DNA重組技的基本工具

1、定向基因改造設(shè)想定向基因改造設(shè)想 基因工程：基因工程：又叫做又叫做基因拼接技術(shù)基因拼接技術(shù)或或DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)。通俗的說(shuō)，就是按照人們的意愿，把一種生物通俗的說(shuō)，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來(lái)，加以修飾改造，的某種基因提取出來(lái)，加以修飾改造，定向定向地改造生物的地改造生物的遺傳性狀遺傳性狀。原原 理：理：操作水平：操作水平：結(jié)結(jié) 果：果：目的基因目的基因供體細(xì)胞供體細(xì)胞受體細(xì)胞受體細(xì)胞基因重組基因重組DNADNA分子水平分子水平定向地改造生物的遺傳性狀，定向地改造生物的遺傳性狀，獲得獲得人類所需要的品種。人類所需要的品種。( (細(xì)菌等微細(xì)菌等微生物生物) )請(qǐng)你回

2、答：請(qǐng)你回答：轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)棉普通棉普通棉重組重組DNA導(dǎo)入導(dǎo)入形成形成1 1 DNADNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶人會(huì)被細(xì)菌入侵而得病，細(xì)菌會(huì)被其他的人會(huì)被細(xì)菌入侵而得病，細(xì)菌會(huì)被其他的生物入侵嗎？生物入侵嗎？人靠什么來(lái)防御入侵？那么細(xì)菌呢？人靠什么來(lái)防御入侵？那么細(xì)菌呢？為什么不會(huì)剪切細(xì)菌本身的為什么不會(huì)剪切細(xì)菌本身的DNA？在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，含有哪種限制酶，就不在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，含有哪種限制酶，就不具備相應(yīng)的序列；或者通過(guò)甲基化酶將甲基具備相應(yīng)的序列；或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別的序列中，使限制酶不能將其轉(zhuǎn)

3、移到所識(shí)別的序列中，使限制酶不能將其斷開(kāi)。斷開(kāi)。限制酶的作用是什么？限制酶的作用是什么？AATTGCCTTAAG斷開(kāi)后的末端是怎樣的？斷開(kāi)后的末端是怎樣的？coRI限制酶限制酶SmaI限制酶限制酶識(shí)別序列識(shí)別序列切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)和之間和之間和之間和之間未端類型未端類型平末端平末端粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端平末端平末端特異性特異性以以DNADNA的一條鏈為模板合成的一條鏈為模板合成DNADNA雙鏈雙鏈DNADNAAG T AC A A A T AGCTGACGGTTT游離的游離的脫氧脫氧核糖核苷酸核糖核苷酸AG T AC A A A T AGCTGACGGTTTDNADNA 聚合酶聚合酶A

4、G T AC A A A T AGCGACGGTTTTAG T AC A A A T GCGACGGTTTTAAG T AC A A A T GCGACGTTGTTAAG T AC A A A T GCGACGTGTTATAG T AC A A A T GCGACGGTT AT TAG T AC A A A T GCGACGGTTAT TAAG T AC A A A T GCGCGGTTAT TA TAG T AC A A A T GGCGGTTAT TA T CAG T AC A A A T GGCGGTTAT TA T CDNADNA具有連接單鏈具有連接單鏈DNADNA的本領(lǐng)的本領(lǐng)只可以連

5、接雙鏈只可以連接雙鏈DNADNA1 1、分類：、分類：大腸桿菌：大腸桿菌：E.coliDNA連接酶連接酶DNA作用：作用：作用：作用：將外源基因送入受體細(xì)胞將外源基因送入受體細(xì)胞。 . .：質(zhì)粒質(zhì)粒。天然的天然的質(zhì)粒質(zhì)粒1.如果從如果從霍亂弧菌霍亂弧菌中分離出來(lái)中分離出來(lái)的質(zhì)粒來(lái)做載體，請(qǐng)問(wèn)誰(shuí)敢用的質(zhì)粒來(lái)做載體，請(qǐng)問(wèn)誰(shuí)敢用它來(lái)做受體的載體？它來(lái)做受體的載體？運(yùn)載體運(yùn)載體DNADNA必需是可靠的必需是可靠的2.2.運(yùn)載體運(yùn)載體DNADNA要攜帶目的基因，要攜帶目的基因，如何攜帶？如何攜帶？運(yùn)載體運(yùn)載體DNA必需有一個(gè)或多必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)個(gè)限制酶切點(diǎn)且切點(diǎn)必須在質(zhì)粒本身需要且切點(diǎn)必須在質(zhì)

6、粒本身需要的基因片段之外的基因片段之外。3.3.運(yùn)載體運(yùn)載體DNADNA要攜帶目的基因進(jìn)入后如何表達(dá)？要攜帶目的基因進(jìn)入后如何表達(dá)？自我復(fù)制（整合到受體自我復(fù)制（整合到受體DNA上）上）4.4.如何確認(rèn)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞？并進(jìn)行篩選？如何確認(rèn)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞？并進(jìn)行篩選？帶有標(biāo)記基因帶有標(biāo)記基因條件條件：必需是可靠的必需是可靠的必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)自我復(fù)制（整合到受體自我復(fù)制（整合到受體DNA上）上）帶有標(biāo)記基因帶有標(biāo)記基因運(yùn)載體運(yùn)載體DNA大小適合，便于提取和操作大小適合，便于提取和操作目前被較廣泛提取目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇使用的目的基因有

