凝膠色譜課件

凝膠色譜發(fā)展歷史凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分技術(shù)，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目前已經(jīng)被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫(yī)學等有關(guān)領域廣泛采用，不但應用于科學實驗研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。

基本理論1.分子篩效益

分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊，凝膠表現(xiàn)分子篩效應。

2.色譜柱的重要參數(shù)（1）柱體積：常用Vt

表示。（2）外水體積：常用Vo表示。（3）內(nèi)水體積：常用Vi表示。

不包括固體支持物的體積（Vg）。（4）峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve

表示。當使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。

凝膠色譜法凝膠滲透色譜法主要用于有機溶劑中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布，同時根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬到100以下凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物。化學結(jié)構(gòu)不同但相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達到完全的分離純化的目的凝膠的種類及性質(zhì)（一）交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）

⑴Sephadex

G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯數(shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。

⑵Sephadex

LH-20，是─Sephadex

G-25的羧丙基衍生物，

能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)（二）瓊脂糖凝膠：

商品名很多，常見的有，Sepharose（瑞典，pharmacia

），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學滅菌活處理。

（三）聚丙烯酰胺凝膠：

是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，

由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P

（Bio-Gel

P），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2至P-300共10種，P

后面的數(shù)字再乘1000就相當于該凝膠的排阻限度。

（四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel

，

具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，

可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機械強度好，洗脫劑可用甲基亞砜。

（二）凝膠的選擇

根據(jù)所需凝膠體積，估計所需干膠的量。

一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex

G-20的吸水量為20，1

克Sephadex

G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質(zhì)采用100-200號篩目的的Sephadex

G-200效果好，

脫鹽用Sephadex

G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

（四）樣品溶液的處理

樣品溶液如有沉淀應過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex

G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4％，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4