第十一章(1)多肽與蛋白質(zhì)類藥物

1、第十一章多肽與蛋白質(zhì)類藥物一、多肽和蛋白質(zhì)藥物的基本概念一、多肽和蛋白質(zhì)藥物的基本概念第一節(jié) 概述（一）、多肽類藥物 多肽是多肽是-氨基酸以肽鏈連接在一起而形成氨基酸以肽鏈連接在一起而形成的化合物的化合物, ,它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。N N條多條多肽鏈按一定的空間結(jié)構(gòu)纏繞糾結(jié)就構(gòu)成了蛋白質(zhì)。肽鏈按一定的空間結(jié)構(gòu)纏繞糾結(jié)就構(gòu)成了蛋白質(zhì)。大分子蛋白質(zhì)水解會(huì)生成多肽。大分子蛋白質(zhì)水解會(huì)生成多肽。 1、多肽藥物的功能特性 多肽是生物體內(nèi)重要的生物活性成分，主要有以下生理功能特性：（1）作為生理調(diào)節(jié)的活性分子，參與調(diào)節(jié)各種生理活動(dòng)和特性。 （2）多肽在生物體內(nèi)的濃度很低多肽

2、在生物體內(nèi)的濃度很低（1 11010-7-7 mol/L mol/L就可發(fā)揮活就可發(fā)揮活性，有的甚至更低），性，有的甚至更低），但生理活性很強(qiáng)，具有多種多樣的生化但生理活性很強(qiáng)，具有多種多樣的生化功能。如膽囊收縮素在千萬分之一就可發(fā)揮作用。功能。如膽囊收縮素在千萬分之一就可發(fā)揮作用。 （3）分子小，結(jié)構(gòu)易于改造，可通過化學(xué)合成的方法生產(chǎn)。如由中國首先合成的牛胰島素，就屬于一種含51個(gè)氨基酸的多肽。 （4）活性多肽的合成過程往往是由蛋白質(zhì)精加工剪切轉(zhuǎn)化而來的，許多多肽之間都具有共同的來源、相似的結(jié)構(gòu)。2.多肽類藥物的分類 主要有多肽激素、多肽類細(xì)胞生長多肽激素、多肽類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子、含有多肽成

3、分的組織制劑調(diào)節(jié)因子、含有多肽成分的組織制劑：1、多肽激素（1）腦垂體多肽激素；促皮質(zhì)素（ACTH），促黑激素,催產(chǎn)素，加壓素（2）下丘腦激素；促甲狀腺激素釋放激素，生長素抑制激素，促性腺激素釋放激素（3）甲狀腺激素；甲狀旁腺激素，降鈣素（4）胰島激素；胰高血糖素，胰解痙多肽（5）胃腸道激素；胃泌素，膽囊收縮素，腸泌素，腸血管活性肽，抑胃肽，緩激肽，P物質(zhì)（6）胸腺激素；胸腺素，胸腺肽，胸腺血清因子2 2、多肽類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子、多肽類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子 包括表皮生長因子包括表皮生長因子(EGF)(EGF)，轉(zhuǎn)移因子，轉(zhuǎn)移因子(TF)(TF)，心鈉，心鈉素素(ANP)(ANP)等。等。3 3、含

4、有多肽成分的組織制劑、含有多肽成分的組織制劑 這是一類臨床療效確切，但其中所含的具體有這是一類臨床療效確切，但其中所含的具體有效成分還不十分明了的制劑，主要包括骨寧、眼生效成分還不十分明了的制劑，主要包括骨寧、眼生素、血活素、氨肽素、婦血寧、蜂毒、蛇毒、安胎素、血活素、氨肽素、婦血寧、蜂毒、蛇毒、安胎素、神經(jīng)營養(yǎng)素、胎盤提取物、花粉提取物、脾水素、神經(jīng)營養(yǎng)素、胎盤提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素等。解物、肝水解物、心臟激素等。（二）蛋白質(zhì)藥物（二）蛋白質(zhì)藥物 蛋白質(zhì)藥物可分為蛋白質(zhì)類激素、血漿蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子、膠原蛋白等。主要蛋白質(zhì)類藥物有以下幾種：主要蛋白質(zhì)類

5、藥物有以下幾種：1.1.蛋白質(zhì)激素蛋白質(zhì)激素（1 1）垂體蛋白激素）垂體蛋白激素-生長素，催乳素，促甲狀腺素，促黃體生成激素，促卵泡激素（2 2）促性腺激素）促性腺激素-人絨毛膜促性腺激素(HCG )，絕經(jīng)尿促性腺激素，血清促性腺激素（3 3）胰島素及其它激素）胰島素及其它激素生長素釋放抑制因子，是一種人生長素釋放抑制因子，是一種人腦激素，治療肢端肥大癥，腦激素，治療肢端肥大癥，5050萬個(gè)羊腦提取萬個(gè)羊腦提取5mg.5mg.工程菌工程菌：7.5L7.5L培養(yǎng)液可得到培養(yǎng)液可得到5mg.5mg.肢端肥大癥肢端肥大癥4.4.粘蛋白粘蛋白: : 胃膜素，硫酸糖肽，血型物質(zhì)胃膜素，硫酸糖肽，血型物質(zhì)

6、A A和和B B等。等。5.5.膠原蛋白膠原蛋白: : 明膠，阿膠明膠，阿膠6.6.堿性蛋白堿性蛋白: : 硫酸魚精蛋白硫酸魚精蛋白7.7.蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑: :胰蛋白酶抑制劑，大豆胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑，大豆胰蛋白酶抑制劑8.8.植物凝集素植物凝集素: :PHAPHA， ConAConA白細(xì)胞介素（白細(xì)胞介素（116116）（）（ILIL）神經(jīng)生）神經(jīng)生長因子長因子2.2.血漿蛋白質(zhì)血漿蛋白質(zhì)白蛋白，纖維蛋白溶酶原，血纖蛋白等白蛋白，纖維蛋白溶酶原，血纖蛋白等 硫酸魚精蛋白硫酸魚精蛋白是一種強(qiáng)堿，能與強(qiáng)酸性肝素鈉或肝素鈣形成穩(wěn)定的鹽而使肝素失去抗凝作用?？垢嗡厮??？垢嗡厮?。用于

7、因注射肝素過量所引起的初出血. FDGF, IL, CSF, IFN, EPO, hGHFDGF, IL, CSF, IFN, EPO, hGH的中文名稱的中文名稱IFN：干擾素IL：白細(xì)胞介素 hGH：生長激素FDGF：成纖維細(xì)胞衍化生長因子 CSF：克隆刺激因子 EPO：紅細(xì)胞生成素二、多肽和蛋白質(zhì)類藥物特點(diǎn)二、多肽和蛋白質(zhì)類藥物特點(diǎn) 1) 1) 基本原料簡單易得基本原料簡單易得 多肽和蛋白質(zhì)類藥物主要以20種天然氨基酸為基本結(jié)構(gòu)單元依序連接而得,代謝物氨基酸為人體生長的基本營養(yǎng)成分,可通過農(nóng)產(chǎn)品發(fā)酵而制備。2)2)藥效高，副作用低藥效高，副作用低, , 不蓄積中毒不蓄積中毒 多肽和蛋白質(zhì)

