兩株好氧氨氧化菌（AOB）的分離純化及菌屬鑒定

兩株好氧氨氧化菌(AOB)的分離純化及菌屬鑒定曾濤濤;李冬;曾輝平;仲航;張杰【摘要】在生物脫氮過程中，好氧氨氧化細菌(AOB)發(fā)揮重要作用.本研究通過梯度稀釋培養(yǎng)、平板劃線分離進行AOB分離純化，獲得兩株氨氧化能力較強的AOB菌株A2和A7,它們能將培養(yǎng)液中的大部分氨氮氧化.對A2和A7菌株進行革蘭氏染色并通過光學顯微鏡及掃描電鏡觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)A2和A7均為革蘭氏陰性菌，細胞呈桿狀，長為1~1.5pm,寬約0.5pm.生理生化實驗表明,A2和A7屬于自養(yǎng)微生物，不能利用有機碳源.系統(tǒng)發(fā)育分析表明,A2和A7均為亞硝化單胞菌(Nitrosomonas).%Aerobicammonia_oxidizingbacteria(AOB)playimportantrolesinbiologicalnitrogenremovalprocess.Inthisstudy,gradientdilutionofdomesticationliquidandstreak_ingplatemethodswereusedforAOBisolationandpurification.TwostrainsofAOB,namedA2andA7,wereobtainedfromculturemedium,whichcontributedmostammoniaoxida_tion.Aftergramstain,detectedbyopticalmicroscopyandscanningelectronmicroscopy,A2andA7werebothfoundasgram_negativeandrod_shapedbacteria,withlengthof1~1.5pmandwidthof0.5pm.A2andA7wereautotrophicmicroorganismssinceorganiccar_boncouldn'tbeultized.PhylogeneticanalysisshowedthatthespeciesofA2andA7wereNitrosomonas.【期刊名稱】《南華大學學報(自然科學版)》【年(卷)，期】2014(000)004【總頁數(shù)】5頁(P23-27)【關鍵詞】好氧氨氧化菌;分離;鑒定;生物脫氮【作者】曾濤濤;李冬;曾輝平;仲航;張杰【作者單位】南華大學污染控制與資源化技術湖南省高校重點實驗室，湖南衡陽421001;北京工業(yè)大學水質科學與水環(huán)境恢復工程北京市重點實驗室，北京100124;北京工業(yè)大學水質科學與水環(huán)境恢復工程北京市重點實驗室，北京100124;北京三磊建筑設計有限公司，北京100047;北京工業(yè)大學水質科學與水環(huán)境恢復工程北京市重點實驗室，北京100124;哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150090【正文語種】中文【中圖分類】X172傳統(tǒng)污水生物脫氮處理過程中，主要是利用微生物的硝化、反硝化作用來去除廢水中氮素，降低其對環(huán)境的危害.最近開發(fā)的短程脫氮技術是指將氨氮氧化成亞氮，然后進行反硝化或者厭氧氨氧化.這樣在硝化階段可節(jié)約25%的曝氣量，反硝化階段至少可減少40%的有機碳源，同時具有較高的反硝化速率和污泥產量低等優(yōu)點[1].其中，好氧氨氧化菌(AerobicAmmonia-OxidizingBacteria，縮寫為AOB)是一類能夠在好氧條件下將氨氮氧化為亞硝酸鹽的化能無機自養(yǎng)型細菌，其催化的亞硝化過程為硝化作用的限速步驟，影響硝化作用的整個過程[2].但目前的研究多集中在短程硝化工藝的運行與脫氮影響因素方面，較少涉及到AOB菌種分離純化.本研究從運行良好的短程硝化反應器內采集微生物樣品，通過分離純化獲得AOB菌株，并對其生理生化特征與脫氮性能進行分析.本研究的開展可以加深對AOB微生物特性的理解，為短程硝化工藝的優(yōu)化運行提供微生物學基礎.1材料與方法1.1微生物菌種來源之前在實驗室啟動了短程硝化生物膜反應器(SBBR)[3]，從亞硝化階段反應器內提取10mL微生物樣品，加入磷酸緩沖液(PBS)洗滌三次，放入4°C冰箱備用.1.2AOB分離純化氨氧化細菌(AOB)分離培養(yǎng)基[4]:(NH4)2SO40.5g,FeSO4?7H2O0.03g,NaCI0.3g,K2HPO41g,NaHCO31.6g,MgSO4?7H2O0.03g,加水至1L,調節(jié)pH為7.2.另外，在AOB分離培養(yǎng)基配方中加入1.5%~2%的水洗瓊脂，滅菌后倒入培養(yǎng)皿，制成固體培養(yǎng)基平板.121C下滅菌20min.AOB分離純化方法：取1mL微生物樣品梯度稀釋成10-1到10-6，再從6個梯度試管中取1mL液體，加入到裝有100mL培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，設置三組平行實驗，在28C、100r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7d，每天采用格里斯試劑檢驗NO2-的生成情況，呈現(xiàn)紅色表示有NO2-存在，即能反應培養(yǎng)液中有AOB的存在.