第7章現(xiàn)代生物技術與環(huán)境污染治理

7.1現(xiàn)代生物技術的概況7.1.1現(xiàn)代生物技術概述生物技術（Biotechnology）的定義★根據(jù)《中國生物技術政策綱要》(1986)：

以現(xiàn)代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其它基礎學科的科學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。簡而言之，指利用生物有機體或組成部分發(fā)展新產品或新工藝的一種技術體系。第一頁，共一百二十七頁?！冗M的工程技術手段：是指基因工程、酶工程、細胞工程和發(fā)酵工程等新技術。—改造生物體：是指獲得優(yōu)良品質的動物、植物或微生物品系?！镌希菏侵干矬w的某一部分或生物生長過程中所能利用的物質，如淀粉、糖蜜、纖維素等有機物，也包括一些無機化合物，甚至某些礦石?！獮槿祟惿a出所需的產品：包括糧食、醫(yī)藥、食品、化工原料、能源、金屬等各種產品?！_到某種目的：則包括疾病的預防、診斷與治療，環(huán)境污染的檢測與治理等。第二頁，共一百二十七頁。生物技術的內容細胞工程——包括一切生物類型的基本單位—細胞的離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融合以及細胞核、細胞質乃至染色體與細胞器的移植改建等操作技術。酶工程——利用生物有機體內酶所具有的某些特異催化功能，借助固定化技術、生物反應器等新技術、新裝置，高效優(yōu)質地生產特定產品的一種技術。發(fā)酵工程——亦稱為微生物工程，就是為微生物提供最適宜的發(fā)酵條件，生產特定產品的一種技術。這些技術并不是各自獨立的，而是相互聯(lián)系、相互滲透的?；蚬こ碳夹g是核心技術，它能帶動其它技術的發(fā)展，如通過基因工程對細菌或細胞改造后獲得的工程菌或細胞，必須通過發(fā)酵工程或細胞工程來生產有用物質?；蚬こ獭饕婕耙磺猩镱愋退灿械倪z傳物質—核酸的分離、提取、體外剪切、拼接重組以及擴增與表達等技術。第三頁，共一百二十七頁。微生物工程菌發(fā)酵工程基因工程蛋白質或酶蛋白質工程或酶工程動植物個體或細胞細胞工程產品優(yōu)良動植物品系基因工程、酶工程、細胞工程與發(fā)酵工程之間的關系第四頁，共一百二十七頁。生物技術的發(fā)展現(xiàn)代生物技術在1970s開始異軍突起，近一、二十年來發(fā)展極為神速。它與微電子技術、新材料技術和新能源技術并列為影響未來國計民生的四大科學技術支柱，被認為是21世紀世界知識經(jīng)濟的核心。傳統(tǒng)生物技術釀造技術近代生物技術微生物發(fā)酵技術現(xiàn)代生物技術生物工程第五頁，共一百二十七頁。★現(xiàn)代生物技術發(fā)展的主要事件1917KarlEreky(匈牙利)首次使用“生物技術”這一名詞1943大規(guī)模工業(yè)生產青霉素（penicillin－盤尼西林）1944Avery，MacLeod和McCarty通過實驗證明DNA是遺傳物質1953Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA的雙螺旋結構1958Crick提出了遺傳信息傳遞的中心法則1961Monod和Jacob提出操縱子學說；《BiotechnologyandBioengineering》雜志創(chuàng)刊1966Nireberg等人破譯遺傳密碼1967發(fā)現(xiàn)DNA連接酶第六頁，共一百二十七頁?！铿F(xiàn)代生物技術發(fā)展的主要事件1970Smith和Wilcox分離出第一個限制性內切酶HindⅡ；Baltimore和Temin等人發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能1971Crick對中心法則作了補充，提出了三角形中心法則1972Khorana等人合成了完整的tRNA基因（轉錄RNA）1973Boyer和Cohen建立了DNA重組技術（重要標志!!!）1975Kohler和Milstein建立了單克隆抗體技術1976第一個DNA重組技術規(guī)則問世；DNA測序技術誕生1977Itakura(板倉)實現(xiàn)了真核基因在原核細胞中的表達1978Genentech公司(美國)在大腸桿菌中表達出胰島素第七頁，共一百二十七頁?！铿F(xiàn)代生物技術發(fā)展的主要事件1980美國最高法院對經(jīng)基因工程操作的微生物授予專利1981第一臺商業(yè)化生產的DNA自動測序儀誕生；第一個單克隆抗體診斷試劑盒在美國被批準使用1982用DNA重組技術生產的第一個動物疫苗在歐洲批準1983基因工程Ti質粒（植物根癌誘癌質粒）用于植物轉化1988美國對腫瘤敏感的基因工程鼠授予專利；PCR技術問世1990美國批準第一個體細胞基因治療方案1997英國培養(yǎng)出第一只克隆綿羊多莉1998美國批準艾滋病疫苗進行人體實驗；日本培育出克隆牛，英美等國培育出克隆鼠第八頁，共一百二十七頁?！铿F(xiàn)代生物技術發(fā)展的主要事件2003人類基因組計劃：1990年10月美國正式啟動人類基因組計劃，2003年4月14日，美國國家人類基因組研究項目負責人弗朗西斯·柯林斯博士在華盛頓宣布，美、英、日、法、德和中國科學家經(jīng)過13年努力共同繪制完成了人類基因組序列圖，人類基因組計劃所有目標全部實現(xiàn)?；蚪M序列圖首次在分子層面上為人類提供了一份生命“說明書”。美國英國日本法國德國中國國際人類基因組計劃各國承擔的工作量第九頁，共一百二十七頁。7.1.2環(huán)境生物技術（EnvironmentalBiotechnology）環(huán)境生物技術的產生現(xiàn)代環(huán)境生物技術是現(xiàn)代生物技術應用于環(huán)境污染防治的一門新興邊緣學科。它誕生于1980s末期，以高新技術為主體，并包括對傳統(tǒng)生物技術的強化與創(chuàng)新。環(huán)境生物技術涉及眾多的學科領域，主要由生物技術、工程學、環(huán)境學和生態(tài)學等組成。它是由生物技術與環(huán)境污染防治工程及其它工程技術緊密結合形成的，既具有較強的基礎理論，又具有鮮明的技術應用特點。環(huán)境生物技術的定義直接或間接利用生物或生物體的某些組成部分或某些機能，建立降低或消除污染物產生的生產工藝，或者能夠高效凈化環(huán)境污染，同時又生產有用物質的工程技術。第十頁，共一百二十七頁。環(huán)境生物技術的內容環(huán)境生物技術可分為高、中、低三個層次——

高層次是指以基因工程為主導的現(xiàn)代污染防治生物技術，如基因工程菌的構建、抗污染型轉基因植物的培育等；

中層次是指傳統(tǒng)的生物處理技術，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理論和技術背景下產生的強化處理技術和工藝，如生物流化床、生物強化工藝等；

低層次是指利用天然處理系統(tǒng)進行廢物處理的技術，如氧化塘、人工濕地系統(tǒng)等?！h(huán)境生物技術的三個層次均是污染治理不可缺少的生物技術手段。為了解決日益嚴重的環(huán)境污染問題，需配合使用高、中、低三個層次的技術，針對不同的問題，采用不同的技術或不同技術的組合。第十一頁，共一百二十七頁。環(huán)境生物技術面臨的任務

解決基因工程菌從實驗室進入模擬系統(tǒng)和現(xiàn)場應用過程中，其遺傳穩(wěn)定性、功能高效性和生態(tài)安全性等方面的問題；

開發(fā)廢物資源化和能源化技術，利用廢物生產單細胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用廢物生產生物能源，如甲烷、氫氣、乙醇等；

建立無害化生物技術清潔生產新工藝，如生物制漿、生物絮凝劑、煤的生物脫硫、生物冶金等；

發(fā)展對環(huán)境污染物的生理毒性及其對生態(tài)影響的檢測技術。第十二頁，共一百二十七頁。7.2基因工程與環(huán)境污染生物治理7.2.1基因工程概述基因工程（GeneEngineering）的定義將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作稱為基因工程?；蚬こ贪ɑ虻姆蛛x、重組、轉移以及基因在受體細胞內的保持、轉錄、翻譯表達等全過程?；蚬こ逃址QDNA重組技術(RecombinantDNATechnique)，是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術。第十三頁，共一百二十七頁?；蚬こ虒嵤┑乃膫€基本條件工具酶基因載體受體細胞基因工程的基本內容

