紫外可見分子吸收光譜法特征和應用

1、紫外-可見分子吸收光譜法特征和應用第一節(jié) 概述一、分子吸收光譜分析的發(fā)展概況可見-紫外-目視比色-光電比色-分光光度光聲光譜-長光程吸收光譜-傳感器二、分子吸收光譜的分類和特征紫外-可見電子光譜Ee =1 - 20 eV紅外振動光譜遠紅外轉動光譜電磁波區(qū)域電磁波可分為高頻、中頻及低頻區(qū)。高頻對應放射線（g射線，C射線），涉及原子核，內層電子；而中等頻率指紫外-可見光，近紅外、中紅外和遠紅外光，涉及外層電子能級的躍遷，振動及轉動。低頻指電波（微波，無線電波），涉及轉動，電子自旋，核自旋等。 光的本質是電磁輻射，光的基本特性是波粒二象性(wave and corpuscle duality)。 光

2、的波動性是指光可以用互相垂直的、以正弦波振蕩的電場和磁場表示。電磁波具有速度、方向、波長、振幅和偏振面等。光可有自然光、偏振光（線偏振或園偏振）、連續(xù)波、調制波、脈沖波等。 電磁輻射的特性物質具有能量，是誘電體。物質與光的作用可看成是光子對能量的授受，即 hn=E1-E0，該原理廣泛應用于光譜解析。電磁輻射與物質的作用本質是物質吸收光能后發(fā)生躍遷。躍遷是指物質吸收光能后自身能量的改變。因這種改變是量子化的，故稱為躍遷。不同波長的光，能量不同，躍遷形式也不同，因此有不同的光譜分析法。 電磁輻射與物質的相互作用譜圖的三要素一般進行光譜分析時，要同時注意譜圖的位置（能量）、強度（躍遷幾率）、波寬這三

3、個要素，才能得出正確的結論。遠紫外紫外可見紅外遠紅外10200nm200380nm380780nm0.7550m50250 m分子外層價電子躍遷分子外層價電子躍遷分子外層價電子躍遷分子中原子的振動分子的轉動遠紫外吸收紫外吸收可見吸收紅外吸收遠紅外吸收光譜類型分子運動形式波 長光譜區(qū)域分子內部運動 價電子運動、分子內原子在平衡附近的振動、分子作為整體繞其重心的轉動。分子能級 電子能級、振動能級、轉動能級分子總能量 E=Ee+Ev+Er當分子吸收一定能量的電磁輻射時，分子由較低的能級E1 躍遷到較高的能級E2，吸收輻射的能量與分子的這兩個能級的能量差相等。 E=E2-E1=h=hc/ 由于三種能級

4、之間的差值很小，不能區(qū)分開，得到的分子光譜為帶光譜。由于三種能級躍遷所需要能量不同，所以需要吸收不同波長的電磁輻射使產生躍遷，所產生的光譜應在不同的光學區(qū)域。 eeE Ea b cRoRoRoVoV1EoE1E電子能級V振動能級R轉動能級分子在吸收過程中發(fā)生電子能級躍遷的同時伴隨振動能級和轉動能級的能量變化。原子對電磁輻射的吸收只涉及原子核外電子能量的變化，是一些分離的特征銳線，而分子的吸收光譜是由成千上萬條彼此靠得很緊的譜線組成，看起來是一條連續(xù)的吸收帶。溶液中相鄰分子間的碰撞導致分子各種能級的細微變化，也會引起譜帶的進一步加寬和匯合。當分子由氣態(tài)變?yōu)槿芤簳r，一般會失去振動精細結構 分子的電

5、子光譜的特點：在波長范圍內按一定強度分布的譜帶帶光譜 波長位于紫外-可見區(qū)物質的紫外吸收光譜決定于分子中價電子的躍遷，因此分子的組成不同，特別是價電子性質不同，則產生吸收光譜也不用。三、分子吸收光譜的特點可進行分子的定性和定量分析可用于一些物理化學常數的測定（如平衡常數等）儀器結構簡單、價格便宜應用范圍廣泛（無機離子、有機化合物、生物大分子分析等）一、吸收光譜與分子結構1、有機化合物的吸收光譜根據分子軌道理論，分子中的電子軌道有 n、和 三種*n第二節(jié) 紫外-可見分子吸收光譜的理論基礎反鍵軌道非鍵軌道成鍵軌道 *躍遷 能量很大 吸收光譜在真空紫外區(qū) 多為飽和烴甲烷125 nm乙烷135 nmn

