植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)

植物的基本特征植物低等植物藻類地衣高等植物無根、莖、葉等分化器官合子不經(jīng)胚直接發(fā)育為個體含根、莖、葉、花、果分化器官合子經(jīng)胚再發(fā)育為個體苔蘚門蕨類門裸子門被子門第1頁/共73頁第一頁，共74頁。高等植物基因工程的基本概念高等植物基因工程高等植物細胞基因表達技術高等植物轉(zhuǎn)基因技術轉(zhuǎn)基因植株植物工程細胞農(nóng)作物遺傳性狀改良蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)小分子化合物大規(guī)模生產(chǎn)第2頁/共73頁第二頁，共74頁。高等植物基因工程的發(fā)展歷程1983年美國和比利時科學家首次將外源基因?qū)霟煵莺秃}卜

1994年世界上第一種耐儲藏的番茄在美國批準上市

1995年轉(zhuǎn)基因的抗蟲、抗除草劑的玉米和棉花在美國投入生產(chǎn)2000年美國轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積首次超過普通大豆迄今為止世界上共批準了12種作物、6大類性狀的48個轉(zhuǎn)基因品種進行商業(yè)化生產(chǎn)，其中包括水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄等。第3頁/共73頁第三頁，共74頁。高等植物的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)Ti質(zhì)粒介導的整合轉(zhuǎn)化程序植物病毒介導的轉(zhuǎn)染程序植物細胞的直接轉(zhuǎn)化程序第4頁/共73頁第四頁，共74頁。Ti質(zhì)粒介導的整合轉(zhuǎn)化程序幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌農(nóng)桿根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由該菌細胞內(nèi)的野生Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能型質(zhì)粒Ti（Tumor-inducing）介導的。第5頁/共73頁第五頁，共74頁。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒的圖譜整個質(zhì)粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的編碼產(chǎn)物負責：合成吲哚乙酸t(yī)mr的編碼產(chǎn)物負責：合成植物分裂素tmt的編碼產(chǎn)物負責：合成氨基酸衍生物冠癭堿第6頁/共73頁第六頁，共74頁。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti質(zhì)粒致瘤的分子機制損傷的植物根部會分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸，它們能誘導Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根瘤菌染色體上的一個操縱子表達。vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結(jié)合形成復合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細胞。第7頁/共73頁第七頁，共74頁。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能T-DNA的染色體整合機制第8頁/共73頁第八頁，共74頁。T-DNA的染色體整合機制Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能第9頁/共73頁第九頁，共74頁。Ti質(zhì)粒的改造除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因為大量的生長素和分裂素會抑止細胞再生長為整株植物；除去T-DNA上的有機堿生物合成基因（tmt）；因為有機堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影響植物細胞的生長；安裝大腸桿菌復制子，使其能在大腸桿菌中復制，以利于克隆操作；安裝植物細胞的篩選標記，如neor基因，使用植物基因的啟動子和polyA化信號序列；安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長度；第10頁/共73頁第十頁，共74頁。