基因工程工具酶

1、基因工程工具酶第1頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是應(yīng)用于基因工程的各種酶的總稱，包括核酸序列分析、標(biāo)記探針制備、載體構(gòu)建、目的基因選取重組體DNA制備等程序中所需要的酶類。 第2頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二基因工程常用的工具酶限制性內(nèi)切酶主要用于DNA分子的特異切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特異性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸連接酶用于DNA和RNA的連接 核酸末端修飾酶用于DNA和RN

2、A的末端修飾 其它酶類-用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。第3頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶（Restriction endonuclease）第4頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途 第5頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并

3、使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的脫氧核糖核酸酶。第6頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途 第7頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二1限制與修飾系統(tǒng) 上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)類似于人體的免疫系統(tǒng)，限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)菌排除異物保護(hù)自身的防御機(jī)制：限制酶切外源DNA修飾甲基化自身的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)第8頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二 噬菌體在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)會(huì)

4、受到限制。 E.coli 菌株噬菌體感染率 KBCE.coli K110-410-4E.coli B10-4110-4E.coli C111 K 和 B 菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的 DNA 。而 C 菌株不能限制來自 K 和 B 菌株的 DNA 。 第9頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二2限制酶的發(fā)現(xiàn)Werner Arber于1962-1968年發(fā)現(xiàn)限制與修飾體系，1968年分離得到I型限制酶。1970 年，H. Smith 首次從流感嗜血桿菌 （H. influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到 Hind 限制酶。 1971年，D. Nathans用HindII繪制了

5、猿猴病毒SV40的限制酶譜。 第10頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二到1986 年下半年，發(fā)現(xiàn) 615 種限制酶和 98 種甲基化酶。到 2006 年2 月，共發(fā)現(xiàn) 4583 種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3773 種，型、型和型限制酶各有 68 、3692 、10 種。第11頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途 第12頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二限

6、制酶的生物學(xué)功能是保護(hù)宿主不受外來DNA的感染，降解外來的DNA，從而阻止其復(fù)制和整合到細(xì)胞中。與限制酶伴生的修飾酶多是甲基轉(zhuǎn)移酶或甲基化酶，能保護(hù)自身的DNA不被降解。它們與對(duì)應(yīng)的限制酶識(shí)別相同的序列，但其作用不是切割DNA，而是在兩條鏈上對(duì)某個(gè)堿基進(jìn)行甲基化。限制酶與甲基轉(zhuǎn)移酶組成限制與修飾系統(tǒng)。第13頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類和是否需要輔助因子，限制與修飾系統(tǒng)至少可分為三類。酶分子內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起三亞基雙功能酶二亞基雙功能酶識(shí)別位點(diǎn)4-6bp, 大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)二分非對(duì)稱5-7bp 非對(duì)稱切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)中

7、或靠近識(shí)別位點(diǎn)無特異性，至少在識(shí)別位點(diǎn)外 1000bp在識(shí)別位點(diǎn)下游 24-26bp限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)分開的反應(yīng)互斥同時(shí)競爭限制作用是否需用 ATPNoYesYes第14頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二在三個(gè)限制與修飾系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當(dāng)高的核苷酸識(shí)別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。 型在限制與修飾系統(tǒng)所占的比例達(dá)到 93%。 它們識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶 3- 羥基和 5- 磷酸基團(tuán)的DNA產(chǎn)物，需Mg2+的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。識(shí)別序列一般為 4-6bp ，切割位置因酶

8、而異。第15頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途 第16頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二限制性內(nèi)切酶的命名由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。Hind前三個(gè)字母來自于菌種名稱H. influenzae，“”表示菌系為型血清型；“”表示分離到的第三個(gè)限制酶EcoRIEscherichia coli RI 第17頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、定義二