6、 * 躍遷 所需能量小于 *躍遷（150-250 nm） 含有未共用電子對（n電子）原子的飽和化合物都可發(fā)生躍遷的摩爾吸光系數比較小，一般在100-3000 L / mol cm化合物maxmaxH2O1671480CH3OH184150CH3Cl173200(CH3)2O1842520 * 和 n * 躍遷 * 和 n * 躍遷能量低（200 nm） 含有不飽和鍵的有機分子易發(fā)生這類躍遷 C=C C=C ; N=N ; C=O 有機化合物的紫外-可見吸收光譜分析多以這兩類躍遷為基礎 * 比 n * 躍遷幾率大 100-1000 倍 *躍遷吸收強， 104 n * 躍遷吸收弱， 500生色團

7、含有 鍵不飽和官能團，能進行n * 、 * 含碳碳雙、三鍵，碳氧雙鍵，氮氮雙鍵基團。助色團 基團本身無色，但能增強生色團顏色為含有n電子， n *，且能與電子作用，產生n 共軛。-OH、-NH2、-SH、-SO3H紅移和紫移 因取代基或溶劑的改變，使吸收帶的最大吸收波長發(fā)生移動。向長波長方向移動為紅移，向短波長方向移動為紫移。CH4 * 150210nmCH3I n* 259 nmCH2I2 n* 292nmCHI3 n* 349nm影響紫外-可見光譜的因素共軛效應：電子共軛體系增大，波長紅移、吸收增強；取代基影響：能夠引起電子永久性轉移的取代基使波長紅移（助色團）；溶劑影響：一般情況下分子的

8、激發(fā)態(tài)極性大于基態(tài)，因此溶劑極性增大有利于激發(fā)態(tài)穩(wěn)定，能量降低，波長紅移。max185nm204nm210nm270nm240nm270nm328nmmax取代基的影響：在光的作用下，有機化合物都有發(fā)生極化的趨向，既能轉變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)。當共軛雙鍵的兩端有容易使電子流動的基團(給電子基或吸電子基)時，極化現象顯著增加。給電子基為帶有未共用電子對的原子的基團。如-NH2, -OH等。未共用電子對的流動性很大，能夠和共軛體系中的p電子相互作用引起永久性的電荷轉移，形成p-p共軛，降低了能量，lmax紅移。吸電子基是指易吸引電子而使電子容易流動的基團。共軛體系中引入吸電子基團，也產生p電子的永久性轉移，l

9、max紅移。p電子流動性增加，吸收光子的吸收分數增加，吸收強度增加。給電子基與吸電子基同時存在時，產生分子內電荷轉移吸收，lmax紅移，emax增加。 給電子基的給電子能力順序為： -N(C2H5)2-N(CH3)2-NH2-OH-OCH3-NHCOCH3-OCOCH3-CH2CH2COOH-H 吸電子基的作用強度順序是： -N+(CH3)3-NO2-SO3H-COH-COO-COOH-COOCH3-Cl-Br-I 除了有機化合物的p p*和n p*躍遷吸收帶以外，當外來輻射照射某些有機或無機化合物時,可能發(fā)生一個電子從體系具有電子給予體特性部分(稱為給體,donor)轉移到該體系的另一具有電

10、子接受體特性的部分(稱為受體，acceptor)，這種電子轉移產生的吸收譜帶，稱為電荷轉移吸收帶。電荷轉移吸收帶涉及的是給體的一個電子向受體的一個電子軌道上的躍遷，激發(fā)態(tài)是這一內氧化還原過程的產物。電荷轉移過程可表示如下： 式中D與A分別代表電子給體與受體。下面是能產生電荷轉移吸收帶的一些化合物。 -NR2是電子給體，苯環(huán)是電子受體。 苯環(huán)是電子給體，氧是電子受體。 電荷轉移吸收帶的一個特點是吸收強度大，emax 104l/mol cm因此含有這類結構的分子測定靈敏度高，該原理已被廣泛應用于分子識別的主體分子設計中。 2、無機化合物的吸收光譜某些無機金屬離子也會產生紫外-可見吸收。如含d電子的