8、類藥物本身是人體內(nèi)源性物質(zhì)或針對生物體內(nèi)調(diào)控因子研發(fā)而得，通過參與,介入,促進(jìn)或抑制人體內(nèi)或細(xì)菌病毒中生理生化過程而發(fā)揮作用,副作用低,藥效高,針對性強(qiáng)，不會(huì)蓄積于體內(nèi)而引起中毒。 3)3)用途廣泛，品種繁多，新型藥物層出不窮用途廣泛，品種繁多，新型藥物層出不窮多肽和蛋白質(zhì)類藥物是目前醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域中最活躍, 進(jìn)展最快的部分，是二十一世紀(jì)最有前途的產(chǎn)業(yè)之一。將20種基本氨基酸按不同序列相互連接, 可得到品種繁多,可用于治療各種類型疾病的多肽和蛋白質(zhì)類藥物。眾多新型多肽和蛋白質(zhì)類藥物在治療艾滋病，癌癥，肝炎，糖尿病，慢性疼痛效果顯著。 4) 4) 研發(fā)過程目標(biāo)明確研發(fā)過程目標(biāo)明確, ,針對性強(qiáng)針對

9、性強(qiáng)借助生命科學(xué)領(lǐng)域取得的大量研究成果, 包括對各類疾病發(fā)病機(jī)理的揭示, 對體內(nèi)各種酶, 輔酶, 生長代謝調(diào)節(jié)因子的深入認(rèn)識, 可以針對性開展多肽和蛋白質(zhì)類藥物的研發(fā)。 多肽和蛋白質(zhì)類藥物研發(fā)技術(shù)與方向多肽和蛋白質(zhì)類藥物研發(fā)技術(shù)與方向1) 1) 化學(xué)合成方法化學(xué)合成方法2) 2) 改造生物活性多肽及現(xiàn)有多肽藥物改造生物活性多肽及現(xiàn)有多肽藥物3) 3) 提高活性多肽及現(xiàn)有多肽藥物檔次提高活性多肽及現(xiàn)有多肽藥物檔次4) 4) 針對具生物活性的多肽天然產(chǎn)物研發(fā)針對具生物活性的多肽天然產(chǎn)物研發(fā)5) 5) 生物技術(shù)制備多肽和蛋白質(zhì)藥物生物技術(shù)制備多肽和蛋白質(zhì)藥物三、多肽及蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)方法三、多肽及

10、蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)方法（1 1）化學(xué)合成法）化學(xué)合成法： 化學(xué)合成法只能生產(chǎn)少部分多肽類藥物?；瘜W(xué)合成法借助化學(xué)催化劑，按一定的氨基酸序列秩序形成肽鍵。蛋白質(zhì)藥物一般具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，而形成這些空間結(jié)構(gòu)還需要一些特殊的細(xì)胞因子參與起輔助作用，這些細(xì)胞因子是化學(xué)合成過程中無法提供的，所以化學(xué)合成不能用于生產(chǎn)相對復(fù)雜的蛋白質(zhì)類藥物。 19531953年，人類用化學(xué)合成法合成了年，人類用化學(xué)合成法合成了有生物活性有生物活性的多肽的多肽-催產(chǎn)素。催產(chǎn)素。（1 1）化學(xué)合成法：）化學(xué)合成法：（2 2）天然動(dòng)植物及重組動(dòng)植物提取法）天然動(dòng)植物及重組動(dòng)植物提取法（3 3）微生物及重組微生物發(fā)酵法）微生物及

11、重組微生物發(fā)酵法（2 2）天然動(dòng)植物及重組動(dòng)植物提取法）天然動(dòng)植物及重組動(dòng)植物提取法 通過生化工程技術(shù)，從天然動(dòng)植物中分離純化。由于天然動(dòng)植物中的有效成分含量過低，雜質(zhì)太多含量過低，雜質(zhì)太多，引起人們對重組動(dòng)植物的重視。 重組動(dòng)植物只通過基因工程技術(shù)手段，將藥物基因或能對藥物基因起調(diào)節(jié)作用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入動(dòng)植物細(xì)胞，以提高動(dòng)植物合成藥用成分的能力，再經(jīng)過生化分離，制得生物制品。 t-PA(tissue-plasminogen activatort-PA(tissue-plasminogen activator) )譯成中文為譯成中文為組織纖溶組織纖溶酶酶原激活劑，人體內(nèi)自然存在，同時(shí)也是臨床上用于

12、急性心肌原激活劑，人體內(nèi)自然存在，同時(shí)也是臨床上用于急性心肌梗死的一種生物蛋白藥物，梗死的一種生物蛋白藥物，有有1818個(gè)半胱氨酸，個(gè)半胱氨酸，9 9對二硫鍵對二硫鍵 t-PA組織型纖溶酶原激活劑組織型纖溶酶原激活劑的轉(zhuǎn)基因羊的轉(zhuǎn)基因羊（3 3）微生物及重組微生物發(fā)酵法）微生物及重組微生物發(fā)酵法 通過基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)藥品，生產(chǎn)中期短、成本低、產(chǎn)品質(zhì)量高。 通過基因工程技術(shù)手段，把人體細(xì)胞內(nèi)含有的合成某一多肽或蛋白質(zhì)的基因分離出來，在結(jié)合一定的載體，轉(zhuǎn)入特定的微生物細(xì)胞，通過微生物細(xì)胞將該多肽或及蛋白質(zhì)的基因表達(dá)出來，以生產(chǎn)該類藥品用于臨床。 目前，世界上生產(chǎn)的多肽和蛋白質(zhì)藥品，絕

13、大多數(shù)均經(jīng)過此方法生產(chǎn)。第二節(jié)第二節(jié) 動(dòng)植物動(dòng)植物提取法提取法生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類藥物一、概述一、概述（一）材料的選擇（一）材料的選擇 蛋白質(zhì)類藥物的來源有動(dòng)植物組織和微生物等，原則是要選擇富含所需蛋白質(zhì)多肽成分的，易于提取的無害生物材料。 對天然蛋白質(zhì)類藥物，為了提高質(zhì)量、產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，對原料的種屬，發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、種屬，發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、解剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主菌或細(xì)胞解剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主菌或細(xì)胞都有一定要求，使得純化工作相對容易。 ： 牛胰含胰島素單位比豬胰島素多，牛為4000IU/Kg胰臟，豬為3000IU/Kg胰臟.抗原性豬比牛

14、低。豬與人胰島素相比，只有1個(gè)氨基酸差異，而牛有3個(gè)氨基酸差異。： 幼年動(dòng)物的胸腺比較發(fā)達(dá)，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采用幼齡動(dòng)物。 肝細(xì)胞生產(chǎn)因子是從肝細(xì)胞分化最旺盛階段的胎兒、胎豬或胎牛肝中獲得的。若用成年的動(dòng)物，必須經(jīng)過肝臟部分切除手術(shù)后，才能獲得富含肝細(xì)胞生長因子的原料。豬胰臟牛胰臟： 動(dòng)物飽食后宰殺，胰臟中胰島素含量增加，對提取胰島素有利，但膽囊收縮素的分泌是膽汁排空，對膽汁收集不利。 血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺豬胰臟和豬顎下腺中提取，而穩(wěn)定性以豬顎下腺來源為好，因其不含蛋白質(zhì)水解酶。 （6 6）對生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求：）對生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求： 大