帶有目的基因的DNA片段的獲取

在體外將帶有目的基因的DNA片段連接到載體上，形成重組DNA分子

重組DNA分子導入受體細胞（或稱宿主細胞或寄主細胞）

帶有重組體的細胞擴增，獲得大量的細胞繁殖群體（即所謂克?。河⑽腃lone一詞的單譯，意為無性繁殖系，即通過無性繁殖（如細胞有絲分裂）可連續(xù)傳代并形成的群體）

重組體的篩選第十四頁，共一百二十七頁?；蚬こ痰幕具^程質粒酶切位點限制酶切割外源DNA酶切位點限制酶切割DNA鏈接酶封口重組質粒重組質粒染色體受體細胞第十五頁，共一百二十七頁。DNA大腸桿菌細胞供體細胞目的基因質粒重組質粒

選擇工具酶

選擇合適的載體

目的基因的分離

目的基因導入受體

目的基因的篩選和檢測基因工程的關鍵步驟：Ⅰ.從細胞中分離出DNAⅡ.限制酶截取DNA片段Ⅲ.分離大腸桿菌細胞中的質粒Ⅳ.DNA重組Ⅴ.再用重組質粒轉化大腸桿菌細胞Ⅵ.培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量目的基因以大腸桿菌質粒載體為例的基因工程過程第十六頁，共一百二十七頁。⊙基因工程的工具酶①限制性內切酶—“基因手術刀”

識別和切割DNA雙分子鏈內特殊核苷酸順序的酶。目前已發(fā)現(xiàn)400多種限制酶，每種限制酶只能識別特定的核苷酸序列，并在其特定的切點上切割DNA分子，切開時形成長短不一的雙鏈末端，稱為“粘性末端（cohesiveend）”。目前幾乎所有的在基因工程中使用的限制性內切酶都已商品化。DNA雙鏈粘性末端基因工程的關鍵技術是DNA的連接重組。在DNA連接之前必須進行加工，把DNA分子切割成所需片段，有時為便于DNA片段之間的連接，還須對DNA片段末端進行修飾。把DNA分子切割、DNA片段修飾和DNA片段連接等所需的酶稱為工具酶。主要有限制性內切酶、連接酶、修飾酶。第十七頁，共一百二十七頁。②連接酶—“基因的針線”用于將兩段乃至數(shù)段DNA片段拼接起來的酶?；蚬こ讨凶畛Ｓ玫倪B接酶是T4DNA連接酶。它催化DNA5’磷酸基與3’羥基之間形成磷酸二酯鍵。GCATATTATACG③修飾酶

DNA聚合酶(DNApolymerase)：催化作用：催化的反應均為使兩個DNA片段末端之間的磷酸基團和羥基基團連接形成磷酸二酯鍵。第十八頁，共一百二十七頁。DNA聚合酶的種類——A.

大腸桿菌DNA聚合酶IB.

大腸桿菌DNA聚合酶I大片段C.

T4噬菌體DNA聚合酶D.

T7噬菌體DNA聚合酶E.

耐高溫DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）：由于其最佳作用溫度為75～80℃，目前廣泛用于聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,簡稱PCR)及DNA測序。DNA聚合酶的用途——A.

DNA分子的體外合成B.

體外突變C.

DNA片段探針的標記D.

DNA的序列分析E.

DNA分子的修復F.

聚合酶鏈式反應（PCR）第十九頁，共一百二十七頁。變性退火伸展DNA聚合酶鏈式反應(PCR)示意圖PCR儀第二十頁，共一百二十七頁。

逆轉錄酶：逆轉錄酶是一種有效的轉錄RNA產生cDNA(互補DNA)的酶。逆轉錄酶的用途——

以真核mRNA為模板，合成cDNA，用以組建cDNA文庫以進而分離為特定蛋白質編碼的基因。近年來將逆轉錄與PCR偶聯(lián)建立起來的逆轉PCR（RT-PCR）使真核基因的分離更加有效。逆轉錄DNARNAProtein轉錄翻譯

T4多核苷酸激酶：

T4多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基團轉移至DNA或RNA片段的5′末端。第二十一頁，共一百二十七頁。T4多核苷酸激酶的用途——A.標記DNA片段的5'端，制備雜交探針；B.基因化學合成中，寡核苷酸片段5'磷酸化；C.用于測序引物的5'磷酸標記。

堿性磷酸酶：將DNA或RNA5’末端的磷酸基團變?yōu)榱u基。堿基磷酸核糖5’3’γ第二十二頁，共一百二十七頁?！鸦蚬こ痰妮d體(Vector)—“基因的運輸工具”

能承載外源DNA片段（基因）并帶入受體細胞的傳遞者。載體決定了外源基因的復制、擴增、傳代乃至表達。①載體的必備條件

能夠進入宿主細胞；

載體可以在宿主細胞中獨立復制；

要有篩選標記：攜帶有外源DNA的載體進入宿主細胞與否以及進入后復制與否全靠篩選標記提供幫助。

對多種限制酶有單一或較少的切點，最好是單一切點。限制酶切點是外源DNA插入、載體DNA開環(huán)和閉環(huán)的基礎。第二十三頁，共一百二十七頁。②載體的種類目前已構建應用的基因工程載體有：質粒載體、噬菌體載體、病毒載體以及由它們互相組合或與其它基因組DNA組合成的載體。

質粒載體★

質粒(Plasmid)：

能自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們在細菌中以獨立于染色體之外的方式存在，一個質粒就是一個DNA分子，其大小可從1kb（千堿基）到200kb。質粒廣泛存在于細菌之中，在某些藍藻、綠藻和真菌細胞中也存在質粒。每個質粒都有一段DNA復制起始位點的序列，它幫助質粒DNA在宿主細胞中復制。質粒的復制和遺傳獨立于染色體，但其復制和轉錄依賴于宿主所編碼的蛋白質和酶。第二十四頁，共一百二十七頁。大腸桿菌質粒的分子結構示意圖

DNA大腸桿菌細胞質?？咕乜剐曰蚩刂瀑|粒DNA轉移的基因第二十五頁，共一百二十七頁。

噬菌體（phage）載體噬菌體是感染細菌的一類病毒。λ噬菌體由頭和尾構成，其基因組是長約49kb的線性雙鏈DNA分子，組裝在頭部蛋白質外殼內部。

λ噬菌體整個基因組可分為三個部分：—左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質?！卸危洪L約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列?！冶郏洪L約10kb，是調控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調控基因和序列、以及λDNA復制起始均在這區(qū)域內。

左右臂包含λDNA復制、噬菌體結構蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列。對溶菌生長來說，中段是非必需的。核酸外殼蛋白噬菌體結構簡圖第二十六頁，共一百二十七頁。左臂（長臂）右臂（短臂）中段（非必需區(qū)）COS末端（粘性末端）COS末端（粘性末端）利用λ噬菌體作載體，主要是將外來目的DNA替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。現(xiàn)在廣泛使用的λ噬菌體載體是已做過許多人工改造的，主要的改造是：A.設計去除λDNA上的一些限制性酶切點。這是因為λDNA較大，序列中的限制性酶切點過多，妨礙其應用。B.在中段非必需區(qū)，替換插入某些標志基因如可供藍白篩選lacI-lacZ’序列，和多克隆位點等。由此可構建出兩類λ噬菌體作載體：一類是插入型載體，可將外來序列插中段，常用的λgt系列載體，一般容許插入5-7kb外來DNA；另一類是轉換型載體，即可用外來DNA替代中段，如IMBL系列載體。第二十七頁，共一百二十七頁。

柯斯質粒載體（cosmidvector）

是將λ噬菌體的粘性末端（cos位點序列）和大腸桿菌質粒的抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因相連而獲得的人工載體，含一個復制起點、一個或多個限制酶位點、一個cos片段和抗藥基因，能加入40～50kb的外源DNA。它綜合了質粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)點?？滤官|粒載體pHC79形體圖第二十八頁，共一百二十七頁。

人工染色體載體

其特點是可以容納大片斷外源DNA。以λ噬菌體為基礎構建的載體能裝載的外源DNA片段只有24kb左右，而柯斯質粒載體也只能容納35～45kb，然而許多基因過于龐大而不能作為單一片段克隆于這些載體中?！湍溉斯と旧w（YAC）：