11、過渡金屬離子會產生配位體場吸收帶。依據配位場理論，無配位場存在時， 能量簡并；當過渡金屬離子處于配位體形成的負電場中時，5個簡并的d軌道會分裂成能量不同的軌道。不同配位體場，如八面體場、四面體場、正方平面配位場等使能級分裂不等。 d-d 電子躍遷絕大多數過渡金屬離子都具有未充滿的 d 軌道，按照晶體場理論，當它們在溶液中與水或其它配體生成配合物時，受配體配位場的影響，原來能量相同的 d軌道發(fā)生能級分裂，產生 d-d 電子躍遷。配體配位場越強，d 軌道分裂能越大，吸收波長越短。（f - f 躍遷與此類似）沒有配位場八面體配位場dxy dxx dyzdx2 dx2-y2E一般配位體場吸收帶在可見區(qū)

12、，emax約0.1-100 l/mol cm，吸收很弱。因此配位體場吸收帶對定量分析用處不大。鑭系及錒系離子5f電子躍遷產生的f電子躍遷吸收譜帶出現在紫外-可見區(qū)。由于f軌道為外層軌道所屏蔽，受溶劑性質或配位體的影響很小，故譜帶窄。 少數無機陰離子，如NO3-(lmax=313 nm)、CO32-(lmax =217 nm)、NO2-(lmax =360 、280 nm)、N3-(lmax =230 nm)、CS32-(lmax =500 nm)等也有紫外-可見吸收。 例如：H2O 配位場 NH3 配位場Cu 2+ 水合離子 794 nm淺藍色Cu 2+ 氨合離子663 nm深藍色小結：分子結

13、構光譜特征定性分析不同結構的分子由于共軛程度不同，分子吸收的特征不同；相同共軛結構的分子骨架，因助色團的加入或改變，導致光譜位移和吸收系數變化；相同配體，因過渡金屬離子不同，導致配位場的變化或電荷轉移躍遷，或配體共軛結構的變化，光譜發(fā)生變化IoIbSdx二、吸收定律（定量分析的基礎）IxdIxdIxIx吸收光強入射光強吸收率任一截面的吸收率A = b c吸收定律二、吸收定律的適用性與限制1、吸收定律具有加和性，即特別是存在非吸收線(或吸收很小,雜散光)和濃度較大時，I變得 很小。I i= 常數吸收定律或比爾定律，其成立條件是待測物為均一的稀溶液、氣體等，無溶質、溶劑及懸濁物引起的散射；入射光為

14、單色平行光。比爾定律在有化學因素影響時不成立。解離、締合、生成絡合物或溶劑化等會對比爾定律產生偏離。比爾定律在有儀器因素影響時也不成立。非單色光對比爾定律產生偏離。雜散光(非吸收光)也會對比爾定律產生影響。 其他影響因素包括溶劑、光效應等也應考慮。 三、紫外-可見吸收光譜的靈敏度 = 0.4343 N aiai = 1x10-15 cm2吸光分子的截面積 N = 6.02x 1023因為 為摩爾吸光系數 ai 的單位是 cm2 （cm3 是 ml,變成L除1000）所以 = 0.4343 N ai = 0.4343 x 6.02x 1023 x 1x10-15/ 1000 = 105若1%吸收

15、b = 1C=b 100000= 4.4 x 10-8 (M)此即為方法的理論靈敏度第三節(jié)紫外-可見分光光度計一、基本結構光源單色器狹縫樣品室檢測器、光源氫燈、氘燈、鎢燈常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源。利用固體燈絲材料高溫放熱產生的輻射作為光源的是熱輻射光源。如鎢燈、鹵鎢燈。兩者均在可見區(qū)使用,鹵鎢燈的使用壽命及發(fā)光效率高于鎢燈。氣體放電光源是指在低壓直流電條件下,氫或氘氣放電所產生的連續(xù)輻射。一般為氫燈或氘燈,在紫外區(qū)使用。這種光源雖然能提供至160nm的輻射,但石英窗口材料使短波輻射的透過受到限制(石英200nm,熔融石英185nm),而大于360nm時,氫的發(fā)射譜線疊加于連續(xù)光譜之