從顯紅色的培養(yǎng)液中取10mL,按10%(體積比)比例接種到新鮮培養(yǎng)基內，重復上述操作，淘汰其他異養(yǎng)菌[5].經過3次重復操作后，將1mL培養(yǎng)液通過平板劃線方法接種到水洗瓊脂平板內，待長出單菌落之后，說明已初步分離到AOB菌，從平板上挑選單菌落進行后續(xù)試驗.通過LB培養(yǎng)基、KM培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基等有機培養(yǎng)基進行AOB純度驗證.1.3氨氮氧化能力分析在AOB分離純化階段，采用格里斯試劑方法檢測氨氧化能力；分離得到兩株氨氧化能力比較強的菌株A2和A7，將菌株加入到100mg/L氨氮培養(yǎng)基中，采用納氏試劑光度法對剩余氨氮濃度進行測定[6],檢測AOB氧化氨氮的能力.1.4AOB形態(tài)與生理生化特征觀察分離得到的A2和A7菌落大小、形態(tài)、顏色等外觀特征，對它們進行革蘭氏染色及光學顯微鏡觀察，并通過掃描電子顯微鏡觀察細胞微觀形態(tài).進行最適溫度、pH、需氧情況、對碳源、氮源的利用情況等生理生化實驗［4］，參照伯杰細菌鑒定手冊(第八版)［7］對分離的菌株進行初步分類鑒定.1.5分子生物學鑒定對純化的AOB菌株進行基因組總DNA提?。?］，采用引物amoA-1F/amoA-2R特異性擴增AOB的功能基因amoA［9］，將目的基因與pMD19-T載體連接，轉化到DH5a感受態(tài)細胞，構建克隆文庫，對陽性克隆進行測序.獲得的序列通過BLAST在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索相似序列，并進行同源性比對，比對結果構建系統(tǒng)發(fā)育樹，完成對A2和A7的分子生物學鑒定.2結果與分析AOB的分離純化從水洗瓊脂平板中挑選出9個具有較強氨氧化能力的單菌落，命名為A1-A9,將這9株菌株分別接種到AOB培養(yǎng)液中，利用格利斯試劑反應檢測各個菌株的氨氧化能力.反應之后顏色越深，表明氨越容易被氧化，對應菌株的氨氧化能力越強.試驗結果如表1所示，結果發(fā)現(xiàn)A2和A7菌株反應速度最快，氨氧化能力最強.表1氨氧化細菌(AOB)初篩結果Table1Resultofammonia-oxidizingbacteria(AOB)isolation菌株A1A2A3A4A5A6A7A8A9氨氧化能力++++++++++++++++AOB菌株氨氧化能力分析將A2和A7菌株的富集液按20%體積分數(shù)分別接種到新鮮的100mLAOB分離培養(yǎng)基內，在28°C和100r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)10d，并設置對照組(接種20%無菌水).每天測定錐形瓶內剩余氨氮濃度，通過計算氨氮氧化率來了解A2和A7菌株的氨氧化能力，其結果如圖1所示.圖1A2和A7菌株的氨氮氧化情況Fig.1AmmoniaoxidationratesofA2andA7strains從圖1可知，A2和A7菌株在前3d氨氧化能力小于35%，這可能與AOB生長速度緩慢有關.A2在接種后的3~7d氨氧化率逐漸增大，并在第7d達到最高值69.3%，此后氨氧化率基本保持不變.A7菌株在3~6d氨氧化率逐漸增大，在第6d的氨氧化率達到最高值73.1%，此后4d基本保持不變.試驗結果表明A2和A7菌株均具有較強的氨氧化能力，能將大部分氨氮轉化為亞氮.2.3AOB形態(tài)與生理生化特征將A2和A7菌株進行富集培養(yǎng)，通過離心收集菌液，通過光學顯微鏡觀察其形態(tài)特征.之后對菌液預處理，通過掃描電鏡觀察A2和A7菌株的微觀形態(tài)，結果如圖2所示.A2和A7細胞均呈桿狀（圖中白色箭頭所指），長為1~1.5頃，寬約0.5pm,兩種菌株在富集培養(yǎng)過程中細胞懸浮液呈淡黃色，這些特征與亞硝化單胞菌十分相似.郭建華等［10］也通過掃描電鏡觀察了短程硝化啟動過程中微生物形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)反應器達到穩(wěn)定短程硝化之后，污泥微生物以短桿狀和桿狀菌為主，與本試驗分離得到的菌株形態(tài)類似.圖2A2和A7菌株的掃描電鏡結果（標尺=1pm）Fig.2SEMresultsofA2andA7strains（Scalebar=1pm）通過生理生化試驗，可以了解菌株的生理生化特征與其適宜生長的環(huán)境條件，這些都是鑒定菌屬的重要依據(jù).對A2和A7進行生理生化試驗，并觀察它們的菌落特征，結果如表2所示.表2A2和A7菌株的生理生化特彳正Table2Physiological-biochemiccalcharacteristicsofA2andA7strains菌株A2A7革蘭氏染色G-G-夾膜染色最適溫度/^2828最適pH7.87.6需氧性好氧好氧淀粉水解試驗——葡萄糖發(fā)酵試驗——明膠液化試驗——菌落特征小、淡黃色、半透明、圓形、邊緣整齊、表面光滑中、淡黃色、半透明、橢圓形、邊緣整齊、表面光滑A2和A7有很多相似的生理生化特征：最適pH分別為7.8和7.6；有著相似的菌落特征，均屬于革蘭氏陰性、無夾膜的細菌；最適溫度為28°C,屬于好氧細菌；不能分解淀粉、葡萄糖、明膠等有機物；在LB、KM、PDA等有機培養(yǎng)基上均不能生長，以CO2為惟一碳源，從將氨氮氧轉化為亞硝酸鹽的過程中獲得能量.