是在酵母細胞中克隆外源DNA大片段克隆體系，由酵母染色體中分離出來的DNA復制起始序列、著絲點、端粒以及酵母選擇性標記組成的能自我復制的線性克隆載體。它以質粒的形式出現(xiàn)。

—細菌人工染色體（BAC）：是以細菌F因子（細菌的性質粒）為基礎組建的細菌克隆體系。其特點為：拷貝數(shù)低，穩(wěn)定，比YAC易分離，其對外源DNA的包容量可達300kb。BAC可以通過電穿孔導入細菌細胞，其不足之處是對無選擇性標記的DNA的產率很低。第二十九頁，共一百二十七頁?！涯康幕虻姆蛛x

什么是目的基因？——基因工程的主要目的是通過優(yōu)良性狀相關基因的重組，獲得具有高度應用價值的新品種。為此，須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離出可用于克隆的此類基因。這樣的基因通常稱為目的基因。目的基因的獲得方法——①從生物的基因組直接分離目的基因常用方法——鳥槍法：簡單地說，它有點類似生活中玩的拼圖游戲：將一個完整的畫面分成雜亂無章的碎塊，然后重新拼裝復原。鳥槍法即用限制酶將某種生物的DNA切成片段并分別載入載體，對受體細胞進行轉化，讓外源DNA所有的片段都在宿主細胞中大量擴增，這其中必然含有所需目的基因的轉化細胞，再用某些檢測方法挑選有目的基因的轉化細胞，把目的基因挑選出來。第三十頁，共一百二十七頁。②從酶促合成法（基因文庫法，或cDNA文庫法）將真核細胞基因轉錄的全部RNA提取出來，在體外經(jīng)逆轉錄酶的作用，生成與mRNA互補的DNA（cDNA），再將cDNA酶切后載入載體，建立cDNA文庫，由于該生物中目的基因的轉錄活性強，所以cDNA文庫中含目的基因的轉化細胞比例較大，比較容易用某些檢測方法把目的基因挑選出來。此外還可利用PCR技術，可使少量的目的基因片斷在合適的條件下進行擴增，以獲取目的基因片斷。逆轉錄DNARNAProtein轉錄翻譯第三十一頁，共一百二十七頁?！涯康幕驅胧荏w細胞

目的基因能否有效地導入受體細胞，取決于是否選用合適的受體細胞、合適的克隆載體和合適的基因轉移方法。

①

什么是受體細胞（或宿主細胞或表達系統(tǒng)）？基因工程發(fā)展到今天，從原核到真核細胞，從簡單的真核如酵母菌到高等的動植物細胞都能作為基因工程的受體細胞，由于所用的基因載體不同，所選用的受體細胞也不同。

原核生物細胞是一類很好的受體細胞，容易攝取外界的DNA，增殖快，基因組簡單，便于培養(yǎng)和基因操作?！獜膶嶒灱夹g上講，是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞；——從實驗目的上講，是有理論研究價值和應用價值的細胞。第三十二頁，共一百二十七頁。

大腸桿菌

假單胞菌——是目前用作基因克隆受體的主要原核生物——用于構建環(huán)境保護所需的具有多種降解能力的工程菌

真核生物細胞

如酵母菌和某些動植物的細胞。由于酵母菌的某些性狀類似原核生物，所以較早被用作基因克隆受體；雖然動物細胞也被用作受體細胞，但由于體細胞不易再分化成個體，所以采用生殖細胞、受精卵細胞或胚胎細胞作為基因轉移的受體細胞，由此培養(yǎng)成轉基因動物。第三十三頁，共一百二十七頁。

②

目的基因導入克隆載體和受體細胞

目的基因導入克隆載體——目的基因導入受體細胞之前，一般須先把含目的基因的DNA片段導入合適的克隆載體。根據(jù)實驗設計，確定了合適的克隆載體和含目的基因的DNA片段，選用限制性內切酶切割，并用DNA連接酶連接，則可以得到預期的重組DNA分子。

重組DNA分子導入受體細胞——轉化

把外源DNA分子導入細菌細胞的過程。轉化過程包括制備感受態(tài)細胞和轉化處理。感受態(tài)細胞（competentcells）是指處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。轉化方法有：

高壓電穿孔法

多聚物介導法

磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導的轉染法

原生質體融合法

脂質體介導法

顯微注射法第三十四頁，共一百二十七頁。

高壓電穿孔法——

把宿主細胞置于一個外加電場中，通過電場脈沖在細胞壁或膜上打孔，DNA分子隨即進入細胞。該法需專門儀器，目前已有多家公司出售。

多聚物介導法——

聚乙二醇（PEG）和多聚賴氨酸等是協(xié)助DNA轉移的常用多聚物，尤以PEG應用最廣。這些多聚物同二價陽離子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+等）和DNA混合，可在原生質體表面形成顆粒沉淀，使DNA進入細胞內。這種方法常用于酵母細胞以及其它真菌細胞。

磷酸鈣或DEAE（二乙基氨基）-葡聚糖介導的轉染法——

這是將外源基因導入哺乳類動物細胞進行瞬時表達的常規(guī)方法。磷酸鈣轉染法的基本原理是：哺乳動物細胞能捕獲粘附在細胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉入細胞。先將重組DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，隨后與磷酸鈣形成DNA-磷酸鈣沉淀，粘附在細胞表面，達到轉染目的。被感染的DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后通過內吞作用進入受體細胞。第三十五頁，共一百二十七頁。

原生質體融合法——

將帶重組質粒的細菌原生質體同受體細胞進行短暫的共培養(yǎng)，經(jīng)過細胞膜融合，將重組DNA導入細胞。

脂質體介導法——

脂質體（liposome）是由人工構建的磷脂雙分子層組成的膜狀結構，把用來轉染的DNA分子包在其中，通過脂質體與細胞接觸，將外源DNA分子導入受體細胞。其原理為：細胞膜表面帶負電荷，脂質顆粒帶正電荷，以電荷間引力將DNA、mRNA及單鏈RNA導入細胞內。

顯微注射法——

利用哺乳動物細胞便于注射的特性，將外源DNA分子通過顯微注射法直接注入細胞。第三十六頁，共一百二十七頁?！褜δ康幕虻暮Y選和檢測

目的基因和載體重組并進入宿主后，并非能全部按照預先設計的方式重組，由于操作的失誤及不可預測因素的干擾等，真正獲得目的基因并能有效表達的克隆子一般來說只是一小部分，而絕大部分仍是原來的受體細胞，或者是不含目的基因的克隆子。必須從處理后的大量受體細胞中分離出真正的克隆子。

①生物學方法包括遺傳學方法、免疫學方法和噬菌斑的形成等。

②核酸雜交法先制備含目的DNA片段的探針(probe)，然后通過DNA-DNA，DNA-RNA堿基配對的原理進行篩選，以探針的使用為核心，包括原位雜交、Southen雜交、Northen雜交等。

②物理方法

先進行PAGE電泳（聚丙烯酰氨電泳），然后將完成PAGE后的分離區(qū)帶轉移到特定的固相膜上產生印跡，然后再用各種方法檢測（印跡法—Blotting）。第三十七頁，共一百二十七頁。7.2.2基因工程菌在環(huán)境污染生物處理中的應用基因工程菌可以達到的目的基因工程為改變細菌細胞內的關鍵酶或酶系統(tǒng)提供了可能，從而可以：

提高微生物的降解速率

拓寬酶對底物（有機污染物）的專一性范圍

維持低濃度下的代謝活性

改善有機污染物降解過程中的生物催化穩(wěn)定性第三十八頁，共一百二十七頁。用于污染治理的基因工程菌示例⊙降解鹵代芳烴的基因工程菌—pD10質粒-假單胞菌細胞

IMP134菌體中的pJP4質粒上存在著降解氯代苯鄰二酚的基因，將此基因克隆到廣泛宿主質粒pKT231上。重組之后的質粒記為pD10。當它轉移到受體細胞——假單胞菌細胞中后，菌體則能分解代謝氯代苯鄰二酚。這個質粒已用于構建降解氯代-O-硝基苯酚的工程菌。pD10質粒分解代謝氯代苯鄰二酚pJP4質粒IMP134菌體pKT231質?？寺∷拗魇荏w細胞pD10質粒-假單胞菌細胞第三十九頁，共一百二十七頁?！逊纸饽猃埞丫畚锏幕蚬こ叹猵OAD質粒-大腸桿菌