16、上,不宜使用。2、單色器單色器的作用是使光源發(fā)出的光變成所需要的單色光。通常由入射狹縫、準直鏡、色散元件、物鏡和出射狹縫構成。入射狹縫用于限制雜散光進入單色器，準直鏡將入射光束變?yōu)槠叫泄馐筮M入色散元件。后者將復合光分解成單色光，然后通過物鏡將出自色散元件的平行光聚焦于出口狹縫。出射狹縫用于限制通帶寬度。棱鏡和光柵分光原理與原子吸收類似。3、檢測器簡易分光光度計上使用光電池或光電管作為檢測器。目前最常見的檢測器是光電倍增管其特點是在紫外-可見區(qū)的靈敏度高，響應快。但強光照射會引起不可逆損害，因此高能量檢測不宜，需避光。一般單色器都有出口狹縫。經光柵分光后的光是一組以角度分布的l1,l2等的光線

17、通過旋轉光柵角度使某一波長的光經物鏡聚焦到出口狹縫。二極管陣列檢測器不使用出口狹縫,在其位置上放一系列二極管的線形陣列,則分光后不同波長的單色光同時被檢測。二極管陣列檢測器的特點是響應速度快。但靈敏度不如光電倍增管，因后者具有很高的放大倍數。 4、樣品室1 cm5 cm石英 玻璃二、紫外-可見分光光度計紫外-可見分光光度計，按其光學系統(tǒng)可分為單波長與雙波長分光光度計單光束與雙光束分光光度計 1、單光束儀器S1HW紅藍S2單光束儀器中，分光后的單色光直接透過吸收池，交互測定待測池和參比池。單光束儀器的缺點： 操作麻煩：空白IO樣品I任一波長 不能進行吸收光譜的自動掃描光源不穩(wěn)定性影響測量精密度2

18、、雙光束儀器IOI雙光束儀器中，從光源發(fā)出的光經分光后再經扇形旋轉鏡分成兩束，交替通過參比池和樣品池。雙光束儀器的特點和不足： 測量方便，不需要更換吸收池 補償了儀器不穩(wěn)定性的影響 實現了快速自動吸收光譜掃描 不能消除試液的背景成分吸收干擾單光束儀器中，分光后的單色光直接透過吸收池，交互測定待測池和參比池。儀器結構簡單，適用于測定特定波長的吸收，進行定量。而雙光束儀器中，從光源發(fā)出的光經分光后再經扇形旋轉鏡分成兩束，交替通過參比池和樣品池，測得的是透過樣品溶液和參比溶液的光信號強度之比。雙光束儀器克服了單光束儀器由于光源不穩(wěn)引起的誤差，并且可以方便地對全波段進行掃描。 3、雙波長儀器切光器12

19、儀器既可用作雙波長分光光度計又可用作雙光束儀器當用作單波長雙光束儀器時,單色器出射的單色光束為遮光板所阻擋，單色器1出射的單色光束被斬光器分為兩束斷續(xù)的光，交替通過參比池和樣品池，最后由光電倍增管檢測信號。當用作雙波長儀器時,由兩個單色器分出的不同波長1和2的兩束光，由斬光器并束，使其在同一光路交替通過吸收池，由光電倍增管檢測信號。雙波長儀器的主要特點是可以降低雜散光,光譜精度高。 單光束和雙光束分光光度計，就測量波長而言，都是單波長的。由一個單色器分光后，讓相同波長的光束分別通過試樣池和測量池，測得試樣池和測量池吸光度之差。雙波長由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經過兩個單色器，同時得到兩個

