分子檢測在非小細胞肺癌診治中的應用(130頁)課件

1、基因檢測在肺癌臨床診治中的應用肺癌肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤。肺癌目前是全世界癌癥死因的第一名。1995年全世界有60萬人死于肺癌，而且每年人數(shù)都在上升，2003年世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的死亡率是110萬/年，發(fā)病率是120萬/年。約80%的肺癌為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）。Cancer Cell 2, 437 (Dec, 2002)腺癌鱗癌大細胞小細胞肺癌的傳統(tǒng)分類觀點小細胞肺癌 (SCLC)非小細胞肺癌 (NSCLC)腺癌鱗癌大細胞癌腺癌鱗癌大細胞小細胞肺癌的傳統(tǒng)分類KRAS不清楚EGFRHER2BRAFALK fusionP

2、IK3CAMEK1ROS fusionPDGFR amp肺腺癌的分子亞型 (2009)肺腺癌的分子分類分子靶向治療是在細胞分子水平上，針對已經(jīng)明確的致癌位點(該位點可以是腫瘤細胞內部的一個蛋白分子，也可以是一個基因片段)，來設計相應的治療藥物，藥物進入體內會特異地選擇致癌位點來相結合發(fā)生作用，使腫瘤細胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍的正常組織細胞。藥物靶向治療的效果取決于腫瘤內是否存在靶向藥物作用的分子靶點及其異常狀態(tài)。分子檢測的意義腫瘤分子靶向藥物的發(fā)展，為腫瘤的治療帶來了新的希望和手段，腫瘤個體化治療的前景廣闊，提高了對腫瘤病理診斷的要求，分子診斷是適應腫瘤治療的未來發(fā)展方向。非編碼區(qū)非編

3、碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結合位點12345加 工轉 錄mRNA前體成熟mRNA加 工基因蛋白質翻 譯從基因到蛋白示意圖8從基因到蛋白示意圖非小細胞肺癌相關分子突變EGFR突變K-RAS突變B-RAF突變PI3K突變ALK突變ROS1突變MET突變HER2擴增RET1突變腺癌的驅動基因LCMC(美國)MSN(法國)中國日本EGFR17%13%40%50%KRAS22%28%7%15%ELM4-ALK7%2%7%5%BRAF2%2%2%1%HER21%1%NA3%PIK3CA1%1%4%NAPTENNANA6%NAMET擴增1%1%5%4%Nil46%33%29%22%Kris ASCO 2011

4、Planchard ELCC 2012 Wu JSMO 2011 Mitsudomi JCCO 2010 97%的基因突變互相排斥單個突變數(shù)ALKAKTBRAFEGFRHER2KRASMEK1METNRASPIK3CAALK (38)X1211AKT (1)XBRAF (9)X1EGFR (89)X13HER2 (3)XKRAS (114)X11MEK1 (2)X11MET AMP (3)XNRAS (2)XPIK3CA (6)XKris MG. et al. ASCO 2011, Abstract # CRA7506. Lung Cancer.2014,84(2):121126中國1139例

5、肺腺癌各基因構成比圖EGFR突變 表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）主要位于細胞膜上，屬受體酪氨酸激酶家族。 EGFR被配體激活后啟動胞內該通路上的信號傳導，經(jīng)過細胞質中銜接蛋白、酶的級聯(lián)反應，調節(jié)轉錄因子激活基因的轉錄，指導細胞遷移、黏附、增殖、分化和凋亡。 EGFR下游的信號轉導通路主要有兩條：一條是Ras/ Raf/ MEK/ ERK-MAPK 通路，而另一條是PI3K/Akt/mTOR通路。 細胞膜外部分（NH2-端）：伸出膜外與配體結合的氨基酸區(qū)域，由621個氨基酸殘基組成。穿膜部分：錨定在細胞膜上由23個氨基酸殘基構成螺旋

6、狀結構的中間跨膜區(qū)域。細胞膜內部分（COOH-端）：具有蛋白激酶結構域的細胞質內羧基端區(qū)域，包含542個氨基酸殘基。EGFR的結構：170 kDa糖蛋白 表皮生長因子受體(EGFR)在腫瘤生長和分化中起重要作用,其結構如圖a,當其被配體EGF活化時,通過二聚化使胞內酪氨酸激酶結構域被激活,從而受體被活化(圖b、c)。 EGFR家族與癌癥Tyrosine kinaseCancer associationsErbB1(EGFR)乳腺癌, 卵巢癌, 肺癌, 神經(jīng)膠質瘤等ErbB2(HER2)乳腺癌, 卵巢癌, 胃癌, 肺癌,結直腸癌等ErbB3(HER3)乳腺癌ErbB4(HER4)乳腺癌, 顆粒細

7、胞瘤TKTKTKerbB1HER1EGFRerbB2HER2erbB3HER3erbB4HER4No specific ligands - often acts as dimer partnerHeregulinsNRG2NRG3Heregulins-cellulinEGF, TGFa , b CellulinAmphiregulin, HB-EGFEGFR的配體表皮生長因子（EGF ）轉化生長因子（TGF）雙調蛋白（AR ）上皮調節(jié)蛋白（Epiregulin）肝素結合的表皮生長因子(HB-EGF ) BTC ( betacelluin)表皮素(epiregulin，EPR)TKTKEGFR

