Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記

1、Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記【摘要】目的建立istar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Ss別離、培養(yǎng)的方法，并進(jìn)展鑒定、標(biāo)記。方法采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法別離培養(yǎng)大鼠的Ss。采用相差顯微鏡觀察Ss的形態(tài)學(xué)特征；流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代細(xì)胞外表標(biāo)志抗原D29、D44、D34和D45的表達(dá)率；電鏡檢查第3代Ss超微構(gòu)造。DAPI標(biāo)記Ss為下一步進(jìn)展體內(nèi)細(xì)胞移植示蹤。結(jié)果原代培養(yǎng)的Ss于68h后貼壁，6d左右形成集落，14d左右可到達(dá)80%90%交融。第3代細(xì)胞外表標(biāo)記物D29，D44，D34和D45的陽性率分別為98.6%，78.2%，0.0%，0.3%。超微構(gòu)造明晰，可見細(xì)胞器，如線粒體、粗面

2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)那么，可見較多微絨毛。DAPI可良好標(biāo)記Ss細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光。結(jié)論采用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法可以成功別離和培養(yǎng)大鼠的Ss，在第3代可獲得高純度Ss。DAPI可以作為一種示蹤劑標(biāo)記Ss?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞培養(yǎng)；間充質(zhì)干細(xì)胞；種子細(xì)胞；示蹤劑【Abstrat】bjetiveTestablishaethdfrislatinandulturefbnearresenhyalsteells(Ss)fristarratsinvitr,andtidentifyharateristiftheellsandtlabeltheafterultureexpansin.ethdsSs

3、ereislatedandultivatedfrthebnearrfistarratsbyadherentethd.TherphlgyfSsasbservedunderphasentrastirspe.TheexpressinfD29,D44,D34andD45fthethirdgeneratinellsereanalyzedbyflytetry.EletrnirspifeatureserealsbservedandSserelabeledbyDAPI.ResultsAfter6t8hpriaryulture,Ssadheredtplastisurfaeftheulturedish.Abut6

4、dlater,theellsprliferatedinlnies.PriarySsreahed80%90%fnfluenein14dapprxiately.ThepsitiveratesfD29,D44,D34,andD45inSsatthirdgeneratinere98.6%,78.2%,0.0%,and0.3%respetively.UndertheeletrnirspeSshadplentifulytplasithithndriarughendplasiretiulaandGlgiplexes.ThEirnulEIererundrirregularandthereereplentyfi

5、rvillinthesurfae.AllftheSsafterlabelingbyDAPIshedbluefluresenebyflurspe.nlusinsesenhyalsteellsanbesuessfullyislatedandultivatedbyadherentethd.AndhigherpuritySsanbepikedupafterultureexpansinatP3.DAPIanbeaneffetivetraeragenttlabelSs.【Keyrds】ellulture;esenhyalsteells;Seedells;Traeragent骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞esenhyal

6、steells，Ss是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，可以向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及心肌細(xì)胞分化1，2，具有高度可塑性，易于體外擴(kuò)增，因其來源充足、取材方便，體外增殖才能相對(duì)較強(qiáng)，而且在異體移植中排擠反響小，被認(rèn)為是組織工程和基因工程的理想種子細(xì)胞，為心血管疾并神經(jīng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結(jié)貼壁別離法培養(yǎng)Ss的根底上，優(yōu)化Ss純化、鑒定、標(biāo)記的方法，以獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為應(yīng)用組織工程技術(shù)提供大量的種子細(xì)胞。1材料與方法1.1動(dòng)物清潔級(jí)雄性istar大鼠(3周鼠齡,6070g)，吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。1.2主要試

7、劑和藥品1.3別離和培養(yǎng)istar大鼠麻醉后處死，浸泡酒精15in，無菌條件下別離股骨、脛骨，無血清DE沖洗骨髓腔，取混懸液，1000r/in離心10in，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DE混懸，將獲得的細(xì)胞接種在100l培養(yǎng)瓶中，5%2,37下培養(yǎng)2448h，換液，去除未貼壁細(xì)胞，23d更換一次培養(yǎng)基，光鏡觀察細(xì)胞交融情況，細(xì)胞80%交融后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞、傳代，培養(yǎng)35代細(xì)胞。1.4透射電鏡樣品制備將培養(yǎng)3代102培養(yǎng)皿中約2106個(gè)細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液PBS洗滌3次,再以3%戊二醛4固定1h,送電鏡室,脫水包埋并制作超薄切片,行透射電鏡觀察并拍照。轉(zhuǎn)貼于論文