共整合轉(zhuǎn)化程序第11頁/共73頁第十一頁，共74頁。二元整合轉(zhuǎn)化程序?qū)⑼庠椿蚩寺≡诖竽c桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，該菌株攜帶只含vir區(qū)不含T-DNA區(qū)的Ti輔助質(zhì)粒；以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細胞。第12頁/共73頁第十二頁，共74頁。植物病毒介導的轉(zhuǎn)染程序隨著植物病毒分子生物學及遺傳學研究的不斷深入，用病毒基因組作為載體轉(zhuǎn)化植物細胞日益受到人們的重視，因為病毒載體能將外源基因?qū)胫参锏乃薪M織和細胞中，而且不受單子葉或雙子葉的限制。在大約300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒約占91%，雙鏈RNA病毒、雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。利用植物病毒載體轉(zhuǎn)化植物細胞大致有以下兩種戰(zhàn)略：第13頁/共73頁第十三頁，共74頁。植物病毒介導的轉(zhuǎn)染程序以雙鏈DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因組作為載體，去除有關的致病性基因，換上外源基因，體外包裝成有感染力的病毒顆粒，轉(zhuǎn)染植物細胞原生質(zhì)體，并由此再生成整株植物。轉(zhuǎn)染植物細胞原生質(zhì)體第14頁/共73頁第十四頁，共74頁。植物病毒介導的轉(zhuǎn)染程序植物雙生病毒（Geminiviruses）為一單鏈DNA病毒，成熟的雙生病毒呈雙顆粒狀，每一個顆粒中含有一條不同的DNA單鏈。其中A鏈能單獨在植物細胞中復制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B鏈編碼另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B兩條鏈必須同處于一個植物細胞中，方能形成有感染力的病毒。雙生病毒具有廣泛的宿主細胞范圍，因此是一種很有潛力的植物病毒載體。轉(zhuǎn)染植物組織第15頁/共73頁第十五頁，共74頁。轉(zhuǎn)染植物組織雙生病毒家族成員蕃茄金花葉病毒（TGMV）克隆表達載體的構(gòu)建程序第16頁/共73頁第十六頁，共74頁。植物細胞的直接轉(zhuǎn)化程序槍擊法將待轉(zhuǎn)化的DNA沉淀在細小金屬珠的表面，用特制槍將金屬珠直接打入植物細胞，槍的威力為430m/s，植物細胞通常是胚胎細胞、玉米籽、葉子等，但進去的DNA片段整合效率極低。第17頁/共73頁第十七頁，共74頁。電擊法將高濃度的質(zhì)粒DNA加入到植物細胞的原生質(zhì)體懸浮液中，混合物在200-600V/cm

的電場中處理若干秒鐘，然后將原生質(zhì)體在組織培養(yǎng)基中生長1-2周，再生出整株植物。第18頁/共73頁第十八頁，共74頁。融合法將外源DNA與特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中這些疏水性化合物分子形成球狀的脂質(zhì)體，后者與植物細胞原生質(zhì)體融合，篩選融合子，再生植物細胞壁。所有涉及到植物原生質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)化方法均存在一個難題，即：原生質(zhì)體很難再生出整株植物。第19頁/共73頁第十九頁，共74頁?；ǚ酃軐敕▽⑼庠碊NA沿著花粉管經(jīng)過珠心進入尚未形成正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞中，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。這一方法是我國科學家周光宇首先提出設計的，目前已應用于水稻、小麥、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的轉(zhuǎn)基因研究，花粉管導入法的特點是直接、簡便。它的受體材料為植株整體，省略了細胞組織培養(yǎng)的誘導和傳代過程，排除了植株再生的障礙，特別適合于難以建立有效再生系統(tǒng)的植物。