生物化學(xué)實驗報告論

生物化學(xué)實驗報告論文班級:質(zhì)量121學(xué)號:200XXXX4119姓名:張XX

一、前言生物化學(xué)是一門聯(lián)系生物和化學(xué)的一門科學(xué)學(xué)科，學(xué)習(xí)生物化學(xué)可以提高我們嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)分析以及熟練的實驗操作，本文主要講了金黃色葡萄球菌核糖核酸酶的分離實驗，金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，屬于葡萄球菌屬，可引起許多嚴(yán)重污染，本文主要通過核酸酶活性的測定，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)溶液濃度，DEAE-纖維素的處理及裝柱，蛋白質(zhì)亞基分子量測定SDS凝膠電泳

二、實驗材料準(zhǔn)備共分為四組，了解實驗?zāi)康?、方案、原理?/p>

2.1、取已配制好的金黃色葡萄球菌于離心管內(nèi)，8000rpm離心除掉菌體，保留上清（留1-2ml,p1）,用作后續(xù)實驗。

2.2、將錐形瓶中的金黃色葡萄球菌液體放到沸水中煮30分鐘，10000rpm離心，保留上清液（留1-2ml,p2）,用作后續(xù)實驗。

2.3、將離心好的上清液取60ml進(jìn)行75%硫酸銨飽和度沉淀實驗，放置離心管，配平后4度冰箱中放置24小時。將硫酸銨沉淀液10000rpm離心，去上清，保留沉淀，緩沖液洗滌，方法是在第一支離心管中加入2ml緩沖液混勻倒入第二支離心管中，再取2ml于第一支離心管中洗一次，再倒入第二支離心管中，最后在第二支離心管中再加入2ml緩沖液。終體積為6ml（留.5ml,p3）。

2.4、DEAE-纖維素的處理及裝柱

2.4.1、處理本實驗采用的是DEAE-纖維素DE52是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為:先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質(zhì)；再在.5N的Hcl溶液中浸泡1h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH4以上，并將其在抽濾中抽干；將抽干的離子交換劑浸在.5N的NaOH溶液中1h,再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。

2.4.2、裝柱將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱才，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部；凝膠沉積至高度10cm處，停止裝柱；夾上止液夾。

2.4.3、平衡在柱層析上樣前必須對層析柱進(jìn)行平衡，將平衡緩沖液泵入到層析柱內(nèi)，打開層析柱下端的出口，當(dāng)下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時（大于50ml平衡液），層析柱達(dá)到了平衡。在本實驗中，用.001MTrs-HCl緩沖液PH

9.0（內(nèi)含.0001MEDTA）,預(yù)先將DE-52柱進(jìn)行平衡。

2.5、上樣平衡液50ml用于收集，收集30-40ml即可。然后裝入透析袋，PEG2包埋，濃縮。收集濃縮液p4-_；

2.6、透析袋預(yù)處理新的透析袋在沸水中煮沸10mn.即可進(jìn)行透析。

三、核酸酶活性的測定將甲苯胺藍(lán)核酸瓊脂溶化后，倒入平板中，凝固后，用直徑為2mm的打孔器打孔，將瓊脂取出，將待檢酶液10ul,滴入孔中，置于加有濕棉紗的濕盒內(nèi)，在37培養(yǎng)4h,陽性反應(yīng)在孔的周圍會出現(xiàn)1mm以上的粉紅圈，測量粉紅圈的直徑。

四、考馬XX藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度

4.1、實驗原理考馬XX藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高度敏感性?？捡R斯亮藍(lán)G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時呈藍(lán)色，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm,考馬斯亮G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測定的高度敏感度。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可用于蛋白質(zhì)濃度的測定。

4.2、實驗儀器及用品實驗試劑：(1)水；

(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白液:牛血清蛋白（.1ml）;

(3)染液:考馬斯亮藍(lán)G250（.01%）,稱取.1g考馬斯亮藍(lán)G250溶于50ml95%乙醇，再加入100ml濃磷酸，加蒸餾水定容到1000ml;

(4)樣品液:取牛血清白蛋白（.1ml）溶液，用.9%NaCL稀釋至一定濃度。

4.3、實驗內(nèi)容及步驟

4.

3.1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

4.

3.2、取7支干凈試管，按下表進(jìn)行編號并加入試劑試劑1234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（ml）0.

1.

204.6.8.8樣液S水(ml)

1.0.9.8.6.4.

