ALK靶點(diǎn)檢測講課教案課件

1、ALK靶點(diǎn)及其檢測方法輝瑞腫瘤 賽可瑞余林1994年ALK基因異常首次在淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)ALK基因異常首次在間變性大細(xì)胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn) (ALCL), 并因此而得名“ALK” （anaplastic lymphoma kinase）間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶ALK融合到核磷蛋白（NPM）的N-末端部分 (NPM-ALK)導(dǎo)致ALK基因組成性激活。Science 1994;263:12814Blood 1997;89:167885Permanent proliferation & inhibition of apotosisEML4-ALK fusion proteinsilenced bycrizo

2、tinibProliferation & survivalupon ligand bindingto ALKALK融合突變在蛋白水平的變化配體ALK受體細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)正常ALK 信號細(xì)胞外永久擴(kuò)增和凋亡抑制細(xì)胞外克唑替尼抑制EML4-ALK 融合蛋白病理性ALK信號克唑替尼作用模式 配體與ALK結(jié)合后，擴(kuò)增和存活由于與EML4融合，ALK激酶區(qū)異常激活多效蛋白?肝素結(jié)合細(xì)胞因子?隨著ALK靶向抑制劑的發(fā)現(xiàn)，ALK基因越來越多的受到重視2007, Soda & Mano首次發(fā)現(xiàn)EML4-ALK基因2009, Alice T. Shaw首次出現(xiàn)EML4-ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的稱謂，并將其定義為NS

3、CLC的獨(dú)特亞型2010, Kwak EL:證實(shí)克唑替尼治療有效，但仍沿用EML4-ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的稱謂Soda M, et al. Nature 2007; 448(7153):561-566.Shaw AT, et al. J Clin Oncol 2009; 27:4247-4253.Kwak EL, et al. N Engl J Med 2010; 363:1693-1703.NSCLC臨床病理分型的演變AdenocarcinomaSquamous-cell carcinomaLarge cell carcinoma組織分型 Current Standard of NSCLC

4、 CareNon-squamousNSCLC 分型現(xiàn)狀SquamousEGFR WTEGFR MuSquamousEGFR MuKRAS MuALK+Other non-squamous WTSquamous2012NCCN2014NCCNEGFR MuALK+KRAS MuOther non-squamous WTSquamousROS1+2010NCCNNCCN Guidelines, NSCLC, Version 4. 2014Horn L, et al. Clin Oncol. 2009驅(qū)動(dòng)基因分型 早期NSCLC分子分型與治療決策密切相關(guān)HER2EGFR mutantsALKROS/

5、RETb-rafK-rasChemotherapy and PCIAdenoLCC/NOSSCCSCLCK-rasALK陽性非小細(xì)胞肺癌有哪些特點(diǎn)？ALK陽性NSCLC具有鮮明的臨床及病理特征特征EGFR突變EML4/ALK組織學(xué)腺癌 TTF1+腺癌TTF1+亞型非粘液型粘液型吸煙狀態(tài)不吸煙不吸煙人種東亞所有人種發(fā)病年齡66歲52歲性別女性無差異Shaw AT, et al. J Clin Oncol 2009; 27:4247-4253.85.4%的ALK陽性NSCLC年齡65歲(PROFILE1007)與EGFR突變?nèi)巳合啾?，ALK融合人群年齡更輕ALK陽性患者的中位年齡比EGFR陽性患者

6、中位年齡小15歲低年齡組ALK陽性率高于EGFR在低于51歲的人群中，ALK陽性率高于EGFR陽性率，可達(dá)18.5%，所以對于年輕患者來說，在標(biāo)本限制的情況下建議先檢測ALK靶點(diǎn)。Scientific Reports; Li Zhang,2014中國ALK突變的發(fā)生率有多高？AuthorALK incidencePublicationsZhang X, Wu YL et al.11.6% (12/103)Mol Cancer 2009Wong, et al. (Hongkong)4.9% (13/265)Cancer 2009Li H, Chen HQ, et al.3.0% (7/230 s

7、mokers, AC)Lung Cancer 2012Sun Y, Chen H, Ji H, et al. 5.8% (3/52 surgical AC, non-smokers)JCO 2010Wu SG, Yang PC, et al. (Taiwan)34% (39/116, AC, WT EGFR)JTO 2012Rikova K, et al4.7% (6/137)Cell 2007Wang Z, Wang J, et al.9.7% (11/113, Stage IV )Oncology 2012Ren S, Zhou C, et al.9.6% (10/104, Female,

8、 AC, non-smoker)Cell Biochem Biophys. 2012; Cancer 2012早期患者（手術(shù)標(biāo)本）ALK陽性率4.5%，晚期患者ALK陽性率8%-10%，胸水標(biāo)本的ALK陽性率可達(dá)11%。不同人種中克唑替尼的療效的差異ID患者數(shù)ORR(%)PFS（月）所有亞裔(%)所有非亞裔亞裔中國所有非亞裔亞裔中國PROFILE100114941(28)60.854.876.9-9.7-PROFILE100525993(36)59.8547073.98.1-PROFILE1007347157(45)65-74.7757.77.18.1-PROFILE1014343157(46

