臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：第6章 概論+放免

1、第一章 概論臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)三大知識(shí)模塊醫(yī)學(xué)免疫學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)技術(shù)臨床免疫學(xué)及檢驗(yàn)?zāi)K1 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)基礎(chǔ)以“免疫應(yīng)答”為核心內(nèi)容模塊2 免疫學(xué)技術(shù)抗體的制備凝集試驗(yàn)沉淀試驗(yàn)補(bǔ)體參與的反應(yīng)標(biāo)記免疫技術(shù)固相膜免疫分析免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)流式細(xì)胞儀分析技術(shù)免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化儀器分析臨床免疫檢驗(yàn)的質(zhì)量保證模塊3 臨床免疫學(xué)及檢驗(yàn)超敏反應(yīng)性疾病自身免疫性疾病免疫增殖性疾病免疫缺陷病感染性疾病腫瘤免疫移植免疫 及其免疫檢驗(yàn)T、B 細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷 Severe Combined Immunodeficiency，SCID系統(tǒng)性紅斑狼瘡類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎自身免疫性疾病免疫檢驗(yàn)的對(duì)象免疫相關(guān)物質(zhì)：免疫活性細(xì)

2、胞、抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子等微量物質(zhì)：激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素等第六章 放射免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)= 免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)示蹤物質(zhì)標(biāo)記特異性敏感性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性類別標(biāo)記物用途熒光素FITC、RB200、PE鑭系元素螯合物 免疫組化免疫分析測(cè)定放射性核素125I、3H免疫分析測(cè)定酶HRP、AP免疫組化免疫分析測(cè)定化學(xué)發(fā)光物魯米諾、吖啶酯免疫分析測(cè)定金屬顆粒膠體金、鐵蛋白免疫組化免疫分析測(cè)定常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)放射免疫技術(shù)的發(fā)展歷史1959年由Yalow和Berson首先用于糖尿病患者血漿胰島素含量的測(cè)定開(kāi)創(chuàng)了體液超微量物質(zhì)

3、定量分析的嶄新領(lǐng)域，并為其他標(biāo)記免疫分析奠定了基礎(chǔ)1977年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)一、放射性核素常用于放射免疫技術(shù)的放射性核素 3H 類（液體閃爍計(jì)數(shù)器） 125I 類（晶體閃爍計(jì)數(shù)器/計(jì)數(shù)器）125I的特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：化學(xué)性質(zhì)活潑，易于制備標(biāo)記物射線測(cè)定簡(jiǎn)便，測(cè)量效率高半衰期60天適中缺點(diǎn)：125I取代H會(huì)改變?cè)镔|(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)易發(fā)生輻射損傷而使抗原（體）變性試劑的貨架期較短二、放射標(biāo)記物的制備（一）抗原：高純度 抗體：高純度、高親和力 高效價(jià)、高特異性（二）標(biāo)記方法：125I通過(guò)取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物中的酪氨酸或酪胺殘基苯環(huán)上的氫原子氯胺T（ch-T）法間接標(biāo)記法用于甾體類化合物、環(huán)核苷酸、前列腺素等缺乏碘

4、標(biāo)記基團(tuán)的小分子化合物的標(biāo)記（三）標(biāo)記物的純化凝膠層析法聚合物雜質(zhì)放射峰含標(biāo)記物的主放射峰游離125I 峰三、標(biāo)記物的鑒定（一）放射化學(xué)純度（二）比放射活性（三）免疫活性（一）放射化學(xué)純度標(biāo)記物中結(jié)合在被標(biāo)記物上的放射活性占該標(biāo)記物總放射活性的百分比一般要求95%標(biāo)記物脫碘程度的指標(biāo)（二）比放射活性單位質(zhì)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度，也可理解為每分子被標(biāo)記物平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目比放射活性較高可提高方法的靈敏度，但過(guò)高，將影響標(biāo)記物免疫活性（三）免疫活性標(biāo)記物與抗原或抗體反應(yīng)的能力反映標(biāo)記過(guò)程中被標(biāo)記物免疫活性受損情況少量標(biāo)記物與過(guò)量抗體反應(yīng)百分比（B/T80%）放射免疫技術(shù)放射免疫分析（RI