由于轉(zhuǎn)化的是完整植株的卵細胞、受精卵或早期胚胎細胞，導入的DNA分子整合效率較高。第20頁/共73頁第二十頁，共74頁。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)功能蛋白和工業(yè)原料利用植物生物反應器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白利用植物生物反應器生產(chǎn)食品或飼料添加劑利用植物生物反應器生產(chǎn)工業(yè)原料第21頁/共73頁第二十一頁，共74頁。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)功能蛋白和工業(yè)原料轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應器的優(yōu)勢如下：植物易于生長，農(nóng)田管理成本相對低廉，操作技術要求也不高絕大多數(shù)植物的表達產(chǎn)物對人和牲畜無毒副作用，安全可靠植物具有完整的真核表達修飾系統(tǒng)，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的重組蛋白藥物和疫苗在分子結(jié)構(gòu)和生物活性上，與人體來源的蛋白質(zhì)相似第22頁/共73頁第二十二頁，共74頁。利用植物生物反應器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白借助于根瘤農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將小鼠抗體的輕鏈和重鏈編碼基因分別置于兩種煙草植物體內(nèi)表達，然后兩種重組植物品系進行雜交，產(chǎn)生的子代植物能同時合成小鼠的輕鏈和重鏈兩種多肽。從這種轉(zhuǎn)基因煙草的葉子里可檢測到完整的抗體分子，含量為葉細胞蛋白總量的1.5%。實驗結(jié)果表明，植物細胞的蛋白分泌系統(tǒng)能夠有效識別小鼠抗體前體的信號肽序列。轉(zhuǎn)基因煙草表達小鼠抗體第23頁/共73頁第二十三頁，共74頁。轉(zhuǎn)基因煙草表達小鼠抗體第24頁/共73頁第二十四頁，共74頁。利用植物生物反應器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白人葡萄糖腦苷脂酶（hGC）是治療高歇斯癥（Gausherdisease）遺傳病的特效藥，可能也稱得上當今世界最昂貴的藥物。每生產(chǎn)一個劑量的hGC要消耗2000-8000

只人類胎盤，因此這種藥物一直供不應求。美國VPI研究機構(gòu)的專家將克隆的hGC基因經(jīng)改造導入到煙草中，并獲得高效表達。在每克這種轉(zhuǎn)基因煙草的新鮮葉片中，hGC的含量竟高達1mg，也就是說，從一株轉(zhuǎn)基因煙草中就能產(chǎn)生出傳統(tǒng)工藝需要消耗數(shù)千只胎盤才能獲得的藥物。轉(zhuǎn)基因煙草表達人葡萄糖腦苷脂酶第25頁/共73頁第二十五頁，共74頁。利用植物生物反應器生產(chǎn)食品或飼料添加劑果聚糖是果糖的多聚體，可被人體腸胃中的微生物發(fā)酵，刺激雙歧桿菌生長，釋放短鏈脂肪酸進入循環(huán)系統(tǒng)，保健價值高。3-6聚體的果聚糖有甜味，是低能量的助甜劑，有助于降低體重，因此國際上果聚糖的銷售量很大。荷蘭科學家把果糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)霟煵莺婉R鈴薯中，在獲得的轉(zhuǎn)基因植株中，果聚糖含量占8%（干重）以上，具有良好的開發(fā)前景。轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯生產(chǎn)果聚糖第26頁/共73頁第二十六頁，共74頁。利用植物生物反應器生產(chǎn)食品或飼料添加劑在許多植物的種子中，磷元素主要是以肌醇-6-磷酸（即植酸）的形式存在。單胃動物如豬和家禽幾乎不能利用這些磷元素，因此必須在飼料中添加無機磷以滿足動物營養(yǎng)的需要。在飼料中添加植酸酶則可以提高動物對植酸磷元素的利用率，減少動物糞便中磷酸鹽含量，改善畜牧業(yè)發(fā)達地區(qū)磷酸鹽富集化污染的程度。荷蘭科學家從黑曲霉菌中克隆到植酸酶基因，并將之導入到煙草的種子中表達。在飼料中添加這種轉(zhuǎn)基因煙草的種子便可達到良好的效果。轉(zhuǎn)基因煙草生產(chǎn)植酸酶第27頁/共73頁第二十七頁，共74頁。