黃桿菌屬、棒狀桿菌屬和產堿桿菌屬具有分解尼龍寡聚物的質粒。但上述三個屬的細菌不易在污水中繁殖。而污水中普遍存在的大腸桿菌又無分解尼龍寡聚物的質粒。岡田等人已成功地把分解尼龍寡聚物的質粒pOAD基因移植到受體細胞大腸桿菌內，使后者獲得了該基因指令的遺傳性狀。大腸桿菌pOAD質?！逊纸舛嗵堑幕蚬こ叹婢邚U物資源化作用）①將分解纖維素和木質素的基因組建到酵母菌體中，用于處理有機廢水、生產乙醇。②將嗜熱單胞酵母的纖維素酶基因組建到大腸桿菌中或將谷氨酸脫氫酶基因引入到大腸桿菌質粒pSS515中，再轉入到產甲烷的受體菌中，使得發(fā)酵工藝成功地用于處理排放廢水，生產出高生化需氧量的副產品，即乙醇或甲烷。第四十頁，共一百二十七頁。⊙抗金屬的基因工程菌目前已發(fā)現(xiàn)抗Hg、抗Cd、抗Pb等多種菌株。但是，這類菌株多數(shù)生長繁殖并不迅速。把這種抗金屬的基因，轉移到生長繁殖迅速的受體菌中，構成繁殖率高，富集金屬速度快的新菌株，可用于凈化重金屬污染的廢水。例如有人將假單胞桿菌R4染色體中的抗鎘基因，轉移到大腸桿菌HB101中，使得大腸桿菌HB101能在100mg/L的含鎘液體中生長，具有抗鎘的遺傳特征。大腸桿菌HB101抗鎘基因⊙降解除草劑的基因工程菌目前已從細菌質粒中發(fā)現(xiàn)降解2,4-D除草劑的基因片段，將這段基因組建到載體質粒上，轉移到另一種繁殖快的菌體宿主體內。新構建的基因工程菌，具有高效降解2,4-D除草劑的功能。第四十一頁，共一百二十七頁?！褮⑾x的基因工程菌—細菌殺蟲劑應用基因重組技術生產細菌殺蟲劑，目前已經(jīng)成功應用。蘇云金桿菌具有毒性蛋白，能殺死鱗翅目害蟲（菜青蟲、小菜蛾、甜菜夜蛾、二化螟和棉鈴蟲幼蟲）。把這種毒性蛋白的基因，轉移到大腸桿菌和枯草桿菌中，能大量生產這種微生物殺蟲劑。把這種殺蟲劑微生物包附在種子表面，作物生長之后，根部布滿了這種細菌，使植物免受蟲害。繼這項成果之后，科學家又將蘇云金桿菌29個亞種的毒性基因，一起組建到大腸桿菌中去，開發(fā)出一種廣譜的細菌殺蟲劑。菜青蟲——菜粉蝶二化螟第四十二頁，共一百二十七頁?！鸦蚬こ叹纳鷳B(tài)安全問題

關于基因工程應用的生態(tài)安全性是人們十分關注的問題，目前仍在研究之中。

至今還沒有制定出一部廣泛使用工程菌的國際化章程。

考查基因工程菌存活情況，基因工程菌新基因的穩(wěn)定性能，新基因轉移到其它生物體中或其它非目標環(huán)境之中的規(guī)律以及基因工程菌對生態(tài)系統(tǒng)的副作用等等，均是緊緊圍繞著治理污染基因工程菌的安全性和有效性進行的。第四十三頁，共一百二十七頁。基因工程菌生態(tài)安全性及其優(yōu)勢的基本結論

基因工程菌對自然界的微生物或高等生物不構成有害的威脅，基因工程菌有一定的壽命，菌種可能分化為有效至無效多種類型；

基因工程菌進入凈化系統(tǒng)之后，需要一段適應期，但比土著種的馴化期要短得多；

基因工程菌降解污染物功能下降時，可以重新接種；

目標污染物可能大量殺死土著菌，而基因工程菌卻容易適應生存，發(fā)揮功能。第四十四頁，共一百二十七頁。7.3細胞工程與環(huán)境污染生物治理7.3.1細胞工程概述細胞工程(CellEngineering)的定義在細胞水平上（細胞增殖、分化、死亡）研究、開發(fā)和利用各類細胞的工程。細胞工程的發(fā)展主要建立在細胞融合（cellfusion）的基礎上，人們可以根據(jù)需要，經(jīng)過科學設計，在細胞水平上改造生物的遺傳物質。它所要求的技術條件、實驗設備及試劑、經(jīng)費等均比基因工程要求的低一些。37℃40min促融劑人細胞小鼠細胞紅色熒光染料標記的膜蛋白氯色熒光染料標記的膜蛋白融合細胞第四十五頁，共一百二十七頁。細胞工程的主要方法⊙細胞培養(yǎng)（cellculture）將細胞從生物體內取出，然后在特制的培養(yǎng)容器內給予必要的生長條件，使其在體外（invitro）繼續(xù)生長與繁殖。細胞培養(yǎng)有動物細胞培養(yǎng)、植物的花粉、原生質體的培養(yǎng)。幼齡動物剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)⊙細胞融合（cellfusion）在一定的條件下，將兩個或多個細胞融合為一個細胞的過程，細胞融合又稱細胞雜交。基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體；來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體。細胞的融合過程，最初是細胞在促融因子作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，細胞之間的質膜發(fā)生粘連，細胞質開始融合，然后在培養(yǎng)過程中，進而發(fā)生核融合，形成雜種細胞。第四十六頁，共一百二十七頁?！鸭毎亟M在體外條件下，運用試驗技術從活細胞中分離出各種細胞的結構或組件，再根據(jù)需要把它們在不同的細胞之間重新進行裝配，成為具有生物活性的細胞。重組有核移植和細胞器移植：①

核移植——主要是借助顯微操作儀，在顯微鏡下用微吸管把一個細胞中的細胞核吸出，直接移到另一個去核的細胞中。②

細胞器移植——通過原生質體對已分離純化的葉綠體的胞飲作用，進行葉綠體移植，或通過微注射、載體轉移以及胞飲攝入進行線粒體移植。顯微操作儀第四十七頁，共一百二十七頁?！堰z傳物質轉移——基因在細胞水平的轉移①

載體法——利用雙子葉植物如番茄、甜菜、棉花和大豆等常用載體轉移基因的方法，將含有外源基因的根瘤農桿菌與受體原生質體共同培養(yǎng)，或將含有外源基因的質粒和受體原生質體用聚乙二醇（PEG）處理轉化，最后由轉化體培育成轉化植物。②

直接導入法——最常用的是微注射法，即在顯微操作儀的幫助下，用微針直接對細胞進行注射，直接將外源基因注入到一個受體的受精卵的核內，然后合子便能發(fā)育成胚，并進一步發(fā)育成為成熟的個體。第四十八頁，共一百二十七頁。細胞工程的內容包括微生物細胞工程、植物細胞工程和動物細胞工程，目前主要應用微生物細胞工程進行污染生物治理?！盐⑸锛毎こ涛⑸锛毎こ虘梦⑸镞M行細胞水平的研究和生產，具體內容包括各種微生物細胞的培養(yǎng)（發(fā)酵工程）、遺傳性狀的改造（遺傳學、發(fā)酵工程、基因工程）、微生物細胞的直接利用或獲得細胞代謝產物等。其中微生物細胞原生質體融合技術是構建環(huán)境工程菌的基本技術。★微生物細胞原生質體融合技術——首先經(jīng)培養(yǎng)獲得大量菌體細胞，用脫壁酶處理脫壁，制成原生質體。然后將兩種不同菌株的原生質體混合在一起，使原生質體彼此接觸、融合，再使融合的原生質體在合適的培養(yǎng)基平板上再生出細胞壁，并生長繁殖，形成菌落，最后測定參與融合的性狀重組或產量變化情況，以篩選出重組子。第四十九頁，共一百二十七頁。微生物細胞原生質體融合的關鍵步驟：①原生質體制備→