5、A） -競(jìng)爭(zhēng)法 -1959年 -Yalow和Berson免疫放射分析（IRMA） -非競(jìng)爭(zhēng)法 -1968年 -Miles和Hales一、放射免疫分析（RIA） （一）原理標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體（Ab）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ag*和Ag與Ab具有相同的親合力（二）實(shí)驗(yàn)方法 抗原抗體反應(yīng)分離結(jié)合與游離標(biāo)記物放射性測(cè)量及數(shù)據(jù)處理1、抗原抗體反應(yīng)平衡法 將Ag和*Ag同時(shí)與Ab反應(yīng)，達(dá)到平衡后分離*Ag-Ab和*Ag，方法穩(wěn)定，但敏感度稍差。非平衡法 先將待測(cè)Ag與Ab充分反應(yīng)，達(dá)平衡后再加入*Ag，敏感度提高，穩(wěn)定性不如平衡法。2、B/F分離理想的分離方法：分離徹底，迅速分離試劑和過(guò)程

6、不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響 操作應(yīng)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì) 聚乙二醇（PEG）沉淀法雙抗體法雙抗體-PEG法常用的分離方法：PEG沉淀法非特異性沉淀大分子蛋白質(zhì)（抗原抗體復(fù)合物）離心PEG 6000、終濃度7%-9%、pH6-9優(yōu)點(diǎn)：沉淀完全，快速、經(jīng)濟(jì)方便缺點(diǎn)：非特異結(jié)合率高，受環(huán)境因素影響較大雙抗體法以第二抗體（抗抗體）作為沉淀劑特異性結(jié)合抗原抗體復(fù)合物中的第一抗體并形成沉淀離心因第一抗體含量甚微，還需加入一定量的與一抗同源的動(dòng)物的IgG（共沉淀）優(yōu)點(diǎn)：特異性好，重復(fù)性好缺點(diǎn)：沉淀慢，成本高雙抗體-PEG法目前廣泛應(yīng)用的方法融合了雙抗體法和PEG法的優(yōu)點(diǎn)既保持了雙抗體法的特異沉淀作用，又

7、保持了PEG快速沉淀的優(yōu)點(diǎn)同時(shí)減少兩者的用量，降低成本，降低非特異性結(jié)合3、放射性測(cè)量測(cè)T、B、F-晶體閃爍計(jì)數(shù)器（計(jì)數(shù)器）晶體閃爍計(jì)數(shù)器組成：NaI閃爍晶體、光電倍增管、計(jì)數(shù)器探測(cè)原理：射線閃爍體激發(fā)退激發(fā)熒光光電子電脈沖數(shù)測(cè)量的放射性信號(hào)是儀器輸出的電脈沖數(shù)，每分鐘計(jì)數(shù)(cpm) 4、數(shù)據(jù)處理參數(shù)BB/T (%)F/T (%)B/F (%)B/B0 (%)RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的類型 （1）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、計(jì)數(shù)（cpm） 為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（2）以測(cè)定物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，B%或B/F、B/B0、cpm為 縱坐標(biāo)，曲線呈反S型； (3）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的算

8、術(shù)數(shù)（或?qū)?shù)）為橫坐標(biāo)，F(xiàn)/B（或B0/B） 為縱坐標(biāo)，呈雙曲函數(shù)；（4）以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)， logitB/B0為縱坐標(biāo)， 標(biāo)準(zhǔn)曲線為從左到右的漸降直線。二、免疫放射分析（IRMA）非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析以過(guò)量125I標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng), 用固相免疫吸附方法對(duì)B或F進(jìn)行分離 （一）原理雙位點(diǎn)IRMA（雙抗體夾心法）（二）分離技術(shù)固相吸附分離方法吸附材料：塑料（聚苯乙烯）試管此技術(shù)的重點(diǎn)不是分離，而是吸附（包被），一般采用物理吸附法特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、無(wú)離心步驟（三）數(shù)據(jù)處理免疫放射分析的劑量反應(yīng)曲線RIA和IRMA的比較RIAIRMA標(biāo)記物抗原抗體抗體用量限量過(guò)量反應(yīng)模式競(jìng)爭(zhēng)性分析非競(jìng)爭(zhēng)性分析反應(yīng)時(shí)間較慢較快分離技術(shù)PEG-雙抗體法固相吸附法測(cè)量范圍較窄較寬敏感度較低較高應(yīng)用范圍小分子半抗原大分子抗原或抗體放射免疫技術(shù)的方法學(xué)評(píng)價(jià)靈敏度高特異性強(qiáng)放射性污染和危害放射性核素半衰期短，試劑盒有效期不長(zhǎng)無(wú)法自動(dòng)化分析放射免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用激素（蛋白質(zhì)、多肽類、非多肽類）病原體抗原或抗體腫瘤標(biāo)志物藥物基本要求掌握（1）放射免疫分析的基本原理（2）免疫放射分析的基本原理（3）放射免疫技術(shù)中常用的分離方法熟悉（1）放射性核素125I作為標(biāo)記物的優(yōu)勢(shì)（2）125I標(biāo)記抗體（抗原）的制備方法和質(zhì)量評(píng)價(jià)