9、)747270-10.9-13.6-Fei-Yu Niu, Yi-Long Wu. Onco Targets and Therapy 2 May 2015 亞裔或者中國患者，ORR維持在70%以上；克唑替尼一線治療亞裔患者，中位PFS達(dá)到13.6個(gè)月什么樣的人群需要進(jìn)行ALK檢測？更新內(nèi)容2011版2015版對臨床實(shí)踐影響診斷病理報(bào)告內(nèi)容未提及分子病理診斷結(jié)果診斷內(nèi)容包括腫瘤部位、組織學(xué)亞型、累及范圍（支氣管、胸膜、脈管、神經(jīng)、伴隨病變類型、肺內(nèi)播散灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）、切緣及必要的特殊染色、免疫組化結(jié)果或分子檢測結(jié)果。包含的信息應(yīng)滿足臨床分期的需要，并給出pTNM分期。規(guī)范診斷：標(biāo)準(zhǔn)NSC

10、LC診斷需盡可能注明EGFR & ALK基因狀態(tài)（如：右肺上葉腺癌T3N2M1（骨）-IV期 ALK融合基因陽性）NSCLC驅(qū)動(dòng)基因檢測未推薦EGFR & ALK檢測對于晚期NSCLC、腺癌或者含腺癌成分的其他類型肺癌，應(yīng)在診斷的同時(shí)常規(guī)進(jìn)行表皮生長因子（EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突變檢測，檢測前應(yīng)有送檢標(biāo)本的質(zhì)控（包括亞型確認(rèn)及樣本量確認(rèn)）。檢測標(biāo)本類型包括活檢組織、細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和細(xì)胞蠟快，檢測方法推薦使用獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的檢測方法或試劑。常規(guī)檢測：晚期NSCLC診斷同時(shí)，需常規(guī)檢測EGFR & ALK基因狀態(tài)（特殊情況除外）非小細(xì)胞肺癌靶向個(gè)體化診療策略更新

11、要點(diǎn)P71P69腺癌/大細(xì)胞癌/NOS應(yīng)該進(jìn)行EGFR及ALK檢測少吸煙/小活檢肺鱗癌，不能排除混合性成分，需要進(jìn)行EGFR/ALK檢測為了識別出已經(jīng)有有效藥物治療的罕見驅(qū)動(dòng)基因靶點(diǎn)，NCC指南強(qiáng)烈推薦對腫瘤病人進(jìn)行更廣譜的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因檢測，或?yàn)椴∪送扑]可獲得的臨床研究。廣譜的驅(qū)動(dòng)基因篩查是改善NSCLC預(yù)后的關(guān)鍵Version 4.2016強(qiáng)調(diào)分子檢測的重要性如何檢測ALK融合突變？CFDA獲批的三種診斷方法ALK break-apart FISH assay(Abbott Molecular, Vysis probes)ALK immunohistochemistry(Roche Vent

12、ana)SplitIsolated redAmoy Dx EML4-ALK融合基因檢測試劑盒RT-PCR（廈門艾德）熒光原位雜交（FISH）5ALKEML43陽性（分離 倒位）2p23-215ALKEML43倒位（70）基因融合陰性兩個(gè)信號之間的距離小于2個(gè)信號直徑 12 Mb本圖由Lukas Bubendorf提供實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄法（RT-PCR）原理20逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV）催化合成cDNA第一條鏈加入PCR成分用Takara Ex TaqTM HS合成cDNA第二條鏈擴(kuò)增cDNART- PCR試劑盒的原理EML4ALK上游引物下游引物融合點(diǎn)檢測探針Ventana IHC 試劑設(shè)計(jì)ALK融合蛋白:無

13、ALK重排的NSCLC不表達(dá)ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表達(dá)較低Ventana IHC的原理:使用具有高度敏感性和特異性的一抗D5F3全自動(dòng)儀操作，充分保證特異性獨(dú)有Optiview擴(kuò)增技術(shù)，充分保證敏感性D5F3 rabbitt monoclonal antibodyOptiview DAB IHC DetectionOptiview Amplification Kit01+2+3+NegPosPosPosCST-IHCVentana-IHCPosVentana-IHC原理：在常規(guī)IHC之后加入擴(kuò)增信號，并且通過充分洗滌一抗避免假陽性-創(chuàng)建一個(gè)“二元”的判讀系統(tǒng)J.Ying,et al.

14、 Annals of Oncology 2013;Ventana IHC與FISH檢測結(jié)果比較FISH總數(shù)敏感性特異性一致率陽性陰性Ventana IHC(1)陽性46753100%98.20%98.40%陰性0377377Ventana IHC(2)陽性3103194%100%99.10%陰性2198200Ventana IHC(2)陽性32032100%100%100%陰性0217217Ventana IHC(3)陽性4024291%96%94%陰性45357Ventana IHC(4)陽性1801890%100%99.60%陰性2503505Ventana IHC(5)陽性6326510

15、0%98.4%98.9%陰性0131131(1)Jinghui Wang,et al. PLoS ONE 2014 9(7): e101551(2) Eugen C. Minca,et al. J Mol Diagn 2013, 15: 341-346(3) Murry W. Wynes,et al. J Thorac Oncol. 2014;9: 631638(4) Greta,et al. Arch Pathol Lab Med. doi: 10.5858/arpa.2013-0388-OA（5）J.Ying;et al. Annals of oncology.2013,24:2589-2593全自動(dòng)Ventana IHC優(yōu)勢一判讀標(biāo)準(zhǔn)簡單，僅存在陰性 or 陽性的判讀IHC 陽性 = FISH 陽性全自動(dòng)Ventana IHC優(yōu)勢二全自動(dòng)檢測，避免操作流程中的誤差，可重復(fù)性好全自動(dòng)Ventana IHC優(yōu)勢三價(jià)格便宜，可同時(shí)用于ALK的篩選和診斷EMEA（