15、腸桿菌的產(chǎn)品提取大多要求破壁，有些可能會(huì)產(chǎn)生毒素。 枯草桿菌和酵母菌雖然可克服上述毛病，但表達(dá)的蛋白質(zhì)成分有缺乏糖基化等翻譯及修飾的缺陷。 動(dòng)物細(xì)胞較好，如果用腫瘤細(xì)胞要考慮其安全性。豬胰臟中，胰臟尾部含激素較多，而胰臟頭部分含消化酶較多。如果分別摘取則可提高各產(chǎn)品收得率。 胃膜素以采取全胃粘膜為好，胃蛋白酶則以采取胃底部粘膜為好，因胃底部粘膜富含消化腺。 豬胃( (二二) )蛋白質(zhì)類制品的分離純化方法蛋白質(zhì)類制品的分離純化方法(1)(1)根據(jù)分子大小輕重設(shè)計(jì)的方法根據(jù)分子大小輕重設(shè)計(jì)的方法。如離心分離法、篩膜分離。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。法、凝膠過濾法等。(2)(2)根據(jù)溶解

16、度大小分離的方法、根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。(3)(3)按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法，如離子交換分離，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。法、電泳分離法、聚焦層析法等。(4)(4)按穩(wěn)定性差異建立的分離方法按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法表面，如選擇性熱變性法表面變性法等。變性法等。(5)(5)按親和作用的差異按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法等建立的分離方法，如親和層析法等. .二、主要多肽類藥物

17、的制備二、主要多肽類藥物的制備1 1、胸腺素（、胸腺素（thymocinthymocin） 胸腺位于胸骨后面，緊靠心臟，呈灰赤色，扁平橢圓形，分左、右兩葉，由淋巴組織構(gòu)成。青春期前發(fā)充良好，青春期后逐漸退化，為脂肪組織所代替。 胸腺是造血器官，分泌胸腺素，能產(chǎn)生淋巴細(xì)胞，并運(yùn)送到淋巴結(jié)和脾臟等處。這種淋巴細(xì)胞對機(jī)體的細(xì)胞免疫具有重要作用。 生長激素和甲狀腺素能刺激胸腺生長激素和甲狀腺素能刺激胸腺生長，而性激素則促使胸腺退化。生長，而性激素則促使胸腺退化。 人體和動(dòng)物都有免疫系統(tǒng)，包括特異性免疫和非特異性免疫，其中特異性免疫又分為體液免疫系統(tǒng)和細(xì)胞免疫系統(tǒng)。當(dāng)某些外源生物（如細(xì)菌）或生物大分子（

18、如蛋白質(zhì)），也叫抗原，進(jìn)入動(dòng)物體后，會(huì)刺激動(dòng)物體本能地產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，引起免疫應(yīng)答，從而將進(jìn)入的外源生物或蛋白質(zhì)分解或清除。 細(xì)胞免疫細(xì)胞免疫主要指機(jī)體受到異己物質(zhì)抗原的刺激后，主要指機(jī)體受到異己物質(zhì)抗原的刺激后，一類小淋巴細(xì)一類小淋巴細(xì)胞胞依賴胸腺的依賴胸腺的T T細(xì)胞細(xì)胞發(fā)生增生、分化，直接攻擊靶細(xì)胞或發(fā)生增生、分化，直接攻擊靶細(xì)胞或間接地釋放一些淋巴因子從而使機(jī)體達(dá)到免疫的過程。間接地釋放一些淋巴因子從而使機(jī)體達(dá)到免疫的過程。體液免疫體液免疫則是當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，則是當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，來源與來源與骨髓的小淋巴細(xì)骨髓的小淋巴細(xì)胞胞B B細(xì)胞細(xì)胞（即（即B B型淋巴細(xì)胞）型淋巴細(xì)胞）

19、進(jìn)行增生并分化為漿細(xì)胞，進(jìn)進(jìn)行增生并分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而合成各類免疫球蛋白（即抗體），然后在體液中發(fā)揮免疫作而合成各類免疫球蛋白（即抗體），然后在體液中發(fā)揮免疫作用的過程。用的過程。 T淋巴細(xì)胞來源于骨髓的多能干細(xì)胞（胚胎期則來源于卵黃囊和肝）。在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細(xì)胞或前T細(xì)胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。 T淋巴細(xì)胞與激活的血小板 T淋巴細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞Neutrophil嗜中性粒細(xì)胞Neutrophil嗜中性粒細(xì)胞Neutrophil嗜中性粒細(xì)胞Neutrophil嗜中性粒細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞NeutrophilNeutrophil嗜

20、酸性粒細(xì)胞Eosinophil嗜酸性粒細(xì)胞Eosinophil嗜酸性粒細(xì)胞Eosinophil嗜酸性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞EosinophilEosinophil嗜堿性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞EosinophilEosinophil嗜堿性粒細(xì)胞Eosinophil嗜堿性粒細(xì)胞Eosinophil單核細(xì)胞單核細(xì)胞Monocyte嗜堿性粒細(xì)胞Eosinophil嗜堿性粒細(xì)胞Eosinophil淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞Lymphocyte胸腺素胸腺素（thymosin;thymin）， -是由胸腺分泌的一類促細(xì)胞分裂的含2828個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸殘基的具有生理活性的殘基的具有生理活性的多肽激素多肽激素?？烧T導(dǎo)造血干細(xì)胞

21、發(fā)育為T淋巴細(xì)胞，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能和調(diào)節(jié)免疫平衡等作用。 -臨床上常用的胸腺肽是從小牛胸腺發(fā)現(xiàn)并臨床上常用的胸腺肽是從小牛胸腺發(fā)現(xiàn)并提純的有非特異性免疫效應(yīng)的小分子多肽。提純的有非特異性免疫效應(yīng)的小分子多肽。（1）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 胸腺素組分胸腺素組分5 5是由是由8080熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的40-5040-50種多肽組成的混合種多肽組成的混合物物，分子量在，分子量在100015000100015000之間，等電點(diǎn)在之間，等電點(diǎn)在3.59.53.59.5之間。之間。 胸腺素組分胸腺素組分5 5這一名稱來源于生產(chǎn)這一名稱來源于生產(chǎn)加工過程，加工過程，即以小牛胸腺為原料，即以小牛胸腺為原料，

22、采用一定的工藝提取純化得到的第采用一定的工藝提取純化得到的第5 5組分。組分。區(qū)-pI5.0以下多肽。 區(qū)-pI5.07.0以下多肽區(qū)-pI7.0以上多肽（種類較少） 根據(jù)等電點(diǎn)不同，根據(jù)等電點(diǎn)不同，可以將胸腺素組分可以將胸腺素組分5 5中所含多肽分為中所含多肽分為、 、 三個(gè)區(qū)，三個(gè)區(qū)， 胸腺素組分胸腺素組分5 5中，所含的多肽中并非每一種都有免疫中，所含的多肽中并非每一種都有免疫活性，有活性的稱為活性，有活性的稱為胸腺素胸腺素，如胸腺，如胸腺11、 5 5 、 7 7 ，無活性的稱為多肽，如無活性的稱為多肽，如1 1 等。等。 作用與用途：作為免疫調(diào)節(jié)劑原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷病，如反復(fù)上呼