7、：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、人云金桿菌抗蟲(chóng)基因、人胰島素基因、人干擾素胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等?；虿僮鞯幕静襟E基因操作的基本步驟、提取目的基因、提取目的基因?qū)⑿枰幕驈墓w生物需要的基因從供體生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)。的細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)。供體生物細(xì)胞供體生物細(xì)胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶2 2、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合用與提取目的基用與提取目的基因相同的限制酶切割因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入口，將目的基

8、因插入切口處，讓目的基因切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)后，在連接酶的作用后，在連接酶的作用下連接形成重組下連接形成重組DNADNA分子。分子。3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增導(dǎo)入導(dǎo)入擴(kuò)增擴(kuò)增要讓目的基因表達(dá)，必要讓目的基因表達(dá)，必須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進(jìn)行須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增。為獲得目的基因的表達(dá)為獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，通常以大腸桿菌等產(chǎn)物時(shí)，通常以大腸桿菌等無(wú)害易得的細(xì)菌為受體。為無(wú)害易得的細(xì)菌為受體。為改進(jìn)某種生物時(shí)，將欲改進(jìn)改進(jìn)某種生物時(shí)，將欲改進(jìn)的生物細(xì)胞為受體。的生物

9、細(xì)胞為受體。為使重組的為使重組的DNADNA分子更容易進(jìn)入受體細(xì)胞，分子更容易進(jìn)入受體細(xì)胞，通常還要用一些物質(zhì)對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行處理，使通常還要用一些物質(zhì)對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行處理，使受體細(xì)胞具有更大的通透性。受體細(xì)胞具有更大的通透性。4 4、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來(lái)接受不多的目的基效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來(lái)接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測(cè)出來(lái)。很少，必須將它從中檢測(cè)出來(lái)。無(wú)

10、表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物無(wú)表達(dá)產(chǎn)物細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。質(zhì)粒的特點(diǎn)質(zhì)粒的特點(diǎn)1.1.細(xì)胞染色體（或擬核細(xì)胞染色體（或擬核DNADNA分子）外能自主分子）外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀復(fù)制的小型環(huán)狀DNADNA分子；分子；2.2.質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響；質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響；3.3.質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)

11、胞內(nèi)完成。質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。練習(xí)練習(xí)3.3.在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的目的基因的DNADNA片段，需使用（片段，需使用（ ）同種限制酶同種限制酶 B. B. 兩種限制酶兩種限制酶同種連接酶同種連接酶 D. D. 兩種連接酶兩種連接酶注意：要用同一種限制酶切取目的基因注意：要用同一種限制酶切取目的基因和運(yùn)載體，并用和運(yùn)載體，并用DNA連接酶連接。連接酶連接。練習(xí)練習(xí)4.不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制能復(fù)制 （ ） B、有、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因具有標(biāo)記基因 D、它

12、是環(huán)狀它是環(huán)狀DNAD練習(xí)練習(xí)一、基因工程的概念一、基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望基因工程是指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì),通過(guò)體外通過(guò)體外_和和_等技術(shù)等技術(shù),賦予生物以心得遺賦予生物以心得遺傳特性傳特性,創(chuàng)造出符合人們的需要的新的創(chuàng)造出符合人們的需要的新的_和和_.又叫做又叫做DNA的重組技術(shù)的重組技術(shù) .二、二、DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具 1.限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶-”分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀” (1)主要來(lái)源主要來(lái)源:從從_生物中分離出來(lái)的生物中分離出來(lái)的. (2)特點(diǎn)特點(diǎn):能夠識(shí)別能夠識(shí)別DNA特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列,切開(kāi)切

13、開(kāi) 兩個(gè)兩個(gè)_之間的之間的_ . (3) DNA末端末端:限制酶切割限制酶切割DNA產(chǎn)生的產(chǎn)生的DNA末末端有兩種形式端有兩種形式:_和和_. 2. DNA連接酶連接酶-”分子縫合針?lè)肿涌p合針” (1)作用作用:將雙鏈將雙鏈DNA_,恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的兩個(gè)核苷酸之間的_. (2)種類種類: E.coli DNA連接酶連接酶:只能縫合只能縫合DNA的的_ T4 DNA連接酶連接酶:既可縫合既可縫合DNA的的_,又可又可縫合雙鏈縫合雙鏈DNA的的_. 3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體-”分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車” (1)載體的種類載體的種類 質(zhì)粒質(zhì)粒:是一種裸露的是一種裸露的,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,獨(dú)立于細(xì)菌染獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外色體之外,并能夠自我并能夠自我_能力的雙鏈能力的雙鏈_ DNA 分子分子;_的衍生物的衍生物;_. (2)載體的特點(diǎn)載體的特點(diǎn) 能夠在細(xì)胞內(nèi)能夠在細(xì)胞內(nèi)_;有一個(gè)或多個(gè)有一個(gè)或多個(gè)_切割位點(diǎn)切割位點(diǎn),便于供源便于供源DNA的插入的插入.