8、在腫瘤細胞中Survival(anti-apoptosis)PI3-KSTAT3AKTPTENMEKGene transcriptionMAPKProliferation/maturationChemotherapy /radiotherapyresistanceAngiogenesisMetastasispYpYRASRAFSOSGRB2pYG1SMG2EGFR在腫瘤細胞中的作用 促進腫瘤細胞的體內外增殖 促進腫瘤新生血管的生成促進腫瘤的遠地轉移保護腫瘤細胞不進入凋亡EGFR在惡性腫瘤中的表達Normal CellCancerous CellUp RegulationMutationEGFR

9、在惡性腫瘤中的表達EGFR突變狀態(tài)已成為患者能否在一線使用TKI藥物的重要指標EGFR突變相關靶向藥物針對EGFR所開發(fā)的分子靶向藥物主要分兩類: 1.小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)， 如吉非替尼（Gefitinib， 也稱為易瑞沙/Iressa，阿斯利康）和厄羅替尼（Erlotinib，也稱為特羅凱/Tarceva，羅氏制藥)，抑制EGFR胞內區(qū)酪氨酸激酶活性； 2.單克隆抗體(mAb)，如西妥昔（Cetuximab，也稱為愛必妥/Erbitux）和帕尼單抗（Panitumumab，也稱為維克替比/Vectibix)，與EGFR胞外區(qū)結合，阻斷依賴于配體的EGFR活化。上述藥物通過不同途徑

10、阻斷EGFR介導的細胞內信號通路，從而抑制腫瘤生長、轉移和血管生成，并促進腫瘤細胞凋亡，提高放化療敏感性。 EGFR外顯子突變大量研究資料表明EGFR基因突變主要集中在酪氨酸激酶區(qū)(tyrosine kinase coding domain，18-2l外顯子)，其中19外顯子多為框內缺失(746-753)性突變，約占所有突變的45；21外顯子多為替代突變(主要是L858R)，約占所有突變的40。目前普遍認為，這兩個熱點突變可以增強腫瘤細胞對TKI的敏感性，并且可作為TKI治療的有效預測指標。因此，檢測EGFR基因突變對于指導NSCLC病人臨床用藥具有重要的參考價值。EGFR突變位點第18外顯子

11、核苷酸2155G A突變第19外顯子如核苷酸2235-2249Del、核苷酸2254-2277Del、核苷酸2236-2250Del、核苷酸2240-2257Del等共19個突變。第20外顯子核苷酸2369CT 第21外顯子核苷酸2576TGEGFR的突變類型Nature Reviews Cancer 2007;7:169-181EGFR基因突變頻率分布Cheng L, et al. Mod Pathol. 2012; 25(3): 347-69.耐 藥敏 感EGFR基因突變突變率在33%左右，其中腺癌高達48%。東方亞裔明顯高于高加索人種、女性高于男性、非吸煙高于吸煙EGFR19、21外顯子

12、的突變占95%左右EGFR 變異使EGFR 酪氨酸激酶ATP結合位點的某些關鍵基團發(fā)生重構, 使得小分子酪氨酸激酶抑制劑更易與之結合，增強了與ATP競爭性抑制劑的相互作用。EGFR突變在蛋白上的位置細胞外結構域配體結合區(qū)跨膜結構域細胞內結構域TK結構域磷酸化外顯子20 T790M點突變ATP結合區(qū)外顯子19缺失突變外顯子21 L858R點突變EGFR突變檢測適用范圍 非小細胞肺癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤、轉移性腎癌患者，篩選EGFR突變患者，適用抗EGFR的靶向藥物易瑞沙（Iressa，Gefitinib，吉非替尼片)、它賽瓦（Tarceva，特羅凱）、達沙替尼（dasatinib）。結果判讀 E

13、GFR變異或缺失患者對這些藥物有效；無突變者預后不良。K-RAS突變檢測 RAS基因是人體腫瘤中常見的致癌基因。RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS組成，基因家族的各成員相互間同源性可達85%。RAS基因編碼的蛋白質是P21蛋白，分子量為21KD，由188-189個氨基酸組成。P21蛋白位于細胞膜的內表面，具有GTP酶活性，參于傳導細胞增殖信號的調控系統(tǒng)。其激活狀態(tài)為GTP結合狀態(tài)，失活狀態(tài)為GDP結合狀態(tài)，其轉變?yōu)榛顒有灾掳┗虻闹饕课皇堑?2、13 和61 密碼子的突變， 其中以第12 密碼子點突變最常見。該基因的體細胞突變常見于多種惡性腫瘤，在肺癌患者中的突變率為15-30%