原生質體（Protoplast）：細胞質壁分離后去掉細胞壁所余下那部分結構。原生質體具備原有細胞的全部內部結構與生理性能，但是它完全無細胞壁，失去了細胞的剛性而呈球形，對滲透壓十分敏感。原生質體比較容易吸收外來的DNA、蛋白質等，同時，對外界理化因子比較敏感，在原生質體外面僅存原生質膜，在外界理化融合因子的誘導下，不同物種間的原生質體間的質膜相互融合雜交，并在適當?shù)臈l件下，融合的原生質體再生出細胞壁并恢復原來完整的細胞形態(tài)與群落形態(tài)，構成具有多種遺傳性狀的新物種。

脫壁：為了進行細胞融合，必須先除去細胞壁。目前常用的方法是酶解法（主要采用溶菌酶、纖維素酶等）。第五十頁，共一百二十七頁。②融合重組→

把兩親株的原生質體混合在一起，促進融合，然后將融合液涂布在平板上再生，檢出重組子。融合重組示意圖細胞壁溶菌酶細胞膜生長細胞原生質體培養(yǎng)融合的原生質體混合融合子原生質體原生質體融合細胞壁再生第五十一頁，共一百二十七頁。誘導原生質體融合的方法——化學誘導法：常用于細胞融合的化學促融劑是聚乙二醇（PEG），方法是：在得到兩親本原生質體后，等量混合兩親本的原生質體，加入適量的PEG和鈣離子溶液，保溫后，洗去多余的PEG，在選擇培養(yǎng)基上篩選出融合子。——電融合法：借助電場的作用，引發(fā)細胞融合。③原生質體再生成細胞→

原生質體在等滲的培養(yǎng)基中重建細胞壁，恢復細胞完整形態(tài)，并能生長、分裂。④融合重組的測定→

通常采用染色體標記的遺傳重組體來檢測。第五十二頁，共一百二十七頁。7.3.2應用舉例—利用原生質體融合構建環(huán)境工程菌芳香族化合物降解菌的構建PseudomonasalcaligenesCO可降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯，但不能利用甲苯和1,4-二氯苯甲酸酯PseudomonasputidaR5-3可以降解苯甲酸酯和甲苯，但不能利用3-氯苯甲酸酯和1,4-二氯苯甲酸酯融合子CB1-9可以同時降解上述4種化學污染物假單胞菌第五十三頁，共一百二十七頁。乙二醇降解菌：Pseudomonasmendocina3RE-15甲醇降解菌：Bacilluslentus3RM-2苯甲酸和苯降解菌AcinetobactercalcoaceticusT3的原生質體融合菌株TEM-1可同時降解苯甲酸、苯、甲醇和乙二醇DNADNA融合第五十四頁，共一百二十七頁。纖維素降解菌的構建脫氫雙香草醛（DDV）降解菌Fusobacteriumvarium對DDV的降解能力為3-10%脫氫雙香草醛降解菌Enterococcusfaecium對DDV的降解能力為3-10%融合細胞FE7菌株DDV降解率高達80%融合第五十五頁，共一百二十七頁。聚乙二醇（PEG）誘導原生質體融合制備細菌殺蟲劑玉米螟球形芽孢桿菌BacillussphaericusTS-1：殺：淡色庫蚊（雙翅目）蘇云金芽孢桿菌Bacillus

thuringiensisH4：殺：粘蟲、玉米螟利用PEG融合融合菌株殺蟲試驗殺蚊試驗獲得6株雙殺菌株粘蟲制備原生質體第五十六頁，共一百二十七頁。電融合誘導選育利用木糖和纖維二糖生產乙醇的菌株釀酒酵母季也蒙假絲酵母利用融合儀進行電誘導融合融合子利用木糖和纖維二糖生產乙醇制備原生質體第五十七頁，共一百二十七頁。7.4酶工程與環(huán)境污染生物治理7.4.1酶工程概述什么是酶工程（EnzymaticEngineering）？利用生物有機體內酶所具有的某些特異催化功能，借助固定化生物反應器等新技術、新裝置，高效優(yōu)質地生產特定產品的技術——是將酶學原理與化工技術相結合而形成的新技術。酶工程的主要內容與任務

主要內容：酶的生產、酶的分離純化、酶分子修飾、酶固定化、酶反應動力學、酶反應器、酶的應用等。

任務：通過預先設計，經(jīng)過人工操作控制而獲得大量所需的酶，并通過各種方法使酶發(fā)揮其最大的催化功能，即利用酶的特定功能，借助工程學手段為我們提供產品或分解有害物質。第五十八頁，共一百二十七頁。7.4.2酶工程在環(huán)境污染生物治理中的應用酶固定化⊙為什么要對酶進行固定化？①酶的穩(wěn)定性較差，在適當溫度、pH值和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活。②酶一般都是在水溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統(tǒng)中，與底物和產物混在一起，反應結束后，即使酶仍有較高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使成本較高，而且難于連續(xù)化生產。第五十九頁，共一百二十七頁?！衙腹潭ɑ夹g①固定化酶及其特點→

固定化酶（ImmobilizedEnzyme）：

又稱水不溶酶，是通過物理吸附法或化學鍵合法將水溶性酶和固態(tài)的不溶性載體相結合，使酶變成不溶于水但仍保留催化活性的衍生物。

固定化酶的特點：

固定化酶比水溶酶穩(wěn)定，因為載體能有效地保護酶的天然構型，不易受酸、堿、有機溶劑、蛋白質變性劑、酶抑制劑及蛋白酶等的影響，可以在較長時間內保持酶的活性。

固定化酶適合于連續(xù)化、自動化和管道化工藝，還可以回收、再生和重復使用。

固定化酶可以設計成不同的形式，如在處理靜態(tài)水時把酶制成酶片和酶布，處理動態(tài)廢水時，可以制成酶柱。第六十頁，共一百二十七頁。②酶的分離提純→

菌種選育：根據(jù)需要篩選產酶量高并易于培養(yǎng)和分離提取的優(yōu)良菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)：按照微生物生長和產酶的最適條件進行培養(yǎng)。

分離提?。焊鶕?jù)酶是蛋白質這一特征，可用一系列提純蛋白質的方法對發(fā)酵液進行處理，如鹽析（用硫酸銨或氯化鈉）、調節(jié)pH、等電點沉淀、有機溶劑（乙醇、丙酮、異丙醇等）分級分離等方法提純。

保存：常用的方法是：保持濃縮的酶溶液；將去除鹽分的酶溶液冷凍干燥成酶粉，存放于冰箱；濃縮的酶溶液加入等體積的甘油于-20℃保存。第六十一頁，共一百二十七頁。③酶的固定化方法→

載體結合法：將酶結合在非水溶性的載體上，根據(jù)酶與載體的結合方式，可分為共價結合法、物理吸附法、離子結合法和生物特異結合法四種。其中物理吸附法操作最為簡便。常用的載體有活性炭、多孔玻珠、高嶺土、膨潤土、氧化鋁、硅膠、纖維素、膠原等。共價結合物理吸附離子結合生物特異性結合第六十二頁，共一百二十七頁。

交聯(lián)法：利用雙功能試劑或多功能試劑的作用，使酶與酶發(fā)生交聯(lián)而進行固定的方法，這種方法可以使酶與帶有兩個以上的多功能基團試劑分子之間形成共價鍵，從而使酶固定。交聯(lián)法不用載體，常用的交聯(lián)劑有戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺、六甲撐二異氰酸酯等人工合成物。

包埋法：將酶包裹在凝膠格子中或由半透膜組成的膠囊中。包埋法又可以分為格子型和微膠囊型兩種。格子型是將酶包埋在聚丙烯酰胺凝膠、硅膠等網(wǎng)格子中，使酶得以固定。微膠囊型是一種以尼龍、乙基纖維素、硝酸纖維素等薄膜包裹固定酶的技術，使酶存在于類似細胞內，不脫落于囊外。第六十三頁，共一百二十七頁。

逆膠束酶：反應系統(tǒng)中酶以逆膠束的形式被“固定”。所謂“逆膠束”是表面活性劑等兩性分子在有機溶劑中自發(fā)形成的集聚體。兩性分子的親水性一端連續(xù)成逆膠束的極性核，水分子可插入核中；而疏水性一端則進入主體有機溶劑中。酶分子溶于逆膠束中，組成逆膠束酶系統(tǒng)進行酶促反應。

復合法：以上幾種方法交叉使用。酶表面活性劑緩沖劑有機溶劑疏水端親水端第六十四頁，共一百二十七頁。固定化酶④固定化酶反應器→

批量反應器：將固定化酶與需處理廢水分批加入反應器中混和反應，廢水達到處理要求的標準時，用過濾或離心法分離固定化酶，回收的固定化酶可供反復使用。此法裝備簡單，但不能進行連續(xù)反應，只適于少量廢水的處理。常見的是序批式間歇反應器（SeriesBatchReactor，SBR）。