23、吸道感染等；原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷病，如反復(fù)上呼吸道感染等；自身免疫病，如肝炎，腎病，紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫病，如肝炎，腎病，紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力等；重癥肌無力等；變態(tài)反應(yīng)性疾病，如支氣管哮喘等；變態(tài)反應(yīng)性疾病，如支氣管哮喘等；細(xì)胞免疫功能減退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老。細(xì)胞免疫功能減退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老。腫瘤的輔助治療。腫瘤的輔助治療。（2）生產(chǎn)工藝胸腺絞碎胸腺碎塊生理鹽水離心提取提取液（組分組分1 1）加熱，去雜蛋白80，15min上清夜（組分組分2 2）丙酮沉淀10 丙酮粉（組分3）pH7.0 磷酸鹽緩沖液上清夜（組分4）加硫酸銨0.5飽和度調(diào)

24、pH4鹽析物超濾pH8 TrisHCl超濾液Sephadex G25脫鹽，干燥胸腺素（組分5）硫酸銨硫酸銨0.250.25飽和度飽和度二、主要蛋白質(zhì)類藥物的制備一、人血漿白蛋白制劑的制備一、人血漿白蛋白制劑的制備（preparation of human blood preparation of human blood plasma albuminplasma albumin）（1 1）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）結(jié)構(gòu)和性質(zhì) （structure and characterstructure and character） 人血人血是一種紅色混濁的、具有一定腥味與粘滯性的液是一種紅色混濁的、具有一定腥味與粘滯性

25、的液體。用適當(dāng)?shù)目鼓齽┏テ渲械挠行纬煞郑ㄈ缂t血球）而得到體。用適當(dāng)?shù)目鼓齽┏テ渲械挠行纬煞郑ㄈ缂t血球）而得到淡黃色、半透明的液體叫淡黃色、半透明的液體叫血漿血漿。血漿中除含有大量的水分以外，還含有血漿蛋白血漿蛋白等溶質(zhì)。白蛋白（albumin）又稱清蛋白，白蛋白是血漿蛋白中含量最高（55%）、分子量最小、分子數(shù)最多的一類蛋白質(zhì)。白蛋白對治療因失血、創(chuàng)傷、燒傷等引起的休克，腦水腫和大腦損傷性所致的腦壓增高，防止低蛋白血癥，肝硬化或者由腎病引起的水腫與腹水等嚴(yán)重疾病具有良好療效。白蛋白為單鏈分子，由584個(gè)氨基酸殘基組成，N端為天門冬氨酸，C端為亮氨酸，分子量為6.6104，在離子強(qiáng)度為0.1

26、5時(shí)，pI為4.7，易溶于水，在60%硫酸銨飽和度以上沉淀。對酸較穩(wěn)定，受熱變性。從人體中分離的白蛋白有兩種：一種是從健康人血漿中分離制得的人血清白蛋白，另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤中分離制得的胎盤白蛋白。 二者作用相同，后者價(jià)格低于前者，且用量多于前者，但目前已停產(chǎn)。 血血+混合抗凝劑混合抗凝劑 草酸銨草酸銨草酸鉀草酸鉀離離 心心上清血漿上清血漿總蛋白：總蛋白：6.2-7.9%白蛋白：白蛋白：3.8-4.8%水：水：90-92%現(xiàn)常用肝素、檸檬酸鈉現(xiàn)常用肝素、檸檬酸鈉 血（無抗凝劑）血（無抗凝劑）自然凝固自然凝固分離出血清（無纖維蛋白酶分離出血清（無纖維蛋白酶原、凝血因子等）原、凝血因子等）（2

27、2）白蛋白生產(chǎn)白蛋白生產(chǎn)工藝路線工藝路線 利凡諾利凡諾,NaHCO3pH8.6,離心分離離心分離絡(luò)合物蒸餾水，蒸餾水，NaCl，HClpH1.281.45pH1.281.45 ，40解離，離心解離，離心離心液濃濃 縮縮超超 濾濾濃縮液滅活病毒滅活病毒 65，1h； 60，10h熱處理液除菌除菌過濾白蛋白液干燥冷凍干燥白蛋白去雜蛋白人血漿（人血漿（% %）乳酸依沙吖啶上清液鹽析物 濃縮液 處理液 人血丙種球蛋白哦1mol/LHCl調(diào)PH 7.0 (NH4)2SO4鹽析 超超 濾濾 除鹽除鹽26 沉降除菌過濾解離后解離后pH至至5.5-6.0離心分離出上清液離心分離出上清液凍干品白色疏松物體凍干品

28、白色疏松物體將解離混合物溶液用0.5mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.5-6.0，加NaCl至0.15%0.2%，充分?jǐn)嚢琛?0過夜解離（8-10h）。25白蛋白含量占白蛋白含量占95%以上，水分以上，水分1%，水溶后，水溶后pH為為6.6-7.2，硫酸銨殘量，硫酸銨殘量0.01%，細(xì)菌學(xué)和熱原質(zhì)檢測合格。，細(xì)菌學(xué)和熱原質(zhì)檢測合格。 （3 3）工藝要點(diǎn)）工藝要點(diǎn) 絡(luò)合絡(luò)合對于絡(luò)合所要求的對于絡(luò)合所要求的pHpH值，可以略高些，這樣，白蛋值，可以略高些，這樣，白蛋白絡(luò)合完全，絡(luò)合物形成一個(gè)相當(dāng)硬的塊，傾倒上清白絡(luò)合完全，絡(luò)合物形成一個(gè)相當(dāng)硬的塊，傾倒上清液方便，損失少。但液方便，損失少。但不能太高

29、，以防絡(luò)合血漿中的其不能太高，以防絡(luò)合血漿中的其它蛋白，影響解離與白蛋白制劑的純度它蛋白，影響解離與白蛋白制劑的純度。若若pHpH值偏低，絡(luò)合不完全，絡(luò)合物松軟，甚至成湯值偏低，絡(luò)合不完全，絡(luò)合物松軟，甚至成湯狀，不利于傾去上清液。狀，不利于傾去上清液。血漿攪拌用血漿攪拌用NaHCONaHCO3 3調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH至至8.5-8.78.5-8.7之間，緩慢加入之間，緩慢加入與血漿等體積的與血漿等體積的2.3%2.3%利凡諾溶液，邊加邊攪拌，充分利凡諾溶液，邊加邊攪拌，充分絡(luò)合后。絡(luò)合后。靜置靜置24h24h，分離上清與絡(luò)合物沉淀。，分離上清與絡(luò)合物沉淀。解離解離生產(chǎn)中要嚴(yán)格控制溶液的溫度生產(chǎn)中

30、要嚴(yán)格控制溶液的溫度。2525左右室溫，絡(luò)合物形成一個(gè)硬塊，利于去上清和解離。左右室溫，絡(luò)合物形成一個(gè)硬塊，利于去上清和解離。溫度太低，雖然不影響絡(luò)合，但絡(luò)合物呈稀糊狀，傾倒上清溫度太低，雖然不影響絡(luò)合，但絡(luò)合物呈稀糊狀，傾倒上清液時(shí)常會(huì)丟失部分絡(luò)合物，而且絡(luò)合物內(nèi)殘存較多的利凡諾液時(shí)常會(huì)丟失部分絡(luò)合物，而且絡(luò)合物內(nèi)殘存較多的利凡諾的水溶液。的水溶液。解離溫度要維持在解離溫度要維持在4040左右，是解離反應(yīng)的最適溫度。左右，是解離反應(yīng)的最適溫度。解離液的解離液的pHpH值在值在1.281.451.281.45之間，解離效果良好。之間，解離效果良好。絡(luò)合物中加入解離液并攪拌均勻后，將絡(luò)合物中加入