14、，在結直腸癌患者中為20-50% 。K-RAS突變檢測KRAS蛋白是EGFR信號傳導通路中的一個關鍵的下游調節(jié)因子。在研究EGFR突變與吉非替尼治療進展期NSCLC患者的療效間的關系的過程中也發(fā)現(xiàn)了KRAS基因點突變，而且研究表明，KRAS基因突變與NSCLC對吉非替尼、厄羅替尼等靶向治療藥物的原發(fā)性耐藥有關。最近的研究還發(fā)現(xiàn)這KRAS基因的突變使結直腸癌患者對西妥昔單抗的治療產(chǎn)生耐藥性。因此檢測KRAS基因的突變可作為EGFR靶向治療耐藥性產(chǎn)生的重要預測指標。 K-RAS突變檢測NCCN 2011年臨床指南中明確指出：KRAS基因是人體腫瘤中常見的致癌基因。該基因突變常見于多種惡性腫瘤，NC

15、CN還指出KRAS基因突變會使肺癌患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥；使結直腸癌患者對抗EGFR抗體類藥物產(chǎn)生耐藥。所以NCCN提出腫瘤患者接受EGFR靶向藥物治療之前，必須進行KRAS基因突變檢測，根據(jù)檢測結果決定是否使用EGFR靶向藥物作為臨床治療措施。因此KRAS基因突變檢測能提高腫瘤臨床治療的針對性，降低治療費用，節(jié)省寶貴的治療時間。 K-RAS突變檢測適用范圍 結腸癌、胃癌、頭頸癌、非小細胞肺癌患者，用于愛必妥或帕尼單抗等靶向藥物的適用人群篩選。結果判讀 臨床上靶向新藥愛必妥（Erbitux，西妥昔單抗）和帕尼單抗（Panitumumab）僅適用于無突變的K-RAS基因野生型患者

16、，對K-RAS突變患者無效。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（NCCN）將K-RAS檢測列為結腸癌臨床治療指南。K-RAS突變檢測突變位點KRAS突變是晚期NSCLC小分子TKI-抑制劑不能獲益的預測因子KRAS突變是早期NSCLC輔助化療不能獲益的預測因子關于KRAS的共識EML4-ALK融合基因檢測 EML4-ALK融合基因為間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因和棘皮動物微管相關蛋白樣4（echinoderm microtubule associated protein like4,EML4）基因融合而成的具有致瘤性的變異基因。ALK基因具有促進細胞增殖

17、作用，EML4基因可維持細胞結構形態(tài)。EML4-ALK融合基因由第2號染色體短臂插入引起，肺癌中有9種EML4-ALK變異體存在，這些融合基因的ALK部分均為20號外顯子編碼細胞內酪氨酸激酶結構基因片段，而EML4部分包括不同外顯子的片段基因。 在6%-7%非小細胞肺癌中已確定了幾種EML4-ALK 融合變異體，并證明其具有功能活性。 轉化需要ALK酪氨酸激酶的活性。 證據(jù)表明ALK抑制劑可致體內腫瘤縮小，提示癌基因依賴，可以作為潛在的靶點。ALKALKALKALKALKALKALKALKALKALKEML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4TFGKIF5B卷曲螺旋結構域

18、酪氨酸激酶結構域E13;A20E6;A20E20;A20E14;A20E18;A20E15;A20E2;A20KIF5B-ALKE17;A20TFG-ALKEML4-ALKEur J Cancer 2010; 46:1773-1780EML4-ALK融合基因ALK陽性NSCLC患者的預后更差ALK 陽性 vs ALK 陰性J Thorac Oncol. 2012;7: 9097Years since diagnosisPFS/RFS曲線FISH(positive) versus FISH(negative)Years since diagnosisPFS/RFS曲線IHC3(positive)

19、 versus IHC0/1 (negative)ALK 陽性 vs EGFR突變 vs NSCLCALK陽性EGFR突變驅動基因ALK融合基因EGFR突變臨床&病理特征年輕、腺癌（粘液型）、不吸煙東亞裔、腺癌（非粘液型）、不吸煙患者預后差好治療方法克唑替尼EGFR-TKIsALK陽性肺癌的臨床特征 通常情況下，EML4-ALK 融合與EGFR 突變或KRAS 突變相互排斥，但也有報告發(fā)現(xiàn)EML4-ALK 融合與這些突變共存的病例1-3 盡管組織/吸煙史與ALK狀態(tài)之間存在相關性，但是任何非小細胞肺癌患者都有可能具有ALK陽性在高齡具有吸煙史的患者中（ 76歲）發(fā)現(xiàn) 了EML4-ALK 融合

20、1僅憑臨床特征可能無法發(fā)現(xiàn)所有患者，因此仍然需要進行分子檢測以確定ALK 狀態(tài)1. Rodig et al., Clin Cancer Res. 2009;15:5216-52232. Shaw et al., J Clin Oncol. 2009; 27:4247-42533. Zhang et al. Molecular Cancer 2010, 9:Article #188中國ALK陽性非小細胞肺癌診斷專家共識（2013版）ALK陽性非小細胞肺癌的共識：ALK陽性非小細胞肺癌是指包括ALK FISH檢測、或ALK序列融合變異、或ALK融合蛋白IHC特定方法檢測陽性的肺癌，是非小細胞肺癌的