202考馬斯亮藍(lán)染液（ml）

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0蛋白質(zhì)濃度（ml）010XXXX6080未知AXXX.106.214.350.46

3.29

9.4

3.3、數(shù)據(jù)記錄及處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，在坐標(biāo)紙上繪制出濃度-吸光度曲線，測出未知液的吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知液的濃度。

五、蛋白質(zhì)亞基分子量測定SDS凝膠電泳

5.1目的掌握SDS凝膠電泳測定蛋白質(zhì)亞基分子量的基本原理和操作方法

5.2、原理SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級，三級結(jié)構(gòu)；而強還原劑，如二硫蘇糖醇，-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。因此，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合后，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時，蛋白質(zhì)-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。

5.3、試劑和器材試劑：1低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)2待測蛋白質(zhì)樣品3凝膠貯液：30克丙烯酰胺，.8克甲叉雙丙烯酰胺，溶于100ml蒸餾水中，過濾，于4暗處儲藏，一個月內(nèi)使用4：1moll，ph

8.8trs-HCl緩沖液，trs

1.21g溶于蒸餾水，用濃鹽酸調(diào)至PH

8.8，以蒸餾水定容至100ml5：10%（wv）SDS6：10%（wv）過硫酸銨溶液（當(dāng)天配）7：四甲基乙二胺（TEMED）8：電極緩沖液PH

8.3：Trs

3.3g，甘氨酸14.42g，SDS10g，溶于蒸餾水并定容至1000ml，使用時稀釋十倍9：樣品稀釋液：SDS500mg，巰基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚藍(lán)4mg，1mollTrs-HCL（pH

6.8），用蒸餾水溶解并定容至10ml，按每份1ml分裝，可在4存放數(shù)周，或在-20數(shù)月。以此液制備樣品時，樣品若為液體，則加入與陽平等體積的原液混合即可。10固定液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，用蒸餾水定容至1000ml11脫色液：250ml乙醇，80ml冰醋酸，用蒸餾水定容至1000ml12染色液：.29g考馬斯亮藍(lán)R-250溶解在250ml脫色液中器材：微量進(jìn)樣針，電泳儀，電泳槽

5.4操作步驟

5.

4.1分離膠制備：凝膠濃度

1.25%，凝膠貯液

1.25ml，Trs-HCLPH

8.81molL

1.12ml，水

8.7ml，10%SDS.3ml，10%過硫酸胺.1ml，TEMED20上述膠液配好，混勻后，迅速加入兩塊玻璃板間隙中，使膠液面與矮玻璃和高玻璃之間形成凹槽處處平齊，而后插入“加樣梳”，在室溫下放置1小時左右，分離膠即可完全凝集。凝聚后，慢慢取出“加樣梳”，取出時應(yīng)防止把加樣孔弄破，取出“加樣梳”后，在形成的加樣孔中加入蒸餾水，沖洗未凝集的丙烯酰胺，倒出加樣孔中的蒸餾水后，在加入已稀釋的電極緩沖液。

5.

4.2樣品制備：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制備，待測蛋白樣品制備：液體待測樣品，可取500L，加入等體積的“2樣品稀釋液”，混勻，在沸水浴中加熱5mn，取出，冷卻至室溫備用。若液體待測樣品蛋白質(zhì)濃度太稀可經(jīng)濃縮后再制備。

5.

4.3，點樣用微量進(jìn)樣針吸取上述蛋白質(zhì)樣品20別加入到各個加樣孔中，為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，每個樣品應(yīng)做兩次重復(fù)。

5.

4.4，電泳將電泳槽與電泳儀連結(jié)，在電泳槽中加入已經(jīng)稀釋的電極緩沖液，打開電源，選擇合適電壓，保持恒電壓300v，進(jìn)行電泳，直至樣品中燃料遷移至離下端1cm處，停止。

5.

4.5，固定，染色，脫色將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中，置搖床上緩慢震蕩30mn以上（染色時間需要根據(jù)凝膠厚度適當(dāng)調(diào)整）。取出凝膠在水中漂洗數(shù)次，再加入考馬斯亮藍(lán)脫色液，震蕩。凝膠脫色至大致看清條帶約需1h，完全脫色則需要更換脫色液2-3次，震蕩達(dá)24h以上。凝膠脫色后可經(jīng)過掃描、攝錄等方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測。

六、結(jié)果分析及討論

6.1、核酸酶活性的測定的結(jié)果分析P1:粉紅圈內(nèi)直徑

6.4mm,外直徑

1.96mmP2:粉紅圈內(nèi)直徑

6.6mm,外直徑

1.98mmp3:粉紅圈內(nèi)直徑

6.8mm,外直徑

2000mmp4:粉紅圈內(nèi)直徑

7.0mm,外直徑

2.200mm

6.2、考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度的結(jié)果分析試劑XXX標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（ml）0.

1.

204.6.8.8樣液蛋白質(zhì)濃度（ml）010XXXX6080未知A595.075.106.214.350.46