31、解離液并攪拌均勻后，將解離后混合溶液解離后混合溶液pHpH值控制在值控制在6.06.0左右左右較理想。較理想。p以解離后解離混合溶液以解離后解離混合溶液pHpH值決定加入解離液的體積。值決定加入解離液的體積。p解離后解離混合液的解離后解離混合液的pHpH值高于值高于6.56.5時(shí)，表明加入的解離液時(shí)，表明加入的解離液少了，有部分絡(luò)合物未被解離開；少了，有部分絡(luò)合物未被解離開；p低于低于5.855.85，表明加入的解離液多了，解離過度。這兩種情，表明加入的解離液多了，解離過度。這兩種情況下，解離效果均不佳。況下，解離效果均不佳。在沉淀中加約二分之一血漿體積的滅菌蒸餾水解離所得到的絡(luò)在沉淀中加約二

32、分之一血漿體積的滅菌蒸餾水解離所得到的絡(luò)合物沉淀，將解離混合物溶液用合物沉淀，將解離混合物溶液用0.5mol/L HCl調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH至至5.5-6.0，加加NaCl至至0.15%0.2%，充分?jǐn)嚢?、，充分?jǐn)嚢琛?0過夜解離（過夜解離（8-10h）。）。去雜蛋白去雜蛋白：白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白質(zhì)變性的溫度白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白質(zhì)變性的溫度都會(huì)使白蛋白變性。都會(huì)使白蛋白變性。6565條件下變性條件下變性1h1h，離心分離出上清液。，離心分離出上清液。熱處理熱處理：在：在60600.50.5條件下處理?xiàng)l件下處理10h10h，滅活病毒。，滅活病毒。 檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)方法：凍干品白色疏松物體

33、。白蛋白含量占凍干品白色疏松物體。白蛋白含量占95%95%以上，以上，水分水分1%1%，水溶后，水溶后pHpH為為6.6-7.26.6-7.2，硫酸銨殘量，硫酸銨殘量0.01%0.01%，細(xì)菌學(xué)和，細(xì)菌學(xué)和熱原質(zhì)檢測合格。熱原質(zhì)檢測合格。 白蛋白含量占白蛋白含量占95%95%以上，水分以上，水分1%1%，水溶后，水溶后pHpH為為6.6-7.26.6-7.2，硫酸銨殘，硫酸銨殘量量0.01%0.01%，細(xì)菌學(xué)和熱原質(zhì)檢測合，細(xì)菌學(xué)和熱原質(zhì)檢測合格。格。 二、絨膜促性激素（二、絨膜促性激素（HCGHCG）的制備）的制備（1 1）HCGHCG的性質(zhì)（的性質(zhì)（character of HCGchar

34、acter of HCG） HCG(human chorionic gonadotrophin)即人絨毛膜促性腺激素人絨毛膜促性腺激素，是由由胎盤的滋養(yǎng)層胎盤的滋養(yǎng)層合體細(xì)胞合體細(xì)胞分泌的一種分泌的一種糖蛋白糖蛋白，它是由，它是由和和二聚二聚體的體的糖蛋白糖蛋白組成。易溶于水，組成。易溶于水，pIpI為為3.2-3.33.2-3.3。婦女妊娠。婦女妊娠45-7045-70天，尿天，尿中中HCGHCG含量可達(dá)含量可達(dá)30000-50000IU/24h30000-50000IU/24h。 治療女性不育癥，神經(jīng)性皮炎。男性性功能過低癥和隱睪癥，子宮出血和習(xí)慣性流產(chǎn)。臨床用途：孕婦尿粗制粗制尿：苯甲酸

35、：乙醇尿：苯甲酸：乙醇/1：0.075：5）用用HCl調(diào)調(diào)pH 4-5HCG(粗品）提取提取NaAC pH4.8提取液透析透析水，水，5以下以下透析內(nèi)液吸附（吸附（CM SepharoseCI-6B）羧甲基瓊脂糖凝膠羧甲基瓊脂糖凝膠吸附后交換劑洗滌洗滌，峰峰NaAC,pH4.8,pH5.9洗滌后交換劑洗脫洗脫NaAC,pH8.5洗脫液冷凍干燥冷凍干燥 30HCG精品 溶解溶解蒸餾水，蒸餾水，10以下以下HCGHCG溶液溶液透析透析pH6.8, 5以下以下透析內(nèi)液吸附吸附羥基磷灰石，羥基磷灰石，pH6.8吸附物解吸解吸0.5mmol/L,1.0mmol/L磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（PBS),p

36、H6.8解吸液干燥干燥30HCG純品（2 2） HCGHCG生產(chǎn)工藝路線生產(chǎn)工藝路線攪拌攪拌1h靜置靜置2-3h加加10倍量的倍量的41/15 mol/LpH8.5、0.2mol/L的醋酸鹽緩沖的醋酸鹽緩沖液洗脫，得到的第液洗脫，得到的第3峰即為峰即為HCG。 吸附物在攪拌下加入吸附物在攪拌下加入95%95%乙醇至苯甲酸全部乙醇至苯甲酸全部溶解有絮狀沉淀產(chǎn)生溶解有絮狀沉淀產(chǎn)生醋酸鹽醋酸鹽吸附粗品吸附粗品苯甲酸苯甲酸乙醇飽和液乙醇飽和液孕婦尿，用HCl調(diào)節(jié)PH=4-5，加入苯甲酸-乙醇飽和液（孕婦尿：苯甲酸乙醇飽和液：乙醇 =1：0.075：5），攪拌1小時(shí)，靜置2-3小時(shí)。上清液1+上清液2合

37、并，在5以下，用蒸餾水進(jìn)行透析。取透析內(nèi)液進(jìn)行離子交離子交換層析換層析。先將CM-Sepharose柱用0.01mol/L的醋酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡，將樣品加到層析柱上。HCG粗品中加入10倍量的4、0.067mol/L、PH=4.8的醋酸鹽緩沖液，攪拌提取4小時(shí)，離心，取上清液1。離心后的沉淀物再用10倍量的4、0.067mol/L、PH=4.8的醋酸鹽緩沖液提取，取上清液2。過濾，棄濾液，得沉淀吸附物。攪拌下加入95%乙醇，直到苯甲酸全部溶解為止，即有絮狀沉淀物產(chǎn)生。靜置過夜，離心，沉淀物用95%的乙醇和丙酮洗滌，干燥，得HCG粗品。先用0.01mol/L、PH=4.8的醋酸鹽緩沖液洗出洗脫峰

38、-1再用0.01mol/L、PH=5.9的磷酸鹽緩沖液沖出洗脫峰-2再用0.2mol/L、PH=8.5的醋酸鹽緩沖液沖出洗脫峰-3從洗脫峰-3上得到的就是HCG。-30以下冷凍干燥，得HCG精品HCG精品在10以下的蒸餾水中溶解，溶解液用0.5mol/L、PH=6.8的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析。透析內(nèi)液進(jìn)行羥基磷灰石柱層析。步驟：（1）安裝羥基磷灰石柱層析柱。（2）用0.5mol/L、PH=6.8的磷酸鹽緩沖液平衡。（3）樣品上柱先用0.5mol/L、PH=6.8的磷酸鹽緩沖液洗脫，得峰-1再用1.0mol/L、PH=6.8的磷酸鹽緩沖液洗脫，得峰-2從洗脫峰-2上得到的就是HCG純品。-30以下