9、、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途 第18頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二 1. 識(shí)別順序和酶切位點(diǎn)（1）限制酶識(shí)別序列的長度 限制性內(nèi)切酶在雙鏈DNA上能夠識(shí)別的特殊核苷酸序列被稱為識(shí)別序列。識(shí)別序列的長度一般為 48 個(gè)堿基，最常見的為 6 個(gè)堿基。 切割頻率理論上為 1/4n（n為識(shí)別序列長度），實(shí)際上與序列有關(guān)。第19頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二（2）限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu) 限制酶識(shí)別序列大多具有回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)

10、EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 有些限制酶的識(shí)別序列不對(duì)稱 AccBS C C G C T C G G C G A G 第20頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二有些限制酶可識(shí)別多種序列 有些限制酶識(shí)別的序列呈間斷對(duì)稱，對(duì)稱序列之間含有若干個(gè)任意堿基。 AlwN C A G N N N C T G G T C N N N G A C Acc G T M K A C C A K M T G 第21頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二（3）限制酶切割的位置 限制酶對(duì) DNA 的切割位置大多數(shù)在識(shí)別序列內(nèi)部，但也有在

11、外部的。 第22頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二2末端種類（1）黏性末端（cohesive end） 識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為黏性末端，這樣形成的兩個(gè)末端是相同的，也是互補(bǔ)的。 第23頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二第24頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二（2）平末端（Blunt end） 在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割 DNA 的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端。如 Hae（GGCC）和 EcoRV（GATATC）。第25頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二（3）非對(duì)稱突出端 當(dāng)識(shí)別序列為非

12、對(duì)稱序列時(shí)，切割的 DNA 產(chǎn)物的末端是不同的。 BbvCC C T C A G CG G A G T C GC C T C A G CG G A G T C G第26頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二（4）同裂酶（isoschizomer） 識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可能不同。 同序同切同序異切 同功多位 識(shí)別序列有交叉 第27頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二（5）同尾酶 許多不同的限制酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端是相同的，且是對(duì)稱的，即它們可產(chǎn)生相同的黏性突出末端，這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割 DNA 得到的產(chǎn)物可進(jìn)行黏端連

13、接。 第28頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二3. DNA末端長度對(duì)限制酶切割的影響 限制酶切割 DNA 時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長度的要求，也就是說在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。第29頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二4. 位點(diǎn)偏愛（Site preference） 某些限制酶對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。 噬菌體 DNA全長48,502bp，有5個(gè)EcoR酶切位點(diǎn)。切割時(shí)并非在 5 個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)進(jìn)行，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快 10 倍。第30頁，共86頁，2

14、022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二 造成位點(diǎn)偏愛現(xiàn)象的原因 限制酶在切割DNA之前需要同時(shí)與兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用；限制酶對(duì)要求作用的DNA序列有兩個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)是為DNA切割時(shí)激活另一個(gè)的變構(gòu)位點(diǎn)。 第31頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途 第32頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二對(duì)任意一個(gè)限制酶來說，都有其各自的最佳反應(yīng)條件。 緩沖液 反應(yīng)溫度 反應(yīng)時(shí)間 酶切反

15、應(yīng)的終止 第33頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途 第34頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。實(shí)際上星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)。 第35頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二引起星星活性的因素 甘油濃度高（5%）限制酶過量（10

16、0U/l）離子強(qiáng)度低（8.0）反應(yīng)體系含DMSO、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑Mg+ 被其它二價(jià)陽離子如 Mn+ 、Cu+、Co+ 或 Zn+ 代替第36頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二抑制星星活性的措施 減少酶的用量（可避免過分酶切）減少甘油濃度保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶劑或乙醇提高離子強(qiáng)度到 100150mM （但不能抑制酶活性）降低反應(yīng) pH 至 pH7.0 保證使用 Mg+ 作為二價(jià)陽離子第37頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、定義二、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)三、限制修飾系統(tǒng)的種類四、限制性內(nèi)切酶的命名五、限制酶的特點(diǎn)六、酶

17、切反應(yīng)條件七、限制酶的星星活性（star activity）八、限制酶的用途 第38頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二DNA重組限制酶（物理）圖譜繪制突變分析（RFLP分析）限制酶的部分酶切與完全酶切第39頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二第二節(jié)甲基化酶（Methylase） 第40頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、甲基化酶的種類與識(shí)別序列二、甲基化對(duì)限制酶切的影響第41頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主 DNA 不被相應(yīng)的限制酶所切割。 1.