21、一個分子亞型，常見于腺癌，該類患者通?？蓮腁LK抑制劑治療中獲益。目前常用的ALK基因變異或融合蛋白檢測方法分為以下三種：熒光原位雜交（FISH）技術、免疫組織化學（IHC）和基于PCR的方法（包括qRT-PCR、RACE-PCR或特異性RT-PCR聯(lián)合測序技術）。FISH檢測ALK判讀兩種探針分別標記ALK基因的兩端，300kb的3端和442kb的5端分別標記為橘紅色和綠色。在無ALK融合基因表達的腫瘤細胞中，橘紅色和綠色重疊為黃色或者相互粘合（兩個信號之間的間隔小于兩個信號的直徑）；而在存在ALK融合基因表達的腫瘤細胞中，橘紅色和綠色信號相互分離（間隔2個信號直徑）。標本FISH陽性結果的

22、判定標準為單個視野中的50個肺癌細胞中至少有25個存在分離信號，或者兩個不同視野中的100個肺癌細胞中至少有15個存在分離信號。適用的組織樣本要求：10中性福爾馬林固定后石蠟包埋標本（FFPE樣本），防脫玻片切片厚度35m。B-RAF突變檢測 B-raf是癌基因，編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路重要的轉導因子，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf基因突變。約66%惡性黑色素瘤和15的結腸癌中B-raf基因存在體細胞錯義突變。大約80-90%的B-raf基因突變發(fā)生在exon15的17

23、99核苷酸上，T突變?yōu)锳，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。目前認為，V600E突變可模擬T599和S602兩個位點的磷酸化過程，從而使B-raf蛋白異常激活。B-raf突變狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及臨床結局有關。隨著B-raf突變研究的深入，可望為闡明腫瘤發(fā)生的分子機制，尋找新的治療途徑與靶點提供思路。B-RAF突變檢測適用范圍 甲狀腺癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、結直腸癌等 結果判讀 B-RAF基因突變的患者接受EGFR-TKI藥物治療的有效率低； B-raf V600E突變可導致部分K-RAS基因野生型患者對EGFR-TKI及EGFR單抗藥物治療不敏感。PI3K突變檢測 磷脂酰

24、肌醇-3激酶（PI3K）是催化肌醇基團磷酸化的激酶，由催化亞基和調節(jié)亞基組成的異二聚體；根據(jù)其底物結構不同分I、II和III型。PI3K是EGFR下游信號分子，可被生長因子受體酪氨酸激酶（如EGFR）激活，使絲/蘇氨酸激酶（AKT）磷酸化而上調該通路的活性并產(chǎn)生多種生物學效應，包括調節(jié)細胞增殖、存活和細胞周期調控等。PI3K突變檢測PI3K是由調節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的異源二聚體。PIK3CA編碼PI3K的p110催化亞基，它是目前PI3K家族成員中發(fā)現(xiàn)的唯一一個可以發(fā)生體細胞突變而致癌的基因。大量數(shù)據(jù)表明PIK3CA中存在兩個熱點突變區(qū)：一個是位于9號外顯子的E542K和E545

25、K突變，另一個是位于20號外顯子的H1047R突變；這兩個突變熱點都能增強PI3K的脂質激酶活性。PI3K突變檢測已發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中(如乳腺癌、非小細胞肺癌等)存在PI3K基因突變，PI3K基因突變導致PI3K/Akt信號通路持續(xù)性活化。PI3K作為EGFR下游信號分子被激活，導致腫瘤細胞對EGFR-TKI等藥物的耐藥。所以，檢測PI3K基因突變可以預測腫瘤患者對EGFR-TKI等藥物的耐藥性。PI3K突變檢測赫賽汀(Herceptin) 是一種抗HER2單克隆抗體，可選擇性作用于人類表皮生長因子受體2（HER2），從而干擾癌細胞的生物學進程，抑制癌細胞的增生。研究發(fā)現(xiàn)赫賽汀對PIK3CA基因

26、突變人群的療效欠佳。PIK3CA基因突變檢測可為乳腺癌和肺腺癌患者的合理用藥提供參考依據(jù)。 PI3K突變檢測適用范圍 乳腺癌、非小細胞肺癌結果判讀 PIK3CA基因突變人群赫賽汀治療效果欠佳ROS1 基因突變全稱 c-ros 原癌基因，一種跨膜的受體酪氨酸激酶基因。在成人腎臟、小腦、外周神經(jīng)、胃、小腸、結腸細胞 ROS1 蛋白高表達狀態(tài)。在正常的人肺組織中，還沒有發(fā)現(xiàn) ROS1 蛋白表達。ROS1 染色體的重排可以激活 ROS1 激酶活性。非小細胞肺癌 (NSCLC) 、膽管癌、胃癌及卵巢癌等中存在 ROS1 的染色體重排。ROS1 重排的 NSCLC 患者的臨床特征在研究中也被總結歸納，其主

27、要特征是患者相對比較年輕、無吸煙史、以肺腺癌為主。研究顯示 ROS1 融合基因是 NSCLC 的致癌基因之一，而克唑替尼可以顯著抑制 ROS1 的磷酸化水平，且這種抑制顯現(xiàn)出濃度梯度依賴性現(xiàn)象。所有的ROS1融合陽性腫瘤缺乏EGFR、 K-RAS、HER-2、ALK和RET基因改變 NEnglJMed.2014,371:1963-71 目前發(fā)現(xiàn)2種ROS1基因融合(SLC34A2-ROS1和CD74-ROS1)。 SLC34A2-ROS1融合基因存在2種變異體，均表達為一種具有兩個跨膜結構域的蛋白。CD74-ROS1基因融合為在非吸煙的女性腺癌患者中發(fā)現(xiàn)， 在成纖維細胞以及NSCLC細胞系中驗