39、冷凍干燥，得HCG產(chǎn)品。（3 3）工藝要點(diǎn)）工藝要點(diǎn)p吸附粗品：吸附粗品：HCl調(diào)孕婦尿至調(diào)孕婦尿至pH4-5，加苯甲酸，加苯甲酸乙醇飽和液（孕婦尿：苯甲酸乙醇飽和液：乙醇乙醇飽和液（孕婦尿：苯甲酸乙醇飽和液：乙醇 = 1:0.075:5）攪拌）攪拌1h靜置靜置2-3h，過濾，棄濾液，得吸附，過濾，棄濾液，得吸附物。在攪拌下加入物。在攪拌下加入95%乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮狀沉淀產(chǎn)生，靜置過夜，離心，沉淀用狀沉淀產(chǎn)生，靜置過夜，離心，沉淀用95%乙醇和丙乙醇和丙酮洗滌，干燥得粗制品酮洗滌，干燥得粗制品。 p提取：加提?。杭?0倍量的倍量的41/15 mol/L、pH

40、4.8醋酸鹽緩沖醋酸鹽緩沖液，攪拌液，攪拌4h，離心，取上清液。沉淀再提取，離心，取上清液。沉淀再提取2h。合并兩。合并兩次提取液，棄去沉淀。次提取液，棄去沉淀。p離子交換層析：離子交換層析：CM-SepharoseCM-Sepharose柱（柱（離子交換柱離子交換柱）用）用0.01mol/L0.01mol/L的醋酸鹽緩的醋酸鹽緩沖液平衡后樣品上柱。依次用沖液平衡后樣品上柱。依次用pH4.8pH4.8、0.01mol/L0.01mol/L的醋酸鹽緩沖液和的醋酸鹽緩沖液和pH5.9pH5.9、0.01mol/L0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌出兩個(gè)峰（雜質(zhì)）。再用的磷酸鹽緩沖液洗滌出兩個(gè)峰（

41、雜質(zhì)）。再用pH8.5pH8.5、0.2mol/L0.2mol/L的的醋酸鹽緩沖液洗脫，得到的第醋酸鹽緩沖液洗脫，得到的第3 3峰即為峰即為HCGHCG。p羥基磷灰石柱層析：柱用羥基磷灰石柱層析：柱用pH6.8pH6.8、0.5mmol/L0.5mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡。樣品用磷酸鹽緩沖液平衡。樣品用pH6.8pH6.8、0.5mmol/L0.5mmol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行層析上柱。洗脫先用的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行層析上柱。洗脫先用pH6.8pH6.8、0.5mmol/L0.5mmol/L再用再用pH6.8 1.0mmol/LpH6.8 1.0mmol/L的磷酸鹽緩沖液。得到的磷酸鹽緩沖液。得

42、到I I、IIII活性峰。然后冷凍干燥?；钚苑?。然后冷凍干燥。HCGHCG純品的比活性為純品的比活性為10,000-12,000IU/mg10,000-12,000IU/mg蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。p 羥基磷灰石：羥基磷灰石：又稱羥磷灰石，Ca5(PO4)3(OH)） 其中OH-基能被氟化物、氯化物和碳酸根離子代替，生成氟基磷灰石或氯基磷灰石,而鈣離子可以被多種金屬離子通過發(fā)生離子交換反應(yīng)代替，形成對應(yīng)金屬離子的M磷灰石（M代表取代鈣離子的金屬離子）。在水相溶劑中不溶，可用做蛋白質(zhì)純化的吸附劑。在水相溶劑中不溶，可用做蛋白質(zhì)純化的吸附劑。n寫成（Ca10(PO4)6(OH)2）的形式以突出它是由兩部分

43、組成的：羥基與磷灰石。n羥磷灰石是人體骨骼組織的主要無機(jī)組成成分。植入體內(nèi)后，鈣和磷會(huì)游離出材料表面被身體組織吸收，并生長出新的組織。有研究證明羥磷灰石的晶粒越細(xì)，生物活性越高。牙齒表面的琺瑯質(zhì)的主要成份亦是羥磷灰石。三、動(dòng)物來源生物制品制備的實(shí)例三、動(dòng)物來源生物制品制備的實(shí)例 胰島素廣泛存在于人和動(dòng)物的胰臟中，正常人的胰臟約含胰島素廣泛存在于人和動(dòng)物的胰臟中，正常人的胰臟約含有有200200萬個(gè)胰島，胰島由萬個(gè)胰島，胰島由-、-和和-三種細(xì)胞組成，其中三種細(xì)胞組成，其中-細(xì)胞制造胰島素細(xì)胞制造胰島素，-細(xì)胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，細(xì)胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，-細(xì)胞制造生長激素抑制因子

44、。細(xì)胞制造生長激素抑制因子。1 1、胰島素（、胰島素（insulininsulin）的制備）的制備 胰島素在胰島素在-細(xì)胞中細(xì)胞中開始時(shí)是以活性很弱的開始時(shí)是以活性很弱的前體胰島素原存在的，前體胰島素原存在的，進(jìn)而分解為胰島素進(jìn)入進(jìn)而分解為胰島素進(jìn)入血液循環(huán)。血液循環(huán)。顯微鏡下的胰島 - 細(xì)胞促進(jìn)合成代謝促進(jìn)合成代謝胰島素的性質(zhì)胰島素的性質(zhì)： 胰島素由由二條鏈、51個(gè)氨基酸組成，A A鏈鏈2121個(gè)氨基酸、個(gè)氨基酸、B B鏈鏈3030個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸。胰島素是所有蛋白質(zhì)中研究最清楚的一個(gè)蛋白。 不同種屬動(dòng)物的胰島素分子結(jié)構(gòu)大致相同，主要差別在A鏈二硫橋中間的第8、9和10位上的三個(gè)氨基酸及B鏈

45、C末端人的是蘇氨酸，豬的是丙氨酸,抗原性比其他來源的胰島素要低。 B鏈接肽鏈接肽 A21B30 牛胰島素的分子量為5733，豬為5764，人為5784。 胰島素的等電點(diǎn)為5.30-5.35。 胰島素在胰島素在pH4.5pH4.56.56.5范圍內(nèi)幾乎不溶于水范圍內(nèi)幾乎不溶于水，易，易溶于稀酸或稀堿溶液；在溶于稀酸或稀堿溶液；在80%80%以下乙醇或丙酮中溶以下乙醇或丙酮中溶解；在解；在90%90%以上乙醇或以上乙醇或80%80%以上丙酮中難溶；在乙醚以上丙酮中難溶；在乙醚中不溶。中不溶。在高濃度鋅的溶在高濃度鋅的溶液中，液中，pH6pH68 8時(shí)胰島素溶時(shí)胰島素溶解度急劇下降解度急劇下降 。