利用植物生物反應器生產(chǎn)工業(yè)原料首批用于大規(guī)模生產(chǎn)并取得巨大經(jīng)濟效益的非食用性轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品是工業(yè)用油，其中包括制造肥皂等去垢劑的十二碳月桂酸。油菜通常產(chǎn)生十八碳的不飽和脂肪酸，但只要在其體內(nèi)表達另一個特殊的基因即可使轉(zhuǎn)基因油菜改為合成月桂酸，并可使其含量提高到44%。此外，鑒于油菜植物易生長且產(chǎn)量高的特點，人們還致力于用它來生產(chǎn)其它工業(yè)用油，如可作潤滑油和尼龍生產(chǎn)原料的芥酸以及用于麥淇淋制作的6-十八碳烯酸等。轉(zhuǎn)基因油菜生產(chǎn)肉桂酸第28頁/共73頁第二十八頁，共74頁。利用植物生物反應器生產(chǎn)工業(yè)原料

聚-b-羥基烷酸（PHAs）和聚羥基丁酸（PHB）兩種結(jié)構(gòu)相似的多聚體具有熱塑性好、可被微生物完全分解的特性，因此被認為是最好的無污染性塑料原料。轉(zhuǎn)基因擬南芥生產(chǎn)聚羥基丁酸將核細菌真養(yǎng)產(chǎn)堿菌的PHB生物合成基因?qū)霐M南芥中，轉(zhuǎn)基因植物在整個生命周期中，PHB的含量逐步增加，并達到每克濕重植物產(chǎn)10毫克PHB的最大產(chǎn)量，大約相當于細胞干重的14%。第29頁/共73頁第二十九頁，共74頁。植物轉(zhuǎn)基因技術在植物品種改良中的應用控制果實成熟的轉(zhuǎn)基因植物抗病蟲害的轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物改變花卉形狀和顏色的轉(zhuǎn)基因植物抗環(huán)境壓力的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)高品質(zhì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因植物第30頁/共73頁第三十頁，共74頁?？刂乒麑嵆墒斓霓D(zhuǎn)基因植物蔬菜和水果成熟后，其組織呼吸速度和乙烯合成速度普遍加快，并迅速導致果實皺縮和腐爛。控制蔬菜水果細胞中乙烯合成的速度，能有效延長果實的成熟狀態(tài)及存放期，為長途運輸提供了有利條件，具有重要的經(jīng)濟價值。植物細胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸經(jīng)氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶ACC和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。科學家采用反義RNA技術封閉番茄細胞中上述兩個酶編碼基因的表達，由此構(gòu)建出的重組番茄的乙烯合成量分別僅為野生植物的3%和0.5%，明顯增長了番茄的保存期。第31頁/共73頁第三十一頁，共74頁?？刂乒麑嵆墒斓霓D(zhuǎn)基因植物植物體內(nèi)乙烯的生物合成機制第32頁/共73頁第三十二頁，共74頁。抗病蟲害的轉(zhuǎn)基因植物昆蟲對農(nóng)作物的危害極大，全世界每年因此損失數(shù)千億美元。目前對付昆蟲的主要武器仍是化學殺蟲劑，它不但嚴重污染環(huán)境，而且還誘使害蟲產(chǎn)生相應的抗性。將抗蟲基因?qū)朕r(nóng)作物是植物基因工程的得意之筆，能避免化學殺蟲劑所造成的許多負面影響。目前，抗蟲作物已占全球轉(zhuǎn)基因作物的22％。用于構(gòu)建抗蟲害轉(zhuǎn)基因植物常見的外源基因有蘇云金芽孢桿菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、幾丁質(zhì)酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多個，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因和凝集素基因應用最為廣泛。第33頁/共73頁第三十三頁，共74頁。細菌毒素蛋白編碼基因的植物轉(zhuǎn)基因程序第34頁/共73頁第三十四頁，共74頁。抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物在大田里，盡管每年花費上百億美元使用100多種化學除草劑，但雜草的生長仍使農(nóng)作物減產(chǎn)10%。目前使用的除草劑特異性不強，或多或少會影響農(nóng)作物的生長。