28、證了CD74-ROS1融合基因的致癌能力：CD74-ROS1融合基因的異位表達能夠在體外誘導高侵襲性，并且在體內誘導轉移的形成。最近發(fā)現(xiàn)ROS1重排在NSCLC中的頻率約為2%。ROS1基因融合患者的臨床特征與ALK易位患者的臨床特征非常相似。ROS1融合陽性的腫瘤患者更傾向于吸煙較少者(10包年)或不吸煙者，且與年輕、腺癌組織學類型相關。已知的融合蛋白中保留了ROS1基因的激酶活性，且ROS1重排與其他已知的NSCLC致癌事件如KRAS突變、EGFR突變或是ALK突變并不重疊。NSCLC:14種ROS1基因融合類型Demographics and Clinical Characteristi

29、cs of Patients With ROS1-Positive NSCLCAll PatientsROS1 PositiveROS1 Negative (n = 1,073)(n = 18)(n = 1,055)Demographic or Clinical CharacteristicNo. %No. %No. %P (ROS1 positive v ROS1 negative)Age, yearsMedian6249.862.3.001Range32-8732-7932-87SexMale52349739516490.48Female55051116153951Smoking hist

30、oryNever-smoker23922147822521.001Light smoker62616616Smoker6956521169366NA77716767PathologyAdenocarcinoma6946518100676640.019Squamous200190020019NSCLC, NOS59500596Adenosquamous10100101Other38400384NA72700727 Abbreviations: NA, not available; NOS, not otherwise specified; NS, not significant; NSCLC,

31、nonsmall-cell lung cancerROS1 基因融合主要發(fā)生于年輕、非吸煙、腺癌患者J Clin Oncol. 2012; 30:86370ROS1基因融合臨床病理學特性細胞學證據(jù) crizotinib可以有效抑制ROS1 基因融合細胞系活性Bergethon K et al. J Clin Oncol. 2012; 30:86370病人療效證據(jù)支氣管肺泡癌患者；無EGFR 突變或ALK 變異；存在ROS1 基因融合；crizotinib標準劑量治療； 一周內，癥狀顯著改善；八周評估接近完全緩解； 治療六個月時，繼續(xù)治療，無復發(fā)證據(jù)；crizotinib治療前crizotini

32、b治療12周J Clin Oncol. 2012; 30:86370RET基因突變 RET蛋白由RET原癌基因編碼，是一種酪氨酸激酶識別受體，它在惡性腫瘤形成過程中起著重要作用。一些多重激酶抑制劑例如凡德他尼和索拉非尼對RET異常的惡性細胞具有重要的抑制作用。新近研究證實了KIF5B-RET融合型非小細胞肺癌（NSCLC）的存在，并提示嵌合性癌基因可成為肺癌個體化診治中新的分子靶點。國外數(shù)據(jù)分析667例肺癌中，KIF5B-RET基因融合頻率約為1.8%（12/667例），而在沒有EGFR、KRAS、HER2、ALK、ROS1變異的肺癌中，RET基因的融合頻率高達6.3%（10/159例）。Na

33、tMed2012，18(3):382HER2基因突變 Her2是人類表皮生長因子受體2基因，位于17號染色體17q11.2-21，編碼一個分子量為185kD的跨膜糖蛋白。HER-2被證實在乳腺癌、胃癌和其它腫瘤上擴增和過表達。其擴增和過表達被認為是乳腺癌最重要預后和化療標記。大約有1%肺腺癌有HER-2基因擴增。Her2受體的過度表達在細胞向腫瘤轉化和腫瘤發(fā)生中起著關鍵性作用。Her-2基因 致癌基因：Her-2基因； 位點：17q11.2-q12； 編碼蛋白：跨膜蛋白（與 表皮生長因子受體部分同源）； 約1%肺腺癌病人有HER-2的擴增； HER-2基因擴增是決定Herceptin治療是否有

34、效的關鍵性指標。信號傳導至細胞核細胞核接合部酪氨酸激酶活性部分細胞質細胞膜生長因子（配體）癌基因活化細胞分裂 HER2 受體跨膜二聚體的信號傳導途徑HER-2的水平是以阿霉素為基礎藥物化療重要而獨立的預后因子。Her2陽性在治療上的意義： 預測對含蒽環(huán)類治療方案的敏感性 預測對紫杉類治療的敏感性 預測對CMF（環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶）治療方案的耐藥目前檢測HER-2基因擴增或HER-2蛋白過度表達的方法有許多種。FISH檢測是使用傳統(tǒng)分子生物學方法檢測腫瘤組織的DNA。FISH在熒光顯微鏡下可以確認出腫瘤所在的位置，就各種檢測方法比較FISH為最好，被喻為HER-2水平檢測的金標準。

