例進(jìn)行分析：高-中分化共11例(高分化8例、中分化3例)，低分化25例。隨組織分化程度降低DI、SPF有增高的趨勢，但兩組相比差異無顯著性(P>0.05)。56例肺癌DI隨腫瘤TNM分期增加有增加的趨勢，但各組間差異無顯著性；肺癌各臨床分期SPF分別為：- 期7.72±3.16、 期11.8

17、6±7.65、期16.53±7.37。隨臨床分期增加SPF相應(yīng)增加，差異有顯著性(P<0.05)；SPF與肺癌臨床分期、TNMN、TNMM有相關(guān)關(guān)系(r=0.379，r=0.356，r=0.267，P<0.05)。 肺癌組織DNA含量、增殖性與肺癌患者年齡、吸煙史以及腫瘤部位無明顯關(guān)系。3  討論DNA是染色體的主要成分，人體除少數(shù)增生代謝活躍的組織外，正常體細(xì)胞均為恒定的二倍體DNA含量。在細(xì)胞癌變的過程中，由于染色體的畸變，使細(xì)胞DNA含量也隨之改變。在本實(shí)驗(yàn)中，56例肺癌組織的DNA含量遠(yuǎn)較非癌性病變組為高，從而證實(shí)了惡性細(xì)胞的DNA含量高于正常

18、細(xì)胞，DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的重要標(biāo)志1 。在本實(shí)驗(yàn)中，尚有21.4%的腫瘤DNA倍體分析為正常二倍體DNA含量，原因可能與以下因素有關(guān)：二倍體腫瘤，大量研究表明少數(shù)的腫瘤細(xì)胞可以表現(xiàn)為正常二倍體的DNA含量；一些腫瘤可能同時存在染色體的丟失和復(fù)制，DNA的凈含量未發(fā)生變化,異倍體無法檢出來2；腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，造成DNA含量分布不均34 ；相對于二倍體來講，異倍體細(xì)胞極少，在進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測時DNA異倍體峰被二倍體峰掩蓋5。本組資料顯示DI與肺癌部位、吸煙、病理類型、臨床分期等指標(biāo)間未見相關(guān)性，與Tinnemans6、Pina4結(jié)果相似。提示染色體的不穩(wěn)定性、細(xì)胞DNA含量增高持續(xù)存在于

19、肺癌發(fā)生、發(fā)展的各個時期。另有學(xué)者認(rèn)為DI 與肺癌臨床分期、病理分化程度密切相關(guān)7，考慮其差別可能與病例的選擇、樣本大小以及取材等因素有關(guān)。此外，本組資料顯示，反映細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)SPF在癌性組織中明顯高于非癌性組織，且SPF與臨床分期、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNMN)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(TNMM)相關(guān)。隨肺癌臨床TNM分期的增加，SPF均相應(yīng)增加并有統(tǒng)計學(xué)差異。提示良惡性組織間存在明顯的增殖能力的差別，惡性組織的增殖能力明顯高于非癌性病變，肺癌組織的增殖能力與腫瘤分期、浸潤、轉(zhuǎn)移等預(yù)后因素相關(guān)，高增殖狀態(tài)的肺癌具有更大的轉(zhuǎn)移潛能。本組資料顯示異倍體腫瘤SPF較二倍體腫瘤高。提示惡性腫瘤間增殖能力是有差別

20、的，相對于二倍體腫瘤，異倍體腫瘤增殖活性更高、分裂期的細(xì)胞數(shù)目更多、生長更快、進(jìn)展更迅速，這可能是異倍體腫瘤預(yù)后差的原因之一89。總之，應(yīng)用FCM對肺癌組織DNA含量及增殖活性的研究,有助于評價肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，可作為評價肺癌生物學(xué)行為的指標(biāo)之一。參考文獻(xiàn)：1湯釗遒. 現(xiàn)代腫瘤學(xué) M. 第一版. 上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1993:441443.2Huang MS, Tsai MS, Huang TJ, et al. Comparison of nucleolar organiser regions and DNA flow cytometry in the evaluation of pleural effusion J. Thorax,1994, 49(11):11521156.3李玉皓，王新允，張乃鑫，等. 非小細(xì)胞肺癌DNA含量和細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究 J. 中國腫瘤臨床, 2000,27(18):578580.4Pina TC, Zapata IT, Lopez JB, et al. DNA aneuploidy, Sphase fraction and nuclear p53 positivity in nonsm