18、限制修飾系統(tǒng)I、II、III型中的甲基化酶三個(gè)系統(tǒng)中的甲基化酶可使細(xì)菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發(fā)生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。在DNA重組實(shí)驗(yàn)中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶的識(shí)別順序相同，其甲基化位點(diǎn)與限制酶作用位點(diǎn)可同可不同。M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同第42頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二2. E.coli 的dam、dcm甲基化酶這類甲基化酶與限制酶無關(guān)，不構(gòu)成相應(yīng)的限制修飾系統(tǒng)。Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6

19、位置上引入甲基。 G mATCDcm 甲基化酶識(shí)別 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二個(gè)胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。 C mCAGG C mCTGG 第43頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二該酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反應(yīng)與DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄等過程有關(guān)。3. 哺乳動(dòng)物的甲基化酶第44頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二E.coli 中至少有 3 種依賴于甲基化的限制系統(tǒng) mcrA、 mcrBC 和 mrr ，它們識(shí)別的序列各不相同，但只識(shí)別經(jīng)過甲基化的序列，都降解由 CpG 甲基化酶（M Sss）作用的 DNA 。 4. E

20、.coli中依賴于甲基化的限制修飾系統(tǒng)第45頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、甲基化酶的種類與識(shí)別序列二、甲基化對(duì)限制酶切的影響第46頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二1修飾酶切位點(diǎn)M.Taq 處理 DNA 后， GTCGAC 將不受 Hinc 切割。GTCGACGTCAACGTTGACGTTAACHincM.Taq TCGA第47頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二2產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)Dpn 是依賴甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.Taq 處理后形成甲基化（A）產(chǎn)物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即為 D

21、pn 位點(diǎn)。 第48頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二第三節(jié) DNA 聚合酶（DNA polymerase ）第49頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二DNA聚合酶指的是在DNA(或RNA)模板指導(dǎo)下，以4種dNTP為底物，在引物3-OH末端聚合DNA鏈的一類酶。特點(diǎn)： 需模板(DNA或RNA) 需引物 聚合方向53 同時(shí)具有35和外切53外切作用第50頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二目前已開發(fā)的DNA聚合酶DNA聚合酶(全酶)(E.coli)Klenow片段(E.coli)TDNA聚合酶TDNA聚合酶TaqDNA聚合酶(耐熱)

22、DNA末端轉(zhuǎn)移酶(小牛胸腺)反轉(zhuǎn)錄酶(依賴RNA)聚合酶依賴DNA的DNA聚合酶不依賴DNA的DNA聚合酶依賴RNA的DNA聚合酶第51頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二 一 . E.coli DNA聚合酶I（polI）Pol I 參與DNA修復(fù)，具35和53外切酶活性pol II 參與DNA修復(fù)，具35外切酶活性pol III 參與DNA復(fù)制，具35和53外切酶活性 1. E.coli 的DNA聚合酶系統(tǒng)第52頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二 2. E.coli DNA 聚合酶的活性 5-3 DNA 聚合酶活性5-3 外切核酸酶活性3-5 外切酶

23、活性交換反應(yīng) 第53頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二3. E.coli DNA 聚合酶的用途1）切口平移法制備探針Mg+DNase dNTPE.coli DNA Pol 第54頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二2）用于 cDNA 克隆中的第二鏈，即單純的 DNA 聚合活性。 3） 對(duì) 3 突出端的 DNA 作末端標(biāo)記 Mg+, DNA Pol I - 32P dATP AT第55頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二二、Klenow DNA 聚合酶 Klenow DNA 聚合酶是 E.coli DNA pol經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白