35、 HER-2 免疫組織化學+的意思是腫瘤組織在免疫組織化學染色下著色強度為2價。多數(shù)認為HER-2 +（3價）具有臨床意義，可以作為使用Herceptin治療的依據(jù)。her-2 IHC+2則必須加作FISH檢測是否真的有HER-2擴增。進而判斷是否適合使用Herceptin治療。 抑制凋亡，促進增殖；增加腫瘤細胞的侵襲力；促進腫瘤血管新生和淋巴管新生。研究表明：30以上的人類腫瘤中存在HER2基因的擴增/過度表達（如乳腺癌、肺腺癌、胃癌和前列腺癌等）。 HER2癌基因的致瘤機制：非小細胞肺癌基因突變檢測原則為使患者盡可能地從最有效的治療中受益，所有NSCLC，只要條件許可，都應進行EGFR突變

36、及相關下游基因的檢測，特別是肺腺癌。非小細胞肺癌靶向基因檢測策略根據(jù)針對非小細胞肺癌所開展的靶向治療EGFR、K-RAS檢測項目，結合EML4-ALK融合基因分子檢測，對擬行TKI治療的患者，可以首先檢測KRAS突變狀態(tài)，排除陽性后對KRAS陰性者進行EGFR突變檢測；若EGFR突變陽性，選擇TKI治療，陰性則繼續(xù)行EML4- ALK檢測；若EML4-ALK陽性者，可嘗試針對ALK的靶向治療。K-RAS、BRAF基因突變檢測不能應用靶向藥物EGFR檢測突變無突變突變應用靶向藥物Eml4-ALK基因檢測無突變陰性陽性靶向ALK分子治療非小細胞肺癌靶向基因檢測策略NSCLC治療已進入個體化治療時代

37、EGFR厄洛替尼 (獲批)易瑞沙 (獲批)PF299804阿法替尼 (BIBW2992)ALK克唑替尼 (獲批)LDK378AP26113AF802ROS1克唑替尼HER2PF299804阿法替尼 (BIBW2992)PGFRBGJ398FP1039 (HGS1036)Ponatinib (AP24534)GGFR/PDGFRA/VEGFRBIBF1120帕唑帕尼Lenvatinib (E7080)Brivanib (BMS-582,664)多韋替尼 (TKI258)PDGFRAMEDI575IMC-3G3PI3KBKM120PX-866GDC-0941SAR245408PI3K/MTORGD

38、C-0980BEZ235SAR245409MEKMEK162GDC-0973GSK1120212MSC1936369BSTAT3OPB51602AKTMK2206Cancer Cell 2012; 21:448.分子檢測方法分子檢測標本來源腫瘤部位的新鮮組織、活檢組織、手術切除標本和細胞學標本均可用于EGFR突變的檢測。理想的標本，需保證200400個腫瘤細胞（文獻報道大于100個即可）檢測標本冰凍組織外科手術標本：最好標本，可獲得高質量腫瘤DNA，取得可靠檢測結果-應廣泛使用穿刺活檢、支氣管鏡標本：量少，但腫瘤DNA質量仍好，獲得較可靠檢測結果-使用受限檢測標本固定包埋組織外科手術標本：可獲

39、得足量腫瘤DNA，雖然DNA片段化，但仍獲得可靠檢測結果-使用受限支氣管鏡、穿刺活檢標本：可得腫瘤DNA量少且片段化，獲得較可靠檢測結果，有時DNA量少。-極度受限淋巴結標本也可淋巴結標本中EGFR突變能否反映原發(fā)灶中EGFR狀態(tài)？外周血、癌性胸水、經(jīng)支氣管細針穿刺標本有研究也有陽性結果外周血標本：血漿中游離DNA（cfDNA）濃度變化很大（101200ng/ml）, cfDNA片段很短（180bp），可能多由凋亡產(chǎn)生，腫瘤釋放的cfDNA在總cfDNA中的含量不穩(wěn)定（3%93%）胸水可以做前景很好檢測標本肺葉切除手術標本支氣管鏡活檢標本支氣管鏡活檢標本細胞學標本腫瘤組織標本的采集及病理評估腫

40、瘤組織標本病理學評估組織切片非小細胞性肺癌診斷及類型腫瘤細胞比例腫瘤細胞總數(shù)標識腫瘤豐富的區(qū)域富集腫瘤細胞H&E 染色片用于病理評估白片用于提取DNA建議最少切片數(shù)：-手術標本，5 m X4-小活檢標本，5 m X8 組織標本來源手術標本支氣管下活檢經(jīng)皮穿刺活檢 標本處理及貯存新鮮凍存：液氮或-80CFFPE診斷：確保腫瘤組織是非小細胞性肺癌腫瘤量：確保有足夠的腫瘤組織用于突變檢測盡量保證200-400個腫瘤細胞- 對于技術成熟的實驗室，可以嘗試性進行200個腫瘤細胞的標本檢測5-10uM 10張切片能滿足突變檢測需求當細胞數(shù)較少時,可以適當增加切片數(shù),以滿足檢測需求.腫瘤比例：標識腫瘤豐富的