20、不同波長（1和2）的單色光。由斬光器并束，使其在同一光路交替通過吸收池,由光電倍增管檢測信號。雙波長儀器的主要特點是可以降低雜散光,光譜精度高。不僅能夠測量高濃度試樣，多組分混合試樣，還能測定混濁試樣。消除光譜重疊干擾A1 = Aa 1 + Ai 1 A2 = Aa 2 + Ai 2 Ai 1 = Ai 2 A = Aa 2 - Aa 1 =（a1 -a2）bCa消除了共存組分的干擾雙波長儀器能否消除背景干擾？A1 = lg I0/ I1 = 1bC + AbA2 = lg I0/ I2 = 2bC + Ab式中 Ab 為背景吸收或干擾物質的吸收若波長選擇合適， 1和 2處 Ab相同A1 =

21、11C1 + 12C2 + 13C3 A2 = 21C1 + 22C2 + 23C3A3 = 31C1 + 32C2 + 33C3ij為在波長i測定組分j的摩爾吸光系數Ai 為在波長i測得該體系的總吸光度解上聯(lián)立方程可求出待測物濃度C1、C2、C3分光光度計的校正 波長校正 可采用輻射光源法校正。常用氫燈(486.13, 656.28 nm)、氘燈(486.00, 656.10 nm)或石英低壓汞燈(253.65, 435.88, 546.07 nm)校正。鐠釹玻璃在可見區(qū)有特征吸收峰，也可用來校正。 苯蒸汽在紫外區(qū)的特征吸收峰可用于校正。在吸收池內滴一滴液體苯，蓋上吸收池蓋，待苯揮發(fā)后繪制苯

22、蒸汽的吸收光譜。 吸光度校正以重鉻酸鉀水溶液的吸收曲線為標準值校正。將克重鉻酸鉀溶于1 升的氫氧化鉀中，以1cm 吸收池，25C測定吸收光譜。 定性分析用于有機物的鑒定、同分異構體的鑒別、物質結構的測定。物質的紫外吸收光譜基本上是分子中生色團、助色團的特性，而不是它的整個分子的特性。化合物純度鑒定鑒定未知試樣推斷分子結構第四節(jié)紫外-可見分光光度法的應用判斷異構體：紫外吸收光譜的重要應用在于測定共軛分子。共軛體系越大，吸收強度越大，波長紅移。 如： 和 前者有紫外吸收，后者的lmax200nm。同樣，CH3COCH2CH2COCH3的最大吸收波長要短于CH3CH2CO-COCH2CH3。下面兩個

23、酮式和烯醇式異構體中，烯醇式結構的摩爾吸光系數要遠大于酮式，也是由于烯醇式結構中有雙鍵共軛之故。CH2COCH2COOC2H5 CH3C(OH)=CHCOOC2H5酮式(lmax =275 nm, e =100) 烯醇式(lmax =245 nm, e =18,000)判斷共軛狀態(tài)：可以判斷共軛生色團的所有原子是否共平面等。如二苯乙烯（ph-CH=CH-ph）順式比反式不易共平面，因此反式結構的最大吸收波長及摩爾吸光系數要大于順式。順式: lmax =280 nm, e =13,500; 反式: lmax =295 nm, e =27,000判斷共軛狀態(tài)：可以判斷共軛生色團的所有原子是否共平面

24、等。如二苯乙烯（ph-CH=CH-ph）順式比反式不易共平面，因此反式結構的最大吸收波長及摩爾吸光系數要大于順式。 順式: lmax =280 nm, e =13,500; 反式: lmax =295 nm, e =27,000 已知化合物的驗證：與標準譜圖比對，紫外-可見吸收光譜可以作為有機化合物結構測定的一種輔助手段。 有機合物紫外光譜解析 了解共軛程度、空間效應、氫鍵等；可對飽和與不飽和化合物、異構體及構象進行判別。 紫外可見吸收光譜中有機物發(fā)色體系信息分析的一般規(guī)律是： 若在200750nm波長范圍內無吸收峰，則可能是直鏈烷烴、環(huán)烷烴、飽和脂肪族化合物或僅含一個雙鍵的烯烴等。 若在27