24、酶）裂解而從全酶中除去 5-3 外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3-5 外切活性不受影響。也稱為 Klenow 片段，或 E.coli DNA 聚合酶大片段。第56頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二 補(bǔ)平 3 凹端 DNA 。 抹平 DNA 3凸端。 通過置換反應(yīng)對(duì) DNA 進(jìn)行末端標(biāo)記。 在 cDNA 克隆中合成第二鏈。 隨機(jī)引物標(biāo)記。 應(yīng)用于雙脫氧鏈末端終止法 DNA 測序。 應(yīng)用于 PCR 反應(yīng)。 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈 DNA 。Klenow酶功能第57頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二三、T4 噬菌體 DNA 聚合

25、酶來源： T4噬菌體感染的E.coli結(jié)構(gòu)： MW=114000d活性： 53聚合反應(yīng)； 35外切活性（活性比Klenow酶大200倍，且對(duì)單鏈DNA活性大于雙鏈DNA）第58頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二用途： 填補(bǔ)或標(biāo)記限制酶切后產(chǎn)生的5-粘性末端的3-凹缺末端53補(bǔ)齊或末端標(biāo)記，同于Klenow53 3-粘性末端的標(biāo)記制備DNA探針，同 Klenow 末端標(biāo)記 延伸結(jié)合于單鏈DNA模板上的誘變寡核苷酸引物。D誘變引物T4 DNA聚合酶誘變DNA第59頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二四、T7 噬菌體 DNA 聚合酶來源： T7噬菌體感染的E

26、.coli結(jié)構(gòu)：由2個(gè)蛋白亞基組成：T7噬菌體基因5編碼的蛋白&宿主硫氧蛋白活性： 53聚合，在所有DNA聚合酶中持續(xù)反應(yīng)時(shí)間最長，所以合成 的DNA鏈較長，在DNA測序中有很大優(yōu)越性； 35外切活性（由 T噬菌體基因5編碼，是Klenow酶的 1000倍。 ）第60頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二用途： 復(fù)制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列5335與TDNA pol一樣，平齊粘性末端。定點(diǎn)突變中互補(bǔ)鏈的合成。 用填補(bǔ)或交換反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記。第61頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二測序酶（Sequenase）測序酶是美國 United St

27、ates Biochemical 公司改造的 T7 噬菌體 DNA 聚合酶，切除了 99% 以上的 3-5外切活性。 改進(jìn)的Sequenase 2.0則切除了所有的 3-5 外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對(duì)長片段進(jìn)行測序的理想用酶。 第62頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二五、TaqDNA聚合酶（耐熱）分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75， 對(duì)95高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在35外切酶活性。1. 特點(diǎn)：第63頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二2. 用途： PCR反應(yīng)； 測序，高溫下進(jìn)行DNA合成可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)。第64頁，共86頁

28、，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二六、DNA末端轉(zhuǎn)移酶 分子克隆中常用的末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是存在于前淋巴細(xì)胞及分化早期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不依賴于模板的 DNA 聚合酶。在二價(jià)陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3 羥基端，形成同聚物末端。若 dNTP 為 T 或 C ，此二價(jià)陽離子首選 Co2+ ；若 dNTP 為 A 或 G 此二價(jià)陽離子首選 Mg2+ 。第65頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二 克隆DNA片段時(shí)加上互補(bǔ)同聚物末端，便于與載體連接。用途： 末端標(biāo)記第66頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期

29、二七、反轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄酶即依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶，它有 5-3 合成 DNA 活性，但是無 3-5 外切活性。它來自 AMV （禽成髓細(xì)胞瘤病毒）或 Mo-MLV （Moloney 鼠白血病病毒，又稱 M-MuLV）。第67頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二用途：合成cDNA，克隆至載體中；黏性末端補(bǔ)平、標(biāo)記；雙脫氧測序時(shí)，如用其它酶效果不好，可使用反轉(zhuǎn)錄酶。第68頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二第四節(jié) 其它分子克隆工具酶第69頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二一、依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶 來源：SP6