8、聯(lián)盟.ll.1.5Ss外表標(biāo)記物檢測(cè)1.6Ss標(biāo)記將無菌的DAPI儲(chǔ)存液參加培養(yǎng)的Ss爬片上清中，至終濃度為50g/L，37孵育染色至少30in。細(xì)胞至少用Hanks平衡鹽溶液沖洗6遍以除去未結(jié)合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞爬片。2結(jié)果2.1Ss相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，約68h可見Ss細(xì)胞貼壁，呈圓形或多角形，換液后，貼壁細(xì)胞明晰可見，23d后可見少量短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點(diǎn)狀或短棒狀；6d左右可見放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起、胞核大、核仁明晰。約14d細(xì)胞交融80%90%,呈漩渦狀。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞貼壁快，24h內(nèi)已全部貼

9、壁、伸展,增殖迅速,均勻分布生長，34d可見長梭形細(xì)胞80%90%鋪滿培養(yǎng)皿形成單層。見圖1。2.3Ss的鑒定及標(biāo)記第3代細(xì)胞外表標(biāo)記物D29、D44、D34和D45的陽性率分別為98.6%、78.2%、0.0%、0.3%。見圖3。細(xì)胞經(jīng)DAPI標(biāo)記后，細(xì)胞核呈藍(lán)色。見圖4。3討論由于骨髓的細(xì)胞組成復(fù)雜，細(xì)胞功能各異，其中Ss含量很低，約為骨髓低密度組分中有核細(xì)胞的0.001%0.01%3，故別離高純度的Ss是原代培養(yǎng)關(guān)鍵性技術(shù)。目前,獲得Ss的方法主要有貼壁挑選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀別離法、免疫磁珠分選法4。而骨髓貼壁法操作步驟簡(jiǎn)單，既降低了離心對(duì)細(xì)胞的損害，又減少了污染時(shí)機(jī)，且別離

10、的Ss貼壁時(shí)間短，增殖快，細(xì)胞數(shù)量多，經(jīng)傳代后可以純化，提示全骨髓貼壁法是一種更加簡(jiǎn)單有效的Ss別離方法。一般認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞沒有特異性外表抗原，整合素家族成員D29、黏附分子D44、D166、D105等是Ss的重要標(biāo)志物5，而Ss不表達(dá)造血細(xì)胞外表抗原，如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原D34、成熟造血細(xì)胞標(biāo)志抗原D38、白細(xì)胞標(biāo)志抗原D45、淋巴細(xì)胞外表抗原D11a和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞外表抗原D14。因此，實(shí)驗(yàn)選取Ss表達(dá)陽性的指標(biāo)D29、D44，以及表達(dá)陰性的指標(biāo)D34和D45作為鑒定參考指標(biāo)2，6。本研究選擇了D29、D34、D44和D45進(jìn)展檢測(cè)，結(jié)果說明培養(yǎng)的細(xì)胞D29和D44陽性,D34和

11、D45陰性,符合Ss的特點(diǎn)，經(jīng)過傳代，第三代可獲得較高純度的Ss，可以作為穩(wěn)定的種子細(xì)胞進(jìn)展體內(nèi)研究。DAPI是一種可以與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測(cè)。DAPI對(duì)活細(xì)胞無毒性，不改變細(xì)胞器的超微構(gòu)造，熒光保持時(shí)間較長。移植細(xì)胞的標(biāo)記是研究其在體內(nèi)的定位不可缺少的，目前常用的標(biāo)記法有DAPI標(biāo)記法、溴脫氧尿嘧啶核苷BrdU標(biāo)記法、染色體標(biāo)記法、基因標(biāo)記法。BrdU法存在只能標(biāo)記增殖期細(xì)胞,且標(biāo)記細(xì)胞不能直接觀察等缺乏。染色體標(biāo)記主要將雄性供體動(dòng)物細(xì)胞移植到雌性動(dòng)物體內(nèi),通過Y染色體雜交區(qū)別確認(rèn)移植細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)在于可以終生標(biāo)記,但也存在操作繁瑣,無法觀察活細(xì)胞等缺乏。基因標(biāo)記法通過基因轉(zhuǎn)染或直接從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取材,使被標(biāo)記細(xì)胞攜帶綠色熒光蛋白GFP暼報(bào)告基因。但目前,實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因在目的細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)仍然存在程序繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長、成功率低等困難,而從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取材又因?yàn)閯?dòng)物來源困難,在國內(nèi)較少開展7。本研究說明,DAPI起初標(biāo)記率很高(