荷斯坦奶牛隱性遺傳疾病檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用

1、荷斯坦奶牛隱性遺傳疾病檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用報(bào)告人：張瀅寅作者： 王成導(dǎo)師：張淑君教授華中農(nóng)業(yè)大學(xué)13背景2材料和方法結(jié)果4討論一、背景隱形遺傳疾?。?有害基因傳代 繁殖、生長(zhǎng)及經(jīng)濟(jì)性狀缺陷 人工授精、胚胎移植等現(xiàn)代繁殖技術(shù) 擴(kuò)大危害范圍 國(guó)內(nèi)檢測(cè)技術(shù)缺乏，國(guó)外費(fèi)用昂貴 很有必要建立一種準(zhǔn)確、快速而且成本較低的遺傳疾病鑒定方法 對(duì)奶牛群進(jìn)行檢測(cè) 淘汰有害基因?yàn)榻】档倪x育提供依據(jù)疾病DUMPSBLADCVM致病基因UMPSCD18(亞基) 基因SLC35A3堿基突變C405-T405A383-G383Exon4:G-T氨基酸轉(zhuǎn)換精氨酸-終止密碼天門冬氨酸-甘氨酸纈氨酸-苯丙氨酸功能缺失不能催化乳清

2、酸轉(zhuǎn)為尿甘酸整合素表達(dá)明顯減少或缺乏核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶不足酶切位點(diǎn)Ava酶切位點(diǎn)消失Taq酶切位點(diǎn)消失無致病分子機(jī)理：二、材料和方法材料 132份精液樣本； 417頭荷斯坦牛的血液樣本方法 提取DNA引物設(shè)計(jì) 退火溫度摸索對(duì)所有樣本進(jìn)行疾病檢測(cè)篩選出有害基因攜帶者AS-PCRCRS-PCRPCR-RFLP測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果返回Allele-specific PCR 根據(jù)單堿基突變位點(diǎn)的堿基替代情況設(shè)計(jì) PCR 引物， 其中一條引物根據(jù)突變位點(diǎn)鄰近序列設(shè)計(jì)， 人為引入錯(cuò)配堿基， 使得引物3端和單堿基突變的一種突變型在 PCR擴(kuò)增后形成一個(gè)酶切位點(diǎn)， 其PCR 產(chǎn)物可用類似 PCR-RFLP方法進(jìn)行分析。返

3、回Created Restriction Site PCR三、結(jié)果AS-PCRCRS-PCRRFLP測(cè)序擴(kuò)大樣本檢測(cè)及應(yīng)用建立應(yīng)用驗(yàn)證驗(yàn)證1、DUMPS（尿苷酸合酶缺乏癥） 擴(kuò)增條件：兩引物分開擴(kuò) Tm：63.31-4：健康個(gè)體（90bp）； 5：攜帶者（261bp/90bp）； M：Marker 1.1 AS-PCR：1.2 利用RFLP和測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證：PCR擴(kuò)增結(jié)果：目的片段為358bp CC：健康個(gè)體； CT ：DUMPS攜帶者； M：MarkerIDUMPS攜帶者測(cè)序結(jié)果 健康個(gè)體測(cè)序結(jié)果 所建技術(shù)準(zhǔn)確、可靠1.3 擴(kuò)大樣本檢測(cè)549個(gè)：（417個(gè)奶牛樣本和132個(gè)精液樣本）基因型Ge

4、notype樣本數(shù)Number基因型頻率Genotype frequency等位基因頻率Allele frequencyTCCT1000180.00090.9991CC5480.9982合計(jì)5491.02、BLAD（白細(xì)胞黏附缺陷?。U(kuò)增條件：兩引物分開擴(kuò) Tm：651-2健康個(gè)體818bp；3：攜帶者為818bp/500bp；M：Marker 2.1 AS-PCR：2.2 利用RFLP技術(shù)驗(yàn)證： PCR擴(kuò)增結(jié)果：目的片段為961bp 酶切結(jié)果：AA：健康個(gè)體；M：MarkerI2.3 擴(kuò)大樣本檢測(cè)：549個(gè)（417個(gè)奶牛樣本和132個(gè)精液樣本）無BLAD有害基因PCR擴(kuò)增結(jié)果：目的片段為22

5、5bp AA：健康個(gè)體；AB：CVM攜帶者；M：MarkerI3、CVM（脊椎畸形綜合癥）3.1 CRS-PCR:CVM攜帶者測(cè)序結(jié)果 健康個(gè)體測(cè)序結(jié)果 3.2 利用測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證： 該方法準(zhǔn)確、可靠基因型Genotype樣本數(shù)Number基因型頻率Genotype frequency等位基因頻率Allele frequencyTGGT100.0290.0150.985GG3320.971合計(jì)（Total）3421.03.3 擴(kuò)大樣本檢測(cè)：549個(gè)（417個(gè)奶牛樣本和132個(gè)精液樣本）單管AS-PCR技術(shù)四、討論準(zhǔn)確、快速、大規(guī)模應(yīng)用兩步AS-PCR技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)減少了引物設(shè)計(jì)和條件摸索的難度，更穩(wěn)定比較比較難度減低快速低成本三種隱形遺傳疾病在公牛群攜帶情況表DUMPS美國(guó)198419902%0.2%-2.5%BLAD美國(guó)1992199914.1%9.6%波蘭1995-19971998-19992000-20012002-20032004-20067.9%4.0%2.1%1.8%0.8%德國(guó)199720079.4%0.3%CVM德國(guó)200220078.3%2.3% 表