25、0350nm波長范圍內有低強度吸收峰(10100Lmol-1cm-1),（n躍遷），則可能含有一個簡單非共軛且含有n電子的生色團，如羰基。 若在20300nm波長范圍內有中等強度的吸收峰則可能含苯環(huán)。 若在210250nm波長范圍內有強吸收峰，則可能含有2個共軛雙鍵；若在260300nm波長范圍內有強吸收峰，則說明該有機物含有3個或3個以上共軛雙鍵。 若該有機物的吸收峰延伸至可見光區(qū)，則該有機物可能是長鏈共軛或稠環(huán)化合物。定量分析基本原理：朗伯-比爾定律 A= C L單組分作 AC曲線多組分根據吸光度具有加和性的特點測定單組分定量分析 紫外-可見吸收光譜是進行定量分析最廣泛使用的、最有效的手段

26、之一。尤其在醫(yī)院的常規(guī)化驗中，95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的優(yōu)點是：可用于無機及有機體系。 一般可檢測10-4-10-5 mol/l的微量組分，通過某些特殊方法(如膠束增溶)可檢10-6-10-7 mol/l的組分。 準確度高，一般相對誤差1-3%，有時可降至百分之零點幾。 分析條件的選擇溶劑的選擇所選擇的溶劑應易于溶解樣品并不與樣品作用，且在測定波長區(qū)間內吸收小，不易揮發(fā)。可用于測定的最短波長(nm) 常見溶劑200蒸餾水，乙腈，環(huán)己烷 220甲醇，乙醇，異丙醇，醚 250二氧六環(huán)，氯仿，醋酸 270N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙酸乙酯，四氯化碳 (275) 290苯，甲苯，

27、二甲苯 335丙酮，甲乙酮，吡啶，二硫化碳(380) 下表為某些常見溶劑可用于測定的最短波長測定濃度的選擇溶液吸光度值在范圍內誤差小時誤差最小)，因此可根據樣品的摩爾吸光系數確定最佳濃度。即吸光度時，吸光度測量誤差最小。將吸光度值控制在之間，光度測量誤差較小。 三、測量誤差只有當則測量誤差最小，此時- logT = log e = 0.434 = A即吸光度為時，濃度測量才具有最小相對誤差。一、絡和物組成的測定摩爾比法等摩爾系列法斜率比法平衡移動法應 用摩爾比率法測定絡和比：mM+nR MmRn配制：不同CR/CM的系列溶液：如CR/CM=1，2，3，n分別測吸光度：A1, A2 ,A3An,

28、 作A CR/CM曲線摩爾比法設有絡合反應mM + nY = MmYn，固定一個組分(如M)的濃度不變，改變另一組分(如Y)的濃度，求得一系列Y/M比，在絡合物MmYn的最大吸收波長處測定吸光度的變化。則開始時，隨Y/M的增加，溶液吸光度線性增加，到達絡合物的組成比后，繼續(xù)增加Y/M，會有三種不同情況： 吸光度達到飽和，不再增加。說明試劑Y無吸收，吸光度的增加只是絡合物的單獨貢獻。如Fe(III)-鈦鐵試劑絡合物。 吸光度出現一轉折點后繼續(xù)增加。說明試劑Y在絡合物的lmax處稍有吸收。如Zn-PAN絡合物。PAN：1-(2-吡啶基偶氮)-2-萘酚。 吸光度出現一轉折點后呈直線下降。說明分步生成

29、了摩爾吸光系數小于絡合物e的高次絡合物。如Bi-二甲酚橙絡合物。圖代表了第一種情況。曲線轉折點對應的摩爾濃度比Y/M = n:m，即為該絡合物的組成比。摩爾比法測定絡合物的組成比。 若絡合物穩(wěn)定性差，絡合物解離使吸光度下降，轉折不明顯，據此可以測定絡合物不穩(wěn)定常數。設：絡合物解離度為 ，不解離時轉折處濃度為 CCMmRn = (1- )CCM = m CCR = n C則絡合物不穩(wěn)定常數為 = A0 - AA0K = CMmCRn (m C)m(n C)n mmnn m+n Cm+n-1CMmCRn(1- )C1- =二、酸堿離解常數的測定HBH+B-Ka =H+B-HB(1)pKa=pH+l