41、區(qū)域，提高腫瘤細胞比例用于檢測。盡量去除非腫瘤組織及細胞，提高檢測的敏感性。標本的病理評估內容標本的質量控制福爾馬林固定的標本固定要及時，離體后30min內處理固定液：10% 中性緩沖福爾馬林（終濃度4%）；固定時間：小組織6-12h，大標本6-48h.冰凍標本：組織離體后立即速凍（30min內）為保證標本質量及不延誤檢測，腫瘤標本轉送至病理科應在24h以內?；蛲蛔儥z測常用方法目前公認有兩種：測序法和ARMS法（等位基因特異PCR+熒光探針）EGFR蛋白、基因拷貝數(shù)、還是基因突變？EGFR相關的常用的生物標志物主要有三種：蛋白EGFR蛋白表達 基因基因拷貝數(shù) 基因突變免疫組化(IHC)檢測E

42、GFR 蛋白表達FISH檢測EGFR 基因拷貝數(shù)PCR 和測序法檢測EGFR 基因突變基因突變檢測概念基因突變檢測指腫瘤組織中編碼目的基因的DNA突變狀態(tài)檢測并不是：EGFR基因DNA拷貝數(shù)的檢測（FISH法）EGFR蛋白表達量的檢測（IHC法）。EGFR,KRAS及EML4-ALK檢測檢測物質部位方法基因突變DNA細胞核測序法、ARMS法等拷貝數(shù)DNA細胞核熒光原位雜交法（FISH）蛋白表達蛋白質細胞膜免疫組化法（IHC）RNA表達RNA細胞核RT-PCR標本因素對基因突變檢測的影響-腫瘤組織特點-遺傳異質性 對檢測方法敏感度有較高要求正常細胞混雜標本采集及病理評估DNA 抽提及質控檢測報告

43、基因突變檢測ARMS測序法其它方法基因突變檢測流程非小細胞肺癌驅動基因突變檢測方法 PCR+直接測序法 PCR-RFLP/AS-PCR dHPLC/HRMA 實時熒光定量PCR -TaqMan -PNA-LNA clamp -ARMS ME-PCR/ SequencingO= Transfer product /add reagent/ open tubePCR: Real-timeDetectionPCRClean-upSequencing RxnCapillary SequencingPCRPCRClean-upSequencing RxnCapillarySequencing PCRHe

44、tero-duplexCapillaryElectro-phoresisARMS & PNA-LNA clampPCR/ SequencingNested PCR/ SequencingPCR/HRMA/dHPLC PCR/RFLPPCRRFLPElectro-phoresisSizing PCRPCRClean-upSequencing RxnCapillarySequencing RFLPOOOOOOOOOOOOTaqMan Clean-upOClean-upOClean-upOOOOPCRSURVEYORcleavagedHPLCSizing OConfirmation by seque

45、ncing PCR/SURVEYORPCRClean-upPyro-sequencing RxnPyro SequencingOO123456Steps7突變檢測的各種方法：流程與敏感度Confirmation by sequencing OConfirmation by sequencing OOO1%10%3-10%10%3-12%2030%2030% 25mg25mg4-5塊2-3針2-4片50ml檢測方法推薦新鮮組織測序或ARMS測序或ARMSARMSARMSARMSARMS固定包埋ARMSARMSARMSARMSARMSARMS約15%的肺癌患者初診時即發(fā)現(xiàn)胸水，約50%的患者在疾病

46、進展過程中會出現(xiàn)胸水。約80%的胸水標本中可鏡檢到腫瘤細胞。EGFR突變檢測至少需要200-400個腫瘤細胞H. Kimura et al., British Journal of Cancer 2006 (95) 1390-1395H. Kimura et al., Cancer Sci. 2006 (97) 7: 642-648P. Cavalli et al., Lung Cancer 2006 (54) 265-266Data on file國際肺癌協(xié)會專家共識EGFR 18 基因外顯子核苷酸序列檢測圖譜EGFR 基因19外顯子核苷酸序列檢測圖譜EGFR 基因20外顯子核苷酸序列檢測圖

47、譜EGFR 基因21外顯子核苷酸序列檢測圖譜基因拷貝數(shù)和染色體異位檢測常用方法主要方法：熒光原位雜交試劑（FISH）用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位熒光標記探針探針變性樣本DNA變性雜交FISH原理優(yōu)點：1）快速；2）信號強；3）特異性高；4）多色缺點：費用高、操作復雜，需要昂貴的設備、試劑與耗材，操作人員要經(jīng)過嚴格的相關技術培訓熒光原位雜交（FISH）特點FISH檢測標本要求新鮮活檢或手術切除標本

48、；石蠟包埋組織或石蠟切片（35um）；腫瘤穿刺活檢組織或細胞涂片；骨髓穿刺組織盡量送涂片，不用活檢組織（脫鈣需要使用鹽酸，破壞DNA）；腫瘤細胞陽性的胸腹水涂片；一般在3個工作日后可以發(fā)出檢測報告肺癌化療相關基因表達檢測藥物基因組學(pharmacogcnomics)是從基因水平研究基因序列的多態(tài)性與藥物效應多樣性之間的關系，研究基因本身及其突變體對不同個體藥物作用效應差異的影響，以此為平臺指導合理用藥，提高用藥的安全性和有效性，避免不良反應，減少藥物治療的費用和風險。通過對患者的基因位點進行檢測，能進一步確定對特定藥物具有很強敏感性或抵抗性的患病人群，從而指導臨床開出適合不同個體的處方，使患