30、噬菌體 RNA 聚合酶（來源于感染鼠傷寒沙門氏菌 LT2 菌株）； T4 或 T7 噬菌體 RNA 聚合酶（來源于噬菌體感染的大腸桿菌）。第70頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二 RNA 聚合酶實(shí)際上就是轉(zhuǎn)錄中的 RNA 合成酶，識(shí)別 DNA 中各自特異的啟動(dòng)子序列，并沿此 dsDNA 模板起始 RNA 的合成。無需引物，但需識(shí)別特異性位點(diǎn)。活性： 體外合成 RNA 分子。 用于表達(dá)外源基因。 用途：第71頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二二、連接酶 （Ligase） 催化雙連DNA片段緊靠在一起的3羥基和5磷酸集團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連

31、接。第72頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二1. T4 DNA連接酶PO43-5mM , NaCl25mM, Ca+0.1mM只連接ds -DNA分子，要求3-羥基和5-磷酸基 特點(diǎn)用途1) 相同或相容粘性末端的連接2) 平整末端的相連抑制劑第73頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二只能連接具黏性末端DNA分子，以NAD作輔助因子2. E.coli DNA連接酶T4 RNA 連接酶可以催化單鏈 DNA 或 RNA 的 5-磷酸與另一單鏈 DNA 或 RNA 的 3 羥基之間形成共價(jià)連接。 3. T4 RNA連接酶第74頁，共86頁，2022年，5月20

32、日，12點(diǎn)4分，星期二三、T4 多核苷酸激酶 1.催化反應(yīng)類型1)激酶活性（5-磷酸化酶）：可將ATP中的位的磷酸基轉(zhuǎn)移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5-羥基端2) 3-磷酸酶活性（pH 5-6）1) 5-端末端標(biāo)記 2) 分子克隆過程中以獲得5-磷酸基末端，便于連接酶反應(yīng)2. 用途第75頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二四、堿性磷酸酶 1) 載體DNA的去磷酸化，防止自我連接，以增加重組頻率2) 核酸末端標(biāo)記1.特點(diǎn)1) 除去ss-DNA，ds-DNA 和RNA分子兩端的3-和5-磷酸基2) 對(duì)熱穩(wěn)定2. 用途第76頁，共86頁，2022年，5月20日，12

33、點(diǎn)4分，星期二五、核酸酶 BAL31 核酸酶來源于交替單胞菌（A. espejiana）BAL31 ，主要活性為 3 外切核酸酶活性，可從線性 DNA 兩條鏈的 3 端迅速去除單核苷酸，隨后可從單鏈 DNA 內(nèi)部發(fā)揮緩慢的內(nèi)切酶活性，形成截短了的平端雙鏈 DNA 分子（約占 10-20%）以及帶有約 5 個(gè)核苷酸突出單鏈的截短分子（約占 80-90%）。反應(yīng)依賴 Ca+ ，EDTA 可抑制其活性。1BAL31 核酸酶第77頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二Sl 核酸酶來源于米曲霉（A. oryzae），可降解單鏈 DNA 或 RNA ，是一種單鏈核酸酶。對(duì) dsDNA、 dsRNA 和 DNA:RNA 雜交體不敏感。用于分析 DNA:RNA 雜交體的結(jié)構(gòu)，去掉雙鏈核酸中突出的單鏈尾從而產(chǎn)生平末端，打開雙鏈 cDNA 合成中產(chǎn)生的發(fā)莢環(huán)。2Sl 核酸酶第78頁，共86頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)4分，星期二RNaseA 來源于牛胰，為內(nèi)切核酸酶，可特異攻擊 RNA 上嘧啶殘基的 3端?？沙?DNA:RNA 中未雜交的 RNA 區(qū)，可用來確定 DNA 或 RNA 中單堿基突變的位置。廣泛用來去除 DNA 樣品中的 RNA 。 3. 核糖核酸酶 A （RNase A）第79頁，共86頁，2022年，5月20日