連續(xù)反應器：能進行連續(xù)進、出廢水，效率較高。柱型填充床反應器使用最為普遍。第六十五頁，共一百二十七頁。第六十六頁，共一百二十七頁。細胞固定化⊙固定化細胞（ImmobilizedCells）的特點微生物細胞自身就是一個天然的固定化酶反應器。用制備固定化酶的方法直接將細胞加以固定，即可催化一系列的生化反應。細胞的固定化技術是固定化酶技術的延伸。①優(yōu)點→

固定化細胞比游離細胞穩(wěn)定性高；催化效率比離體酶高；比固定化酶操作簡便，成本低廉，能完成多步酶反應，通常能保留某些酶促反應所必須的ATP、Mg、NAD等，因此，在參與反應時無需補加這些輔助因子。②缺點→

固定化細胞內含有龐大而復雜的酶系，其中有些酶對于人們所要求的某些催化反應則是不需要的，有時甚至是有害的。第六十七頁，共一百二十七頁。⊙細胞固定化方法所有的酶固定化方法，如載體結合法、交聯(lián)法和包埋法，均可直接應用于微生物細胞的固定。另外，由于細胞在結構和功能上有其自身的特殊性，特有的方法有自溶酶法和絮凝吸附法。①自溶酶法→

微生物細胞所具有的酶，從廣義上講是酶的一種固定化形式。只要使細胞自溶酶失活，細胞即可反復使用。②絮凝吸附法→

多聚電解質等絮凝劑有絮凝微生物細胞的作用。這類絮凝劑有聚丙烯酰胺、聚磺化苯乙烯、聚羧酸、聚乙基胺、聚賴氨酸和活性硅膠等。被絮凝的細胞再經(jīng)冷凍或干燥處理后，可提高酶活性的穩(wěn)定性和改善細胞壁的機械性能，使得固定化細胞可以反復使用，降低成本。第六十八頁，共一百二十七頁?！压潭ɑ毎苽淞鞒涛⑸锛毎駝ň垡蚁┐糚VA）按一定的重量比混合用注射器滴入交聯(lián)劑（飽和硼酸）中交聯(lián)取出固定化細胞用自來水沖洗后備用第六十九頁，共一百二十七頁。廢水處理中采用的常見酶類⊙含酚廢水處理中的酶類①過氧化物酶（Peroxidase，POD）→

過氧化物酶是由微生物或植物所產生的一類氧化還原酶。它們能催化很多反應，但都要求有過氧化物，如H2O2的存在來激活。H2O2首先氧化酶，然后酶才氧化底物。

辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）：

是酶處理廢水領域中應用最多的一種酶。HRP的很多應用都集中在含酚污染物的處理方面，使用HRP處理的污染物包括苯胺、羥基喹啉、致癌芳香族化合物（如聯(lián)苯胺、奈胺）等。而且，HRP可以與一些難以去除的污染物一起沉淀，去除物形成多聚物而使難處理物質的去除效率增大。第七十頁，共一百二十七頁。

木質素過氧化物酶（LigninPeroxidase，LiP）也叫木質素酶（Ligninase），是白腐真菌細胞酶系統(tǒng)的一部分。LiP可以處理很多難降解的芳香族化合物和氧化多種多環(huán)芳烴、酚類物質。它的作用機理與HRP十分相似。去除酚類的優(yōu)化條件是：酶的濃度高，pH值大于4.0，一定用量的過氧化氫。

聚酚氧化酶（PolyphenolOxidase）

——酪氨酸酶（Tyrosinase）：也叫酚酶或兒茶酚酶，催化兩個連續(xù)的反應：(a)單分子酚與氧分子通過氧化還原反應形成鄰苯二酚；(b)鄰苯二酚脫氫形成苯醌，苯醌非常不穩(wěn)定，通過非酶催化聚合反應形成不溶于水的產物，這樣用簡單的過濾即可去除。

——漆酶（Laccase）：由一些真菌產生，通過聚合反應去除有毒酚類。而且，由于它的非選擇性，能同時減少多種酚類的含量。第七十一頁，共一百二十七頁?！言旒垙U水處理中的酶類①過氧化物酶和漆酶→

辣根過氧化物酶和木質素過氧化物酶已應用于造紙廢水脫色。它們的固定化形式的處理效果比游離形式好。LiP作用的機理為：通過將苯環(huán)單元催化氧化成能自動降解的陽離子基團而降解木質素。漆酶還可通過沉淀作用去除漂白廢水中的氯酚和氯化木質素。②分解纖維素的酶→

這類酶主要用于造紙漿和脫墨操作中的污染處理。所使用的酶是由纖維二糖水合酶、纖維素酶和β-葡萄糖酶組成的混合酶系。第七十二頁，共一百二十七頁。據(jù)估計全世界每年使用的氰化物為300萬t，主要是在化學合成、人造織物、橡膠工業(yè)、制藥工業(yè)、礦石浸取、煤處理、電鍍等領域。而且，很多植物、微生物和昆蟲也能分泌自己體內的氰化物。因為氰化物是新陳代謝抑制劑，對人類和其它生物有致命的危害?！言烨鑿U水處理中的酶類①氰化物酶→

氰化物酶能把氰化物轉變?yōu)榘焙图姿猁}。Alcaligenesdenitnficans（一種革蘭氏陰性菌）可產生氰化物酶，該酶有很強的親和力和穩(wěn)定性，且能處理濃度低于0.02mg/L的氰化物。氰化物酶的活性既不受廢水中常見陽離子（如Fe2+,Zn2+和Ni2+）的影響，也不受諸如醋酸、甲酰胺、乙腈等有機物的影響。最適pH范圍是7.8～8.3。②氰化物水合酶→

能水解氰化物成甲酰胺。這類酶可由很多種真菌獲得。第七十三頁，共一百二十七頁?！咽称芳庸U水處理中的酶類①蛋白酶→

是一類水解酶，在魚肉加工工業(yè)廢水處理中得到了廣泛應用。蛋白酶能使廢水中的蛋白質水解，得到可回收的溶液或有營養(yǎng)價值的飼料。②淀粉酶→

是一種多糖水解酶，多糖轉變?yōu)閱翁呛桶l(fā)酵能同時進行，淀粉酶用于含淀粉廢水處理，可使大米加工產生的廢水中的有機物轉化為酒精。淀粉酶還可減少活性污泥法處理廢水的時間。第七十四頁，共一百二十七頁?！盐⑸镏福ǜ视椭饷福┲笍V泛存在于自然界的動植物中，尤其在微生物體內，包括細菌、真菌。在生物技術領域中，人們更多地關注利用微生物作為酶源的脂酶。大量的微生物可以用來生產脂酶，其中以假絲酵母、假單胞菌和根霉為其重要的酶源。脂酶應用于被污染環(huán)境的生物修復以及廢物處理是一個新興的領域。脂酶來源處理對象脂酶來源處理對象米曲霉廢毛發(fā)其它微生物脫水污泥假單胞菌石油污染土壤聚合物廢物假單胞菌有毒氣體廢水米根酶棕櫚油廠廢物廢食用油酵母食品加工廠廢水生物膜沉積物第七十五頁，共一百二十七頁。固定化技術處理廢水的應用⊙固定化酵母細胞降解酚—利用包埋法進行細胞的固定★海藻酸鈉－氯化鈣包埋法：用海藻酸鈣包埋固定熱帶假絲酵母菌，在三相流化床反應器中連續(xù)處理含酚廢水?！锾幚磉^程——將培養(yǎng)的細胞濃縮收集，與一定體積的海藻酸鈉溶液混合，用注射裝置將混合液推出，逐滴滴入100mL氯化鈣溶液中，形成一定強度的海藻酸鈣凝膠小球（細胞包埋固定在許多直徑為4mm的小球中），在氯化鈣溶液中浸泡數(shù)小時后，用無菌水洗去小球表面多余的鈣離子，裝入三相流化床反應器中，進行含酚廢水的連續(xù)性處理試驗（如下圖所示）。第七十六頁，共一百二十七頁。酵母細胞濃縮液海藻酸鈉溶液混合注射裝置氯化鈣溶液海藻酸鈣凝膠小球細胞包埋浸泡洗滌三相流化反應器酚廢水產物裝柱第七十七頁，共一百二十七頁?！压潭ɑ旌暇毎麑τ∪緩U水脫色以多孔陶珠作為固定化載體，固定一類具備脫色功能的細菌細胞（脫色混合菌WD－1篩選自印染廢水污泥），對印染廢水脫色?！压潭ɑ寮毎コ桌醚趸粒ê袘腋≡孱悾┛梢匀コ祝怨潭ㄔ宕鎽腋≡寮毎山鉀Q目前氧化塘中藻體流失問題。將軟性填料或人工水草置于氧化塘中，通過天然掛膜將藻細胞固定在填料上，形成的固定藻（藻類生物膜，需20~30d，是一種菌藻互生膜，藻為藍綠藻）在自然光照條件下，以空氣和水中的CO2作碳源，水中的氨氮作氮源進行光合作用并釋放出O2，在去除氨氮的同時藻類增殖。過量（或老化）的藻類可作為食藻水生生物的餌料而被去除。由于固定藻的濃度穩(wěn)定（不會被水帶走），從而可以增加流量，縮短停留時間，達到穩(wěn)定及強化氧化塘工作性能的目標。第七十八頁，共一百二十七頁。廢水凈化的生物強化技術（Bioaugmentation）—投菌法——向廢水處理系統(tǒng)中投加從自然界中篩選的優(yōu)勢種群或通過基因組合技術產生的高效菌種，以去除某一種或某一類有害物質，促進系統(tǒng)內生物處理效率的方法。——生物添加劑或生物強化劑：經(jīng)過篩選的具有特殊分解能力的菌種?！焉锾砑觿偕a→