30、gHBB-設：b=1cmA=A HB +AB-A=HB（c- B-) +B-B- = HBc+B- (B- HB)同樣由（2）得： A=HBHB+ B-(c-HB)= B-c+HB (HB- B-)B-=HBA -HB cB-則：A=A HB +AB-=HBHB+ B-B- (2)HB=B-c-AB- HB(3)(4)將（3）（4）代入（1）中：Ka =H+B-HBC=HB+B-Ka=H+(A -HB c)B-c-AA HB=HB cAB-=B-c定義：A -AHBKa=H+AB-ApKa=pH+lgA -AHBAB-A第五節(jié) 分光光度測定方法普通分光光度法示差分光光度法雙波長分光光度法導數分

31、光光度法一、普通分光光度法以一定的標準溶液滴定待測物溶液，測定滴定中溶液的吸光度變化，通過作圖法求得滴定終點，從而計算待測組分含量的方法稱為分光光度滴定。一般有直接滴定法和間接滴定法兩種。前者選擇被滴定物、滴定劑或反應生成物之一摩爾吸光系數最大的物質的lmax為吸收波長進行滴定。滴定曲線有如下幾種形式。間接滴定法需使用指示劑。光度滴定與通過指示劑顏色變化用肉眼確定滴定終點的普通滴定法相比，準確性、精密度及靈敏度都要高。光度滴定已用于酸堿滴定、氧化還原滴定、沉淀滴定和絡合滴定。 1.分光光度滴定 2.單組分的測定 通常采用 A-C 標準曲線法定量測定。3.多組分的同時測定 若各組分的吸收曲線互不

32、重疊，則可在各自最大吸收波長處分別進行測定。這本質上與單組分測定沒有區(qū)別。 若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。 A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb 普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當待測組分含量較高時，將產生較大的誤差。需采用示差法。即提高入射光強度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液。 設：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度為cs(cs cx)。則： Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 二、示差分光光度法（示差法） AAx As =b(cx cs ）=bc 測得

33、的吸光度相當于普通法中待測溶液與標準溶液的吸光度之差A 。 示差法測得的吸光度與c呈直線關系。由標準曲線上查得相應的c值，則待測溶液濃度cx ： cx = cs + c 普通法： cs的T=10%；cx的T=5% 示差法： cs 做參比，調T=100% 則： cx的T=50% ；標尺擴展10倍示差法標尺擴展原理： 不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(1和2)；以參比波長1處的吸光度A1作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復雜試樣時顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。 A A2 A1 (2 1)b c 兩波長處測得的吸光度差值A與

34、待測組分濃度成正比。1和2分別表示待測組分在1和2處的摩爾吸光系數。 三、雙波長分光光度法 測量波長2和參比波長1的選擇與組合 以兩組分x和y的雙波長法測定為例：設：x為待測組分，y為干擾組分，二者的吸光度差分別為: Ax和Ay，則該體系的總吸光度差Ax+y為： Ax+y = A x + A y 如何選擇波長1 、2有一定的要求。關鍵問題: 選定的波長1和2處干擾組分應具有相同吸光度，即： Ay = A y2 A y1 = 0故： Ax+y = A x=(x2x1)bcx此時：測得的吸光度差A只與待測組分x的濃度呈線性關系，而與干擾組分y無關。若x為干擾組分，則也可用同樣的方法測定y組分。 可

35、采用作圖法選擇符合上述兩個條件的波長組合。 在選定的兩個波長1和2處待測組分的吸光度應具有足夠大的差值。選擇波長組合1 、2的基本要求是：可用于懸濁液和懸浮液的測定，消除背景吸收 因懸濁液的參比溶液不易配制，使用雙波長分光光度法時，可固定1為不受待測組分含量影響的等吸收點(于樣品中依次加入待測組分，記錄吸收光譜，得到的吸光度重疊的點為等吸收點，測定2處的吸光度變化，可以抵消混濁的干擾，提高測定精度(因為使用同一吸收池)。等吸收點波長 等吸收點等吸收點無須分離，可用于吸收峰相互重疊的混合組分的同時測定。 設有混合組分x和y，1時，A1=1xbCx+ 1ybCy2時，A2= 2xbCx+ 2ybC