46、（2 2）工藝路線）工藝路線豬胰臟提取提取3h86%-88%乙醇，乙醇， 5%草酸，草酸，提取液堿化堿化氨水，氨水，pH8-8.4堿化液酸化酸化硫酸，硫酸，pH3.6-3.8,5 酸化液濃縮濃縮30 以下，減壓以下，減壓濃縮濃縮至至濃縮液去脂去脂速熱速冷速熱速冷去脂溶液鹽析鹽析NaCl,pH2-2.5鹽析物蒸餾水蒸餾水、丙酮、氨水（、丙酮、氨水（pH4.24.3）去去除酸性蛋白除酸性蛋白濾液鋅沉淀鋅沉淀氨水，氨水，Zn（Ac）2，pH6.0沉淀除堿性蛋白除堿性蛋白，結(jié)晶，結(jié)晶Zn（Ac）2，丙酮、氨水，丙酮、氨水，pH8.0，5以下以下，檸檬酸，檸檬酸,用氨水調(diào)用氨水調(diào)pH6.0,補(bǔ)加丙酮，補(bǔ)

47、加丙酮，結(jié)晶結(jié)晶洗滌，干燥洗滌，干燥水、丙酮、乙醚水、丙酮、乙醚胰島素精品胰島素精品豬胰島素生產(chǎn)的工藝路線豬胰島素生產(chǎn)的工藝路線 沉淀沉淀10-15比重為比重為1.04-1.06離心去除酸離心去除酸性質(zhì)白沉淀性質(zhì)白沉淀4放置過夜；收集沉淀。放置過夜；收集沉淀。 ，6.5%2%放置放置3-4d慢速攪拌慢速攪拌3-5h使結(jié)晶析出使結(jié)晶析出結(jié)晶完全結(jié)晶完全3.6%3.6%醋酸鋅溶液醋酸鋅溶液20%20%工藝流程圖示工藝流程圖示取上清液進(jìn)行鋅沉淀上清液用氨水調(diào)節(jié)PH=6.2-6.4加入3.6%的醋酸鋅溶液，加入量為溶液量的20%再用氨水調(diào)節(jié)PH=6.04下，放置過夜收集沉淀，用冷丙酮洗滌洗滌后的沉淀物

48、進(jìn)行干燥，得胰島素粗品。鹽析物除酸性蛋白操作鹽析物加入7倍量的蒸餾水進(jìn)行溶解再加入3倍量的冷丙酮，用氨水調(diào)節(jié)PH=4.2-4.3補(bǔ)加丙酮。使得丙酮：水=3：7攪拌后過夜，離心，除去酸性蛋白質(zhì)沉淀濃縮液迅速升溫，然后迅速降溫，除去脂肪。去脂液用NaCl溶液進(jìn)行鹽析，鹽析外液PH控制在PH=2.0-2.5之間。提取液用PH=8.0-8.4的氨水堿化4小時(shí)，除去沉淀。堿化液用PH=3.6-3.8的硫酸，在5時(shí)酸化4小時(shí)，除去沉淀。酸化液，在30下進(jìn)行減壓濃縮至比重為1.04-1.06。豬胰臟絞成碎末，加入2.3-2.6倍的86%-88%的乙醇+5%的草酸，10-15之間提取3小時(shí)。胰島素粗品除堿性蛋

49、白質(zhì)，每克粗品加入2%的檸檬酸溶液50ml+6.5%的醋酸鋅溶液2ml+丙酮16ml然后再用冰水稀釋至100ml，使樣品充分溶解。冷卻至5以下，用氨水調(diào)節(jié)PH=8.0，過濾，除去堿性蛋白質(zhì)沉淀。濾液進(jìn)行結(jié)晶操作濾液用10%的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)PH=6.0補(bǔ)加丙酮，使得溶液中的丙酮含量達(dá)到16%慢速攪拌3-5小時(shí)，使結(jié)晶析出再在5左右放置34天，使結(jié)晶完全析出收集結(jié)晶，用丙酮、乙醚反復(fù)脫水，真空干燥，得結(jié)晶胰島素純品。（3）工藝要點(diǎn)）工藝要點(diǎn)提?。航g碎胰臟，加提?。航g碎胰臟，加2.3-2.62.3-2.6倍的倍的86%-88%86%-88%乙醇和乙醇和5%5%的草酸，提取的草酸，提取3h3h。濃縮：

50、濃縮：3030減壓濃縮至比重為減壓濃縮至比重為1.04-1.061.04-1.06為止。為止。除酸性蛋白：加入除酸性蛋白：加入7 7倍量的蒸餾水溶解，再加倍量的蒸餾水溶解，再加3 3倍量冷丙酮，用氨水調(diào)倍量冷丙酮，用氨水調(diào)pHpH至至4.2-4.34.2-4.3，補(bǔ)加丙酮，離心去除酸性質(zhì)白沉淀。，補(bǔ)加丙酮，離心去除酸性質(zhì)白沉淀。 鋅沉淀：用氨水調(diào)鋅沉淀：用氨水調(diào)pHpH為為6.2-6.46.2-6.4，加入，加入3.6%3.6%醋酸鋅溶液（醋酸鋅溶液（20%20%濃度），再用氨濃度），再用氨水調(diào)水調(diào)pHpH至至6.06.0，44放置過夜；收集沉淀。放置過夜；收集沉淀。 除堿性蛋白、結(jié)晶：每克加

51、冰冷的除堿性蛋白、結(jié)晶：每克加冰冷的2%2%檸檬酸溶液檸檬酸溶液50mL50mL，6.5%6.5%醋酸鋅溶液醋酸鋅溶液2mL2mL，丙酮，丙酮16mL16mL，用冰水稀釋至，用冰水稀釋至100mL100mL，使充分溶解；冷至，使充分溶解；冷至55以下，用氨水調(diào)至以下，用氨水調(diào)至pHpH至至8.08.0，過濾；濾液用，過濾；濾液用10%10%檸檬酸溶液調(diào)檸檬酸溶液調(diào)pH6.0pH6.0，補(bǔ)加丙酮，慢速攪拌，補(bǔ)加丙酮，慢速攪拌3-5h3-5h使結(jié)晶析出；再轉(zhuǎn)入使結(jié)晶析出；再轉(zhuǎn)入55左右放置左右放置3-4d3-4d，使結(jié)晶完全；收集結(jié)晶，用丙酮、，使結(jié)晶完全；收集結(jié)晶，用丙酮、乙醚脫水后，真空干燥，

52、即得結(jié)晶胰島素。乙醚脫水后，真空干燥，即得結(jié)晶胰島素。3、注解、注解（1 1）離體后）離體后，蛋白水解酶類能分解胰島素，使之失活。因此，蛋白水解酶類能分解胰島素，使之失活。因此，要立即深凍，先在要立即深凍，先在-30-30以下急凍后轉(zhuǎn)入以下急凍后轉(zhuǎn)入-20-20保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆?。如用液氮或干冰速凍，效果更好。在胰臟中，胰尾部分胰如用液氮或干冰速凍，效果更好。在胰臟中，胰尾部分胰島素含量較高，如單獨(dú)使用可提高收率島素含量較高，如單獨(dú)使用可提高收率. .（2 2）胰島素結(jié)構(gòu)修飾）胰島素結(jié)構(gòu)修飾 ，可對胰島素分子進(jìn)行修飾和改造，以，可對胰島素分子進(jìn)行修飾和改造，以改變某些性質(zhì)，如提高降血糖能力、延