★熱風干燥方式：將麥麩表面浸以培養(yǎng)基，再將細菌接種于培養(yǎng)基上使其生長，然后加熱誘導菌體形成孢子，以此方法制備的產品經(jīng)干燥貯存?！锢鋬龈稍锛夹g：冷凍干燥貯存未形成孢子的營養(yǎng)菌株。將具有優(yōu)良特性的天然菌或變異菌株經(jīng)熱風或冷凍干燥后，添加營養(yǎng)劑、潤滑劑、緩沖劑及其它增強劑等混合貯存。第七十九頁，共一百二十七頁。②使用方法→

將干燥的生物制劑置于27～38℃的溫水中浸漬一段時間（1～12h不等），使其活化后，以漿狀添加到處理系統(tǒng)中。生物制劑與溫水的比例，以及投入量等均按使用需要而定。如為液態(tài)成品生物制劑，則可直接投入處理系統(tǒng)中，毋需活化。⊙生物活液（LivingLiquorMicroorganism，LLMO）

含有經(jīng)過篩選的天然菌種或人工培殖的變異菌種的生物制劑。產品分菌粉和菌液兩種。菌粉中的細菌99.9%處于休眠狀態(tài)，使用時有一活化過程，故效果稍差。菌液則相反，一經(jīng)使用，能立即生效。菌液產品中以美國GES公司所生產的生物活液具有一定的知名度。美國GES公司——美國通用環(huán)?？萍脊荆℅eneralEnvironmentScience），是最早從事研究應用微生物商業(yè)開發(fā)的公司，在環(huán)保領域開創(chuàng)了新天地，解決了很多實質性水污染問題，核心的利蒙LLMO系列產品正式應市始于1974年，此后不斷完善發(fā)展，有多種系列產品行銷全球。它與安信達環(huán)?？萍迹▽幉ǎ┯邢薰竞献魃a全系列LLMO，并授權南京美聯(lián)環(huán)保有限公司為中國的總經(jīng)銷。第八十頁，共一百二十七頁。美國利蒙LLMO微生物水質處理劑第八十一頁，共一百二十七頁。①生物活液的組成→

LLMO生物活液裝在塑料罐內，使用和投加極為方便?；钜褐械募毦倲?shù)約為5×107個/mL。內含7種細菌，彼此可以他方的代謝產物為營養(yǎng)。

芽孢桿菌：無論在有氧或無氧情況下，均可分泌胞外酶，繁殖速度快、代謝能力強，能將不溶性脂肪分解為可溶性的短鏈脂肪酸和丙三醇，以利進一步厭氣發(fā)酵或好氣處理。

假單胞菌：具有較強分解各種有機物的能力并有脫氮作用。

亞硝化單胞菌：在硝化過程中能將NH3轉化為亞硝酸鹽。

硝化桿菌：在硝化過程中能將亞硝酸鹽進一步轉化為硝酸鹽。

纖維單胞菌：具有分解植物性纖維的能力。

氣桿菌：在厭氣狀況下具有較強的將碳水化合物轉化為糖類的能力。

紅色假單胞菌：厭光照下生長的一種能產生紅色色素的假單胞菌，搖動，菌液呈杜鵑紅色，肉眼可見。第八十二頁，共一百二十七頁。上述7種細菌是經(jīng)篩選分離后，按一定比例混合，在30℃好氣條件下培養(yǎng)22hr，添加硫化鈉，然后在溫度35℃下，再培養(yǎng)一段時間而制成。②生物活液的使用方法→

將生物活液投在進廠的截流干管或進水井內。投加量應根據(jù)進水水質（包括水質成分、BOD濃度和懸浮物量等）并經(jīng)過試驗來確定，這樣可節(jié)約生物活液的用量。也可以細菌計數(shù)器監(jiān)測池內細菌總數(shù)來控制LLMO投加量。一般以進水量的1～2mg/L計。第八十三頁，共一百二十七頁。7.5發(fā)酵工程與環(huán)境污染生物治理7.5.1發(fā)酵工程概述發(fā)酵的基本概念（Fermentation）⊙發(fā)酵的定義①巴斯德（LouisPasteur，1822~1895，法國微生物學家，化學家）：發(fā)酵是在厭氧條件下，糖在酵母等生物細胞的作用下進行分解代謝，向菌體提供能量，從而得到產物酒精和CO2的過程。②生物化學家：有機物分解代謝釋放能量的過程。③工業(yè)微生物家：把利用微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來制備微生物菌體或其代謝產物的過程統(tǒng)稱為發(fā)酵。第八十四頁，共一百二十七頁。⊙發(fā)酵的實質發(fā)酵是依靠微生物體內或體外的酶，將基質包括有機污染物在內的大分子分解成微生物細胞能吸收的小分子化合物，并參與細胞的合成代謝。發(fā)酵提供細胞生命活動所需的能量和各種細胞結構物質，建造新的細胞。⊙發(fā)酵的環(huán)境意義利用發(fā)酵工程的原理與技術，凈化處理環(huán)境污染物，同時產生有用的產品，可以達到減輕環(huán)境污染目的，同時實現(xiàn)廢物資源化。

酵母

霉菌

細菌⊙參與發(fā)酵的微生物第八十五頁，共一百二十七頁。發(fā)酵工程的內容

菌體生產

代謝產物的發(fā)酵生產

微生物機能的利用現(xiàn)代發(fā)酵工程需要兩方面專家的通力合作，即分子生物學家負責分離、鑒定、改造甚至創(chuàng)造可在微生物內高效表達的基因，以應用于工業(yè)生產。而生化工程技術人員則要保證改造過的微生物能在最適條件下大量生產，以獲得最大的產率?！l(fā)酵工業(yè)的內容：

主要包括生產菌種的選育，發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制，反應器的設計及產物的分離、提取與精制等。第八十六頁，共一百二十七頁。發(fā)酵的類型主要包括菌體發(fā)酵、酶發(fā)酵、代謝產物發(fā)酵、轉化發(fā)酵、生物工程細胞發(fā)酵?！盐⑸锞w發(fā)酵以獲得具有某種用途的菌體為目的：——傳統(tǒng)的菌體發(fā)酵工業(yè)包括用于制作面包的酵母發(fā)酵及用于人或動物食品的微生物菌體蛋白（單細胞蛋白）的生產?！碌木w發(fā)酵可用來生產一些藥用真菌，如香菇類、冬蟲夏草菌、靈芝等。有的微生物菌體還可以用作生物殺蟲劑，如蘇云金桿菌?！盐⑸锩赴l(fā)酵微生物產酶的品種多，目前工業(yè)應用的酶大多來自微生物發(fā)酵。微生物酶制劑有著廣泛的用途。黑曲霉菌發(fā)酵木霉菌發(fā)酵第八十七頁，共一百二十七頁?！盐⑸锎x產物發(fā)酵微生物代謝產物的種類很多，已知的有37大類，其中16類屬于藥物。①初級代謝產物→