36、y A= A2- A1=( 2x- 1x)bCx +( 2y- 1y)bCy選擇1和l2，使2y= 1y，即 1和 是y等吸收點的波長，則： A= ( 2x- 1x)bCx 從而消除了y的干擾。如果體系中不存在等吸收點，可以通過作圖法選擇干擾組分的等吸光點，也可以消除干擾。如：,三氯苯酚存在下苯酚的測定， 1（nm） 為等吸收點，測定（nm） 苯酚吸收 導數分光光度法在多組分同時測定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強光譜的精細結構以及復雜光譜的辨析等方面，顯示了很大的優(yōu)越性。 利用吸光度(或透光度)對波長的導數曲線來進行分析： 0 e-bc假定入射光強度0 在整個波長范圍內保持恒定： dI 0

37、 /d0則：dI/d0 bc e -bc d/d 0 bc d/d 四、導數分光光度法 dI/d 0 bc d/d 一階導數信號與試樣濃度呈線性關系； 測定靈敏度依賴于摩爾吸光系數對波長的變化率d/d。吸收曲線的拐點處d/d最大，故其靈敏度最高(見圖）。 同理可以導出其二階和三階導數光譜（略） 隨著導數階數的增加，譜帶變得尖銳，分辨率提高，但原吸收光譜的基本特點逐漸消失。導數光譜的特點在于靈敏度高，可減小光譜干擾。因而在分辨多組分混合物的譜帶重疊、增強次要光譜(如肩峰)的清晰度以及消除混濁樣品散射的影響時有利。 動力學分光光度法是利用反應速度參數測定待測物型體原始濃度的方法。設有一反應速度較慢

38、的顯色反應，因催化劑H的存在而加速， 五、動力學分光光度法若F為在紫外-可見區(qū)有吸收的化合物，則F的生成反應速度可表示為： CH為常數，積分得： 上式為動力學分光光度法的基本關系式 準零級法或初始速度法是指只在占完成反應總時間的-的起始期間內測量速度數據，此時反應物D, E消耗不大，近似等于起始濃度D0, E0，為常數。同時形成產物的量可以忽略不計。若逆反應可以不考慮，催化劑H的量也可視為不變。則上式可變?yōu)椋?測定CH的方法有 固定時間法 在催化反應進行一固定時間(t=常數)后，用快速冷卻、改變酸度、加入催化劑活性抑制劑等方法終止反應，測定體系吸光度。t為常數時，A=k1CH。選擇一系列CH的

39、標準溶液，并測定固定時間t時的吸光度A，繪制A- CH工作曲線，由待測樣在t時的吸光度值求得CH。 固定濃度法 測量顯色產物F達到一定濃度(一定吸光度值)時所需的時間。CF為常數時，CH=K/t。配制一系列不同濃度CH的標準溶液，測定達到一定吸光度A時的時間t，繪制CH-1/t工作曲線，由待測樣經反應達到A時所需要的時間t求得CH。 斜率法 由吸光度A隨反應時間的變化速率DA/Dt來測定CH。因為DA/Dt=kCH，配制標準溶液具有不同的CH，分別測定A-t曲線，求得曲線斜率DA/Dt，再繪制DA/Dt-CH工作曲線。對待測樣亦同樣測定A-t曲線，求得曲線斜率DA/Dt，從DA/Dt-CH工作曲線上求得CH。斜率法實驗數據多，準確度高。圖為催化反應測定痕量鎢酸根的示意圖。 動力學分光光度法的特點是靈敏度高(10-6-10-9g/ml，有的可達10-12g/ml)。但由于影響因素多，不易嚴格控制，測定誤差較大。六、光聲光譜法photoacoustic spectroscopy光聲光譜法是1970年以后發(fā)展起來，可用于測定固體、半固體狀態(tài)的生物組織或渾濁液體樣品的紫外-可見吸收光譜。而普通的紫外-可見吸收光譜法由于散射及反射的影響