53、長體內(nèi)半衰期、抗改變某些性質(zhì)，如提高降血糖能力、延長體內(nèi)半衰期、抗熱變性、抗蛋白水解酶的降解等。熱變性、抗蛋白水解酶的降解等。 （3 3）酶促半合成人胰島素）酶促半合成人胰島素 。經(jīng)胰蛋白酶的轉(zhuǎn)酰胺作用，將豬。經(jīng)胰蛋白酶的轉(zhuǎn)酰胺作用，將豬胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素B30B30。再用離子交換層析純化，可得。再用離子交換層析純化，可得到高純度人胰島素。到高純度人胰島素。 （4 4）重組）重組DNADNA技術(shù)制造人胰島素技術(shù)制造人胰島素，人工合成的人胰島素克隆到，人工合成的人胰島素克隆到大腸桿菌中生產(chǎn)人胰島素。大腸桿菌中生產(chǎn)人胰島素。 蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造的速效胰島素機(jī)理是 （ D ）

54、A. 將豬胰島素B30位改造為丙氨酸，使之和人胰島素序 列一致 B. 將A21位替換成甘氨酸，B 鏈末端增加兩個(gè)精氨酸，使之在pH4溶液中可溶 C. 將B29位賴氨酸用長鏈脂肪酸修飾，改變其皮下擴(kuò)散和吸收速度 D. 將人胰島素B28位與B29位氨基酸互換，使之不易形成六聚體第三節(jié)第三節(jié) 基因工程法生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類藥物基因工程法生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類藥物一、生產(chǎn)用微生物的來源及發(fā)酵特性。1.1.大腸桿菌宿主菌特性大腸桿菌宿主菌特性優(yōu)點(diǎn)：大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉。缺點(diǎn)： 在通常情況下，細(xì)菌的細(xì)菌的RNARNA聚合酶不能識別真核的啟聚合酶不能識別真核的啟動(dòng)子動(dòng)子；許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物需

55、要經(jīng)過翻譯后的加工修飾，如正確的折疊和組裝正確的折疊和組裝，而細(xì)菌中通常并沒有這樣的修飾機(jī)制，從而可能導(dǎo)致真核基因在大腸桿菌中的翻譯產(chǎn)物無法產(chǎn)生有活性的蛋白，以包涵體形式存在包涵體形式存在需要分離純化后將肽鏈散開后重新進(jìn)行折疊；再有，外源真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子往往能夠被細(xì)菌的蛋白酶識別，并被當(dāng)做“異已分子異已分子”降解掉。n大腸桿菌中，常用大腸桿菌中，常用表達(dá)調(diào)控方式表達(dá)調(diào)控方式有有溫度型啟動(dòng)子溫度型啟動(dòng)子和和乳糖乳糖操縱子型啟動(dòng)子操縱子型啟動(dòng)子。n溫度型啟動(dòng)子來源于噬菌體，受cI阻礙蛋白抑制。cI蛋白由CIts857基因（857bp）編碼，該基因的表達(dá)與溫度有關(guān)。n當(dāng)溫度處于低溫（一般3

56、7以下）時(shí)，該基因能活躍的表達(dá)出cI蛋白，抑制住溫度型啟動(dòng)子啟動(dòng)的基因的表達(dá)。一旦溫度升高到42 ，該基因表達(dá)關(guān)閉，不合成cI蛋白，解除溫度型啟動(dòng)子啟動(dòng)的基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)位于其下游的外源基因的表達(dá)。n國內(nèi)重組國內(nèi)重組干擾素工程菌正式利用此原理進(jìn)行表達(dá)控制。干擾素工程菌正式利用此原理進(jìn)行表達(dá)控制。 一般，將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，是一般，將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，是表達(dá)產(chǎn)物不會(huì)影響細(xì)胞的生長，當(dāng)宿主細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到飽和時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物不會(huì)影響細(xì)胞的生長，當(dāng)宿主細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到飽和時(shí)，在進(jìn)行基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)合成，以減低宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷。在進(jìn)行基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)合成，以減低宿

57、主細(xì)胞的代謝負(fù)荷。n乳糖操縱子型啟動(dòng)子必須經(jīng)過乳糖誘導(dǎo)才能啟動(dòng)。n當(dāng)達(dá)到所需工程菌密度后，向培養(yǎng)基中加入乳糖或乳糖類似物，對其進(jìn)行誘導(dǎo)，就可開啟外源基因的表達(dá)。n注意：加入乳糖或乳糖類似物，對其進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)基中不能含有葡萄糖，葡萄糖的存在有抑制作用。n國內(nèi)很多以大腸桿菌為宿主菌的工程菌，均采用此法進(jìn)行外源基因表達(dá)控制。2.酵母宿主菌特性 酵母宿主菌常用巴斯德畢赤酵母，也稱甲醇酵母。其可利用甲醇為唯一碳源進(jìn)行生長代謝，因?yàn)樵摻湍讣?xì)胞內(nèi)存在甲醇氧化酶基因AOX1，該基因?qū)儆谡T導(dǎo)型，其啟動(dòng)子只有在以甲醇為唯一碳源前提下，才能正確表達(dá)甲醇氧化酶基因AOX1并翻譯為醇氧化酶。 將需要表達(dá)的外源基因置于

58、含有將需要表達(dá)的外源基因置于含有AOX1AOX1啟動(dòng)子啟動(dòng)子的載體上，的載體上，作為控制。作為控制。 酵母可在一般培養(yǎng)基酵母可在一般培養(yǎng)基是上生長，當(dāng)?shù)揭欢苁巧仙L，當(dāng)?shù)揭欢芏群螅渌荚春谋M，度后，其他碳源耗盡，加入甲醇，加入甲醇，酵母可表達(dá)酵母可表達(dá)外源基因，合成所需的外源基因，合成所需的蛋白藥物成分蛋白藥物成分巴斯德畢赤酵母 Pichia.pastoris(巴斯德畢赤酵母)酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。包括啟動(dòng)子、外源基因克隆位點(diǎn)、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌

59、復(fù)制擴(kuò)增，然后被導(dǎo)入載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌復(fù)制擴(kuò)增，然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。宿主酵母細(xì)胞。為使產(chǎn)物分泌胞外，表達(dá)載體還需帶有信號肽序列。 染色體重組染色體重組 甲醇酵母細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)藥物，與人體的蛋白質(zhì)相近，有利于藥物使用后的免疫原性問題。這主要是因?yàn)?- 甲醇酵母存在類似于人體細(xì)胞那樣的蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)，例如，能對蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行N-和O-糖基化修飾，能主動(dòng)切除原核細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)所特有而真核生物不具有的甲硫氨酸。（二）干擾素（二）干擾素(interferon, IFN)(interferon, IFN) 干擾素（干擾素（IFNIFN）是由病毒和其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，是由病毒和其他種類

60、的干擾素誘導(dǎo)劑，刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（人體免疫系統(tǒng)的一種）、人體免疫系統(tǒng)的一種）、巨噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白糖蛋白。這種蛋白具這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化作用。分化作用。 干擾素（干擾素（IFNIFN）是一種廣譜抗病毒劑，）是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細(xì)而主要是通過細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從從而抑制而抑制乙肝病毒的復(fù)制；同時(shí)還可增強(qiáng)自然