利用轉(zhuǎn)基因技術構(gòu)建抗除草劑的重組植物可望解決這一問題，其戰(zhàn)略包括：抑制農(nóng)作物對除草劑的吸收高效表達農(nóng)作物體內(nèi)對除草劑敏感的靶蛋白降低敏感性靶蛋白對除草劑分子的親和性向農(nóng)作物體內(nèi)導入除草劑的代謝滅活能力第35頁/共73頁第三十五頁，共74頁?？弓h(huán)境壓力的轉(zhuǎn)基因植物長期的植物生理學研究結(jié)果表明，植物對鹽、堿、旱、寒、熱等環(huán)境不利因素的自我調(diào)節(jié)能力很大程度上取決于細胞內(nèi)的滲透壓，提高滲透壓往往能改善植物對上述環(huán)境不利因素的耐性。為達到此目的至少有兩種戰(zhàn)略可供選擇：一是高效表達能提高植物胞內(nèi)滲透壓的同源或異源蛋白；二是借助于蛋白質(zhì)工程技術改變植物細胞內(nèi)豐度較高的蛋白質(zhì)的氨基酸組成，如在不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的前提下適當提高脯氨酸殘基的含量等。第36頁/共73頁第三十六頁，共74頁。產(chǎn)高品質(zhì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因植物植物油大都是含有雙鍵的不飽和脂肪酸，故在室溫下呈液態(tài)。人造黃油的制作是通過催化加氫使植物油熔點上升，這種工藝不但加工成本很高，而且還會導致順式雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)閷】挡焕姆词诫p鍵。利用反義RNA技術，特異性滅活植物體內(nèi)硬脂酰-ACP脫飽和酶的編碼基因，即可提高轉(zhuǎn)基因油料作物中飽和脂肪酸的含量。將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸第37頁/共73頁第三十七頁，共74頁。產(chǎn)高品質(zhì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因植物一般糧食種子的儲存蛋白中幾種必需氨基酸的含量較低，例如禾谷類蛋白的賴氨酸含量低，豆類植物的蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸含量低，直接影響到人類主食的營養(yǎng)價值。將蠶豆中一種富含賴氨酸和甲硫氨酸的蛋白編碼基因植入玉米中，可顯著提高其營養(yǎng)價值。馬鈴薯和水稻的類似改良也在進行之中。提高糧食中必需氨基酸的含量第38頁/共73頁第三十八頁，共74頁。產(chǎn)高品質(zhì)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因植物目前全世界有24億人以大米為主食，約有1.3億人因缺鐵而引起貧血，2.5-10億人患有不同程度的維生素A缺乏癥。為了增加稻米中的鐵質(zhì)含量，從大豆芽中分離出鐵蛋白編碼基因，將之轉(zhuǎn)入亞洲稻谷一個普通品系中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因稻谷能儲存相當于普通稻谷3倍的鐵質(zhì)研究還發(fā)現(xiàn)，普通稻米中含有一種植物酸，阻礙人的消化系統(tǒng)對鐵的吸收。瑞士科學家將來自水仙等植物的相關基因植入水稻中，不僅鐵的含量有所提高，而且維生素A的含量也豐富了。提高糧食中鐵元素和維生素的含量第39頁/共73頁第三十九頁，共74頁。改變花卉形狀和顏色的轉(zhuǎn)基因植物花卉的顏色是由花冠中的色素成分決定的。大多數(shù)花卉的色素為黃酮類物質(zhì)，由苯丙氨酸通過一系列的酶促反應合成，而顏色主要取決于色素分子側(cè)鏈取代基團的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，如花青素衍生物呈紅色，翠雀素衍生物呈藍色等。在黃酮類色素的生物合成途徑中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一個關鍵酶。利用反義RNA技術可有效抑制矮牽?；▽僦参锛毎麅?nèi)的CHS基因表達，使轉(zhuǎn)基因植物花冠的顏色由野生型的紫紅色變成了白色，并且對CHS基因表達抑制程度的差異還可產(chǎn)生一系列中間類型的花色。改變花卉的顏色第40頁/共73頁第四十頁，共74頁。改變花卉形狀和顏色的轉(zhuǎn)基因植物植物激素在控制花朵的形狀和大小方面起著重要的作用。例如，細胞分裂素與植物生長素的比值可以決定植株包括花的形狀。分子生物學和遺傳學的研究都表明，同源異形基因表達的加強或減弱都會改變花的大小和形狀，而這些基因的表達時間直接影響到植物的花期。同源異形基因控制花形的過程十分保守，在幾乎所有的觀賞花卉中都是一樣的，這就為人們用基因工程的方法改變花形和花期提供了有利條件。改變花卉的形狀第41頁/共73頁第四十一頁，共74頁。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型及特性植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)常見的問題及其解決途徑第42頁/共73頁第四十二頁，共74頁。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的概念