49、者既能獲得最佳治療效果，又能避免藥物的不良反應，達到個體化用藥的目的。ERCC1 檢測ERCC1：臨床研究已證實ERCC1參與鉑類化療耐藥發(fā)生，其表達水平與多種癌癥鉑類化療療效和生存期呈負相關，即表達水平低的患者對鉑類藥物敏感，反之表達水平高的患者表現(xiàn)耐藥。因此，在最近發(fā)布的美國國家癌癥綜合治療聯(lián)盟（NCCN）非小細胞肺癌的臨床治療指南（第二版，2009）中明確指出：在接受鉑類化療前進行ERCC1 mRNA表達水平檢測可提高治療有效率和患者生存率。關于ERCC1的共識NSCLC預測因子1.完全性切除術后的NSCLC患者，如果ERCC1陰性，能從輔助化療中獲益，而ERCC1陽性者則不能獲益。2.

50、ERCC1陽性表達可作為鉑類耐藥的預測因子3.BRCA1過度表達可作為鉑類耐藥的預測因子目前還不足以推薦檢測ERCC1和BRCA1作為NSCLC的治療依據(jù)RRM1 檢測1：是核苷酸還原酶的亞結構，核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸是 合成的重要步驟。基礎研究顯示是核苷酸還原酶中惟一影響吉西他濱療效的成分。研究發(fā)現(xiàn)的表達水平與 對吉西他濱化療的敏感性呈負相關， 低水平表達的患者對化療的反應較好，中位生存時間為13.7 個月，而高水平表達的患者中位生存時間僅3.6 個月。現(xiàn)有的研究資料表明檢測 基因的表達水平，可以預測 患者對吉西他濱的療效，因而 是判斷是否選用吉西他濱化療的分子標志物。BRCA1：大

51、量臨床研究已經(jīng)證實：鉑類藥物的療效與腫瘤組織中BRCA1基因mRNA表達水平密切相關，即BRCA1基因表達水平低的患者對鉑類藥物敏感，反之表達水平高的患者表現(xiàn)耐藥。反之抗微管藥物（紫杉醇、多西紫杉醇、長春堿、長春新堿和長春瑞濱等）的療效與腫瘤組織中BRCA1基因的mRNA表達水平正好相反，即BRCA1基因表達水平高的患者對抗微管類藥物敏感，反之表達水平低的患者表現(xiàn)耐藥。 BRCA1 檢測RRM1 是決定早期NSCLC術后生存的決定因子RRM1過度表達可作為吉西他賓耐藥的預測因子目前還不足以推薦檢測RRM1作為NSCLC的治療依據(jù)關于RRM1的共識抗有絲分裂藥物是化療藥物的重要組成部分，根據(jù)與微

52、管的結合部位不同可分為三類：紫杉烷類（如紫杉醇、紫杉萜）；長春堿類（如長春新堿、長春瑞濱）以及秋水仙素類。紫杉醇通過與微管蛋白結合，形成穩(wěn)定的微管束，抑制真核細胞的有絲分裂。它使腫瘤細胞停止在G2 期和M期,抑制細胞復制,阻止癌細胞增殖。細胞的微管蛋白分，兩個亞型，是細胞骨架的重要組成部分，是有絲分裂時紡錘體的 組成的單位，也是抗微管蛋白的主要作用靶點。-微管蛋白基因（tubulin beta-3 chain，TUBB3基因）編碼的3型微管蛋白與抗微管與抗微管化療藥敏感性的關系最密切。在多種腫瘤細胞系的研究和臨床研究中，都顯示TUBB3 mRNA 表達水平與抗微管類化療的療效密切相關。TUBB

53、3 檢測TUBB3陽性表達可能是抗微管類藥物敏感的預測因子目前還不足以推薦檢測TUBB3作為NSCLC的治療依據(jù)關于TUBB3的共識胸苷酸合成酶（Thymidylate Synthetase，TYMS）是DNA合成的關鍵酶，在DNA合成與修復中起重要作用,是葉酸代謝循環(huán)中起中心作用的酶類之一，也是以5-氟尿嘧啶(5-FU)為基礎化療的靶酶。5-Fu在體內須轉化為相應的核苷酸類似物才能發(fā)揮細胞毒作用，其主要機制為轉化為一磷酸氟代脫氧尿苷(FdUMP)，后者與TYMS、5,10-亞甲基四氫葉酸形成三聯(lián)復合物，并抑制TYMS，阻礙dTMP的從頭合成；并且以FdUTP或FUTP的形式摻入到DNA或RNA分子中,破壞其結構和功能。臨床研究表明，在包括直腸癌、肺癌、乳腺癌、頭頸鱗狀細胞癌等多種腫瘤患者中，TYMS 基因低表達水平的患者接受氟類化療的效果較好。檢測腫瘤患者中TYMS的基因表達水平可以預測氟類藥物的療效。TYMS 檢測依托泊苷（etoposide）為細胞周期特異性抗腫瘤藥物，是DNA拓撲酶（Topo）抑制劑。其抗癌機制是作用于DNA拓撲異構酶，形成藥物-酶-DNA穩(wěn)定