查找《伯杰細菌鑒定手冊》第8版［7］對亞硝酸菌種屬形態(tài)、生理生化特征的描述及其碳源、氮源的利用情況，初步判斷A2和A7菌株屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas).2.4AOB分子生物學鑒定amoA基因為亞硝化單胞菌屬的特異基因，目前大多數(shù)文獻以此基因作為標志基因進行AOB菌種鑒定［11］.本文通過引物amoA-1F/amoA-2R特異性擴增A2和A7菌株的功能基因amoA,PCR結果如圖3所示與DL2000marker對照，發(fā)現(xiàn)得到長度約490bp的片段，和目的基因片段長度相當，表明已獲得A2和A7菌株的amoA基因片段將A2和A7的amoA基因進行連接、轉化和克隆，從克隆文庫中挑選陽性克隆送交測序.將測序結果通過BLAST軟件在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜尋相似序列并進行同源性比較，序列提交到GenBank，獲得登陸號分別為KF194200(A2)和KF194201(A7).通過MEGA5軟件構建A2和A7菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖4所示.圖3A2和A7菌株amoA基因PCR結果Fig.3AmoAgeneofA2andA7strainsbyPCR系統(tǒng)發(fā)育分析表明，A2與亞硝化單胞菌Nitrosomonassp.LT-2(JN367454.1)同源性最高，相似度為99%.A7菌株和Nitrosomonassp.GH22(AF327917.1)同源性最高，相似度為95%.綜合A2和A7菌株的形態(tài)、生理生化特征與系統(tǒng)發(fā)育分析，判斷分離得到的這兩種菌株為亞硝化單胞菌(Nitrosomonas).Nitrosomonas是污水處理系統(tǒng)中比較常見的AOB菌，它們能夠適應低氨氮和低溶解氧環(huán)境[12],有研究發(fā)現(xiàn)這類AOB甚至能在氧受限的條件下，發(fā)生以亞硝酸氮為電子受體的厭氧氨氧化反應[13-14]，這表明Nitrosomonas在新型生物脫氮技術中發(fā)揮重要作用.圖4A2和A7菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4PhylogenetictreesofA2andA7strains3結論通過稀釋培養(yǎng)、平板劃線分離、顏色指示劑快速檢測方法，篩選到兩株氨氧化能力較強的AOB菌株，即A2和A7.經過氨氧化能力分析，發(fā)現(xiàn)A2和A7氨氧化能力可達69.3%及73.1%，它們能將培養(yǎng)液中的大部分氨氮氧化.綜合A2和A7菌株的形態(tài)、生理生化特征與系統(tǒng)發(fā)育分析，判斷它們?yōu)閬喯趸瘑伟?Nitrosomonas).參考文獻：張昭，李冬邱文新，等.城市污水部分亞硝化的實現(xiàn)與穩(wěn)定運行[J].中南大學學報(自然科學版),2013,44(7):3066-3071.彭永臻，馬斌.低C/N比條件下高效生物脫氮策略分析[J].環(huán)境科學學報,2009,29(2):225-230.ZengTT,LiD,ZhangJ.Characterizationofthemicrobialcommunityinapartialnitrifyingsequencingbatchbiofilmreactor[J].CurrMicrobiol,2011,63(6):543-550.馬放，任南琪,楊基先.污染控制微生物學實驗[M].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學出版社,2002.張輝,李培軍湖筱敏，等.亞硝化細菌的篩選及培養(yǎng)條件的研究[J].化工環(huán)保,2006,26(5):366-369.國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4版.北京:中國環(huán)境科學出版社,2002.布坎南RE,吉本斯NE.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學出版社,1984.劉濤,李冬,曾輝平，等.氨氮濃度對CANON工藝功能微生物豐度和群落結構的影響[J].環(huán)境科學,2013,34(2):773-780.GaoJ,LuoX,WuG,etal.AbundanceanddiversitybasedonamoAgenesofammonia-oxidizingarchaeaandbacteriaintenwastewatertreatmentsystems[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2014,98(7):3339-3354.郭建華，王淑瑩,鄭雅楠，等.實時控