植物基因轉(zhuǎn)化受體（genetransformationreceptor）系統(tǒng)——一般是指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源基因（foreigngene)的整合（recombination），對用于轉(zhuǎn)化選擇的抗生素敏感的再生系統(tǒng)。第43頁/共73頁第四十三頁，共74頁。高效穩(wěn)定的再生能力較高的遺傳穩(wěn)定性具有穩(wěn)定的外植體來源抗生素敏感性農(nóng)桿菌敏感性植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件

第44頁/共73頁第四十四頁，共74頁。一、高效穩(wěn)定的再生能力用于植物基因轉(zhuǎn)化的外植體必須易于再生，有很高的再生頻率，并且具有良好的實驗穩(wěn)定性和重復性。不同植物的種類、細胞類型、細胞狀態(tài)、特定的植物培養(yǎng)技術的成熟程度等在建立受體系統(tǒng)時均需考慮。第45頁/共73頁第四十五頁，共74頁。二、較高的遺傳穩(wěn)定性植物受體系統(tǒng)接受外源DNA后不影響其自身的遺傳體系，同時又能穩(wěn)定地將外源基因遺傳給后代，保持遺傳的穩(wěn)定性。選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)體系。第46頁/共73頁第四十六頁，共74頁。三、具有穩(wěn)定的外植體來源轉(zhuǎn)化的外植體一般采用種子，無菌實生苗的胚軸、子葉或幼葉，可進行離體快速繁殖的材料如一些植物的試管苗，以及可較高頻率誘導的營養(yǎng)變態(tài)器官等。第47頁/共73頁第四十七頁，共74頁。四、抗生素敏感性植物基因轉(zhuǎn)化中，通常使用兩類抗生素：抑菌抗生素選擇性抗生素選擇性抗生素應滿足以下條件：植物受體材料對所選用的抗生素有一定的敏感性；抗生素對受體植物沒有劇烈的毒性。第48頁/共73頁第四十八頁，共74頁。五、農(nóng)桿菌敏感性對于利用農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒為載體所介導的植物基因轉(zhuǎn)化而言，需要植物受體材料對農(nóng)桿菌敏感。第49頁/共73頁第四十九頁，共74頁。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的類型及特性經(jīng)過愈傷組織的受體系統(tǒng)不經(jīng)過愈傷組織的受體系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)細胞系及其體細胞胚受體系統(tǒng)生殖細胞受體系統(tǒng)第50頁/共73頁第五十頁，共74頁。經(jīng)過愈傷組織的受體系統(tǒng)經(jīng)過愈傷組織的受體系統(tǒng)是指外植體經(jīng)脫分化培養(yǎng)誘導愈傷組織，并通過分化培養(yǎng)獲得再生植株的受體系統(tǒng)。農(nóng)桿菌直接侵染外植體培養(yǎng)形成愈傷組織分化成植株第51頁/共73頁第五十一頁，共74頁。外植體誘導形成愈傷組織愈傷組織轉(zhuǎn)化外源基因再生植株第52頁/共73頁第五十二頁，共74頁。特點：外植體來源廣泛；擴繁量大；適用的植物范圍廣；嵌合體多；遺傳穩(wěn)定性差。