在微生物對數(shù)生長期所產生的產物，如氨基酸、核苷酸、蛋白質、核酸、糖類等，是菌體生長繁殖所必需的。②次級代謝產物→

在菌體生長靜止期，某些菌體能合成在生長期中不能合成的、具有一些特定功能的產物，如抗生素、生物堿、細菌毒素、植物生長因子等。這些產物與菌體生長繁殖無明顯關系，稱為次級代謝產物。它們具有較大的經(jīng)濟價值。第八十八頁，共一百二十七頁?！盐⑸镛D化發(fā)酵

利用微生物細胞的一種或多種酶，把一種化合物轉變成結構相關的更有經(jīng)濟價值的產物。

最古老的生物轉化——利用菌體將乙醇轉化為乙酸的醋酸發(fā)酵。

發(fā)酵工業(yè)上的生物轉化——包括：異丙醇轉化為丙醇，甘油轉化為二羥基基丙酮，葡萄糖轉化為葡萄糖酸，進而轉化成2-酮基葡萄糖酸或5-酮基葡萄糖酸以及山梨醇轉化為L-山梨糖等。

最突出的微生物轉化——甾類轉化：甾類激素包括醋酸可的松等皮質激素和黃體酮等性激素，是用途很廣的一大類藥物?！焉锕こ碳毎陌l(fā)酵利用生物工程技術所獲得的生物細胞，如DNA-重組的“工程菌”、細胞融合所得到的“雜合細胞”以及動植物細胞、固定化細胞等，進行培養(yǎng)的新型發(fā)酵。其發(fā)酵產物多種多樣，所用的發(fā)酵設備是各種類型的新型生物反應器。第八十九頁，共一百二十七頁。發(fā)酵的方法⊙表面發(fā)酵將菌種接種到滅過菌的液體（或固體）培養(yǎng)基上，在一定溫度下進行培養(yǎng)。一般地，好氧微生物菌體在液體表面上形成一層微生物膜，在固體培養(yǎng)基上也能形成這種膜，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后，菌體產生的代謝產物，或擴散到培養(yǎng)基中，或留在微生物細胞內，或兩者都有，這要據(jù)菌體和產物的特性而定，產物產量達到高峰后，進行提取。該法勞動強度大，占地面積大，產量低，易污染，目前基本不用了。⊙深層發(fā)酵深層發(fā)酵是微生物細胞在液體深層中進行培養(yǎng)的方法。隨供氣方式的不同，好氧深層發(fā)酵可分為振蕩培養(yǎng)和深層通氣（攪拌）培養(yǎng)：第九十頁，共一百二十七頁。①振蕩培養(yǎng)→

即所謂的搖瓶振蕩培養(yǎng)（搖床），培養(yǎng)微生物所需的氧氣是在外界空氣與培養(yǎng)液在振蕩時進行自然交換提供的。搖瓶法培養(yǎng)酵母②深層通氣培養(yǎng)→

強制通入無菌空氣到密閉發(fā)酵罐中進行（攪拌）培養(yǎng)的方式，微生物所需的氧是外界通入空氣中的氧經(jīng)過溶解后提供的。深層發(fā)酵法的優(yōu)點——具有生產效率高，占地小，可人為控制，廣泛應用于抗生素、維生素、有機酸、酶制劑等生產中。第九十一頁，共一百二十七頁。發(fā)酵過程發(fā)酵生產的具體過程一般為：

菌種（或生物細胞）→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預處理→提取精制→成品檢測→成品包裝。第九十二頁，共一百二十七頁。發(fā)酵生物反應器按照所使用的生物催化劑，生物反應器可分為酶反應器和細胞反應器兩類。發(fā)酵罐是一種微生物細胞反應器，是最重要的一種生物反應器。以發(fā)酵罐為主體，半個多世紀以來，已形成一整套生化工程設備，其進步表現(xiàn)在以下幾個方面：

染菌率極低：現(xiàn)代發(fā)酵多為純種培養(yǎng)。培養(yǎng)基的徹底滅菌、空氣的滅菌、設備的嚴密度和科學管理形成了防止雜菌污染的基礎。

發(fā)酵設備大型化：發(fā)酵罐的體積從幾十立方米增加到幾百至幾千立方米，設備大型化有利于提高經(jīng)濟效益。

利用生物技術優(yōu)化發(fā)酵過程：大幅度提高產量和降低成本

改進后處理工藝和設備：采用先進設備提高產品的回收率和質量。第九十三頁，共一百二十七頁。幾種發(fā)酵罐第九十四頁，共一百二十七頁。發(fā)酵生物反應器的類型：

攪拌式生物反應器——內設攪拌裝置。使用最廣。

鼓泡柱式反應器——

攪拌主要依賴于引入的空氣或其他氣體。

氣升式反應器——

內設內置或外置的循環(huán)管道，由于引入氣體的運動，導致反應器內培養(yǎng)液進行混合，并保持循環(huán)流動。第九十五頁，共一百二十七頁。排氣口培養(yǎng)基氣流管進氣口排氣口氣－液分離器培養(yǎng)基下行柱上行柱進氣口基底內循環(huán)氣升式生物反應器外循環(huán)氣升式生物反應器攪拌電機排氣口培養(yǎng)基攪拌葉輪進氣口攪拌式生物反應器鼓泡柱式生物反應器排氣口培養(yǎng)基進氣口第九十六頁，共一百二十七頁。7.5.2發(fā)酵工程在環(huán)境污染治理中的應用——廢物資源化亞硫酸鹽紙漿廢液乙醇發(fā)酵發(fā)酵技術在環(huán)境保護領域中應用十分廣泛，廢水生物處理裝置實際上可以看作一個大型發(fā)酵罐，有機污染物在微生物作用下，轉化成CO2和水。固體廢物的堆肥，垃圾的填埋以及廢物資源化等過程均為發(fā)酵過程。亞硫酸鹽紙漿廢液（俗稱紅液）中含有較多的木質素鹽和相當數(shù)量的糖類（亞硫酸鹽紙漿廢液中可發(fā)酵性糖的來源主要是半纖維素）?？捎靡陨a乙醇。第九十七頁，共一百二十七頁。亞硫酸鹽紙漿廢液通入空氣SO2石灰水中和酸沉淀去除CaSO4等澄清液N和P發(fā)酵罐絮狀酵母澄清罐發(fā)酵液酵母回流澄清液蒸餾預處理發(fā)酵第九十八頁，共一百二十七頁。廢纖維素的資源化⊙纖維素酶解糖化工藝生產葡萄糖人們發(fā)現(xiàn)來源于綠色木霉的纖維素酶活性很高，該株木霉經(jīng)改進后，其酶活力可以提高19倍，并據(jù)此開發(fā)了纖維素酶解糖化工藝。該工藝由制酶、原料預處理、水解與糖漿回收三階段組成?！牙美w維素肥料生產單細胞蛋白

一些放線菌菌株能廣泛分解纖維素、半纖維素、木質素和淀粉等有機物產生單細胞蛋白。酶解蔗髓培養(yǎng)酵母：所用纖維素酶來自木霉，酵母菌種為熱帶假絲酵母。常常用于生產干酵母。第九十九頁，共一百二十七頁?！牙美w維素生產乙醇用混合培育方法可直接將纖維素轉化為乙醇，即用熱纖梭菌來水解纖維素，同時運用熱解糖梭菌把前者不能代謝的戊糖轉化為乙醇，使纖維素水解和乙醇發(fā)酵結合進行。從原料中得到的乙醇已達到理論最高產量的80%。⊙有機固體廢物的快速堆肥從自然界中分離篩選一些在新鮮畜糞上能旺盛增殖的嗜糞微生物，用它們接種后，可明顯加快發(fā)酵進程。向有機肥料中接種白色腐朽菌，有利于難降解的木質素加快分解；也可以對植物性廢棄物和城市污泥進行加酶處理，在沼氣發(fā)酵時的甲烷產量可有大幅度提高。白色腐朽菌第一百頁，共一百二十七頁。生產單細胞蛋白（SingleCellProtein，SCP）⊙什么是單細胞蛋白？通過培養(yǎng)單細胞生物而獲得的生物體