第53頁/共73頁第五十三頁，共74頁。注意事項取材：常采用葉片、莖段、子葉、上胚軸等。受體細胞對農(nóng)桿菌的感受態(tài)。第54頁/共73頁第五十四頁，共74頁。不經(jīng)過愈傷組織的受體系統(tǒng)不經(jīng)過愈傷組織的受體系統(tǒng)也稱直接分化再生系統(tǒng)，是指外植體細胞越過脫分化階段，直接分化出不定芽，從而獲得再生植株的受體系統(tǒng)。取材：從組織類型上講，葉片、幼莖、子葉、胚軸以及一些營養(yǎng)變態(tài)器官較易誘導直接分化；從細胞狀態(tài)講，薄壁細胞較為合適。第55頁/共73頁第五十五頁，共74頁。特點：獲得再生植株的周期短，操作簡單；可較好維持受體植物的遺傳特征；轉(zhuǎn)化的外源基因能穩(wěn)定遺傳；嵌合體多；轉(zhuǎn)化頻率較低。第56頁/共73頁第五十六頁，共74頁。原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體是“裸露”的植物細胞，能直接高效地攝取外源基因，因而轉(zhuǎn)化效率高且合適于現(xiàn)在建立的所有轉(zhuǎn)化方法。原生質(zhì)體再生系統(tǒng)通常處于相對均勻和穩(wěn)定的控制環(huán)境中，從理論上說，有利于準確的轉(zhuǎn)化和鑒定。通過原生質(zhì)體培養(yǎng)，細胞分裂形成基因型一致的細胞克隆，因此再生植株的嵌合體少。原生質(zhì)體培養(yǎng)周期長，培養(yǎng)技術限制該系統(tǒng)的應用。第57頁/共73頁第五十七頁，共74頁。植物原生質(zhì)體的再生程序原生質(zhì)體的再生效率在植物轉(zhuǎn)基因技術中至關重要。標準的高等植物原生質(zhì)體制備和再生程序是：將植物嫩葉、幼芽或愈傷組織切成碎片，浸入含有纖維素酶的緩沖液中保溫；懸浮物離心除細胞碎片；將原生體懸浮液滴在無菌濾紙片上，并置于含有普通植物細胞（即所謂的滋養(yǎng)細胞）的固體再生培養(yǎng)基的表面，使原生質(zhì)體與滋養(yǎng)細胞不直接接觸，但可吸收由滋養(yǎng)細胞分泌擴散出來的植物生長因子及其它化合物；培養(yǎng)2-3周后，將濾紙上的植物細胞蔟轉(zhuǎn)移至含有高濃度分裂素和低濃度生長素的固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培育2-4周，濾紙片上便長出嫩芽；將嫩芽置入含有低濃度生長素而無分裂素的固體培養(yǎng)基上，使其根部發(fā)育；大約3周后再將之移植在土壤中，長成整株植物。第58頁/共73頁第五十八頁，共74頁。植物原生質(zhì)體的再生程序第59頁/共73頁第五十九頁，共74頁。細胞系及其體細胞胚受體系統(tǒng)通過篩選和優(yōu)化的植物細胞懸浮培養(yǎng)的細胞系，通常具有較好的遺傳和生理狀態(tài)的一致性，通過一定的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)，可使細胞進入胚性狀態(tài)進而形成體細胞胚。該系統(tǒng)培養(yǎng)技術比原生質(zhì)體容易，轉(zhuǎn)化效率又優(yōu)于其他組織培養(yǎng)系統(tǒng)，因此被認為是最理想的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。第60頁/共73頁第六十頁，共74頁。特點：胚性細胞繁殖量大，同步性好，是理想的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化效率高；轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少；體細胞胚具有兩極性，減少了不定芽發(fā)育途徑中的生根培養(yǎng)過程；獲得的后代個體間遺傳背景一致，無性系變異小。第61頁/共73頁第六十一頁，共74頁。生殖細胞受體系統(tǒng)生殖細胞受體系統(tǒng)指的是以生殖細胞如花粉粒和卵細胞為受體細胞進行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。兩條途徑：利用小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)，誘導出胚性細胞或愈傷組織，建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化。第62頁/共73頁第六十二頁，共74頁。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立外植體的選擇制備高頻再生系統(tǒng)的建立抗生素的敏感性試驗農(nóng)桿菌敏感性試驗外植體具有誘導callus和再生植株的能力；芽的分化率高；易培養(yǎng)；體細胞無性系變異小。對農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)而言第63頁/共73頁第六十三頁，共74頁。外植體的選擇外植體生理年齡外植體細胞生理狀態(tài)外植體的遺傳背景外植體的選擇與受體系統(tǒng)相匹配第64頁/共73頁第六十四頁，共74頁。培養(yǎng)基選擇植物的營養(yǎng)特性激素的選擇第65頁/共73頁