光譜知識(shí)匯總

任何熒光物質(zhì)都具有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。由于斯托克斯位移，熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)。并且，由于處于基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)幾乎具有相同的間隔，分子和軌道的對(duì)稱性都沒(méi)有改變，熒光化合物的熒光發(fā)射光譜和激光譜形式呈大同小異的〃鏡象對(duì)稱〃關(guān)系。熒光激發(fā)光譜是通過(guò)測(cè)量熒光體的發(fā)光通量隨波長(zhǎng)變化而獲得的光譜。它是熒光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，它可以反映不同波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光的相對(duì)效率；熒光發(fā)射光譜是當(dāng)熒光物質(zhì)在固定的激發(fā)光源照射后所產(chǎn)生的分子熒光，它是熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。它表示在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)組分的相對(duì)強(qiáng)度。由于各種不同的熒光物質(zhì)有它們各自特定的熒光發(fā)射波長(zhǎng)值，所以，可用它來(lái)鑒別各種熒光物質(zhì)?？梢砸罁?jù)繪制其激發(fā)光譜曲線時(shí)所采用的最大激發(fā)波長(zhǎng)值來(lái)確定某熒光物質(zhì)的分子熒光波長(zhǎng)值和繪制熒光光譜曲線。同一熒光物質(zhì)的分子熒光發(fā)射光譜曲線的波長(zhǎng)范圍不因它的激發(fā)波長(zhǎng)值的改變而位移。由于這一熒光特性，如果固定熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)（入em），然后改變激發(fā)波長(zhǎng)（入ex），并以縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為激發(fā)光波長(zhǎng)繪圖即獲得激發(fā)光譜曲線，從中能確定最大激發(fā)波長(zhǎng)（入ex）。反之，固定最大激發(fā)光波波長(zhǎng)值，測(cè)定不同發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)的熒光強(qiáng)度，即得熒光發(fā)射光譜曲線和最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)值。通常使熒光色素的激發(fā)光波長(zhǎng).大多處于近紫外光區(qū)域或可見(jiàn)光區(qū)域.發(fā)射光波長(zhǎng)多處于可見(jiàn)光區(qū)域。物質(zhì)發(fā)生電子從基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷過(guò)程中吸收的能量要高于熒光發(fā)射的能量。因此，熒光色素的發(fā)射波長(zhǎng)總是大于其激發(fā)波長(zhǎng).兩者的差值叫斯托克斯位移（Stokes,shift）.斯托克斯位移說(shuō)明了在激發(fā)與發(fā)射之間存在著能量的損失.在熒光分析中就是利用斯托克斯位移現(xiàn)象，將激發(fā)光與熒光物質(zhì)的發(fā)射光分離出來(lái)，只檢測(cè)發(fā)射光，從而可提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性。根據(jù)熒光色素的激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)，可選擇光源和濾光片。例如，如果熒光色素的激發(fā)光波長(zhǎng)處于紫外光區(qū)，則必須使用紫外光源。（二）激發(fā)光譜和發(fā)射光譜、一般熒光物質(zhì)都具有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜.這兩種光譜可以描繪出該物質(zhì)的部分光學(xué)性質(zhì)。激發(fā)光譜又稱熒光激發(fā)光譜，是通過(guò)測(cè)量熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)變化而獲得的光譜。它是將發(fā)射熒光單色器固定在某一波長(zhǎng)的情況下，掃描激發(fā)單色器所測(cè)得的光譜。發(fā)射光譜又稱熒光光譜。它是反映熒光物質(zhì)的發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)之間相互關(guān)系的光譜。熒光光譜是在固定激發(fā)光波長(zhǎng)下掃描發(fā)射單色器所測(cè)得的光譜。在熒光分析中，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜是選擇和使用熒光色素（熒光探針）、鑒別不同熒光物質(zhì)的依據(jù)。（三）熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度即發(fā)射熒光的光量子數(shù)，其決定了熒光色素檢測(cè)的靈敏度。它本身又取決于熒光色素的摩爾消光系數(shù)和熒光的量子產(chǎn)率，在確定的條件下，二者為定值。摩爾消光系數(shù)反映了熒光色素吸收激發(fā)光的能力。而量子產(chǎn)率反映了熒光色素將吸收的輻射能轉(zhuǎn)化成熒光的效率。（四）熒光壽命熒光壽命（即激發(fā)態(tài)壽命）是指電子在激發(fā)態(tài)的平均停留時(shí)間.熒光壽命短時(shí)可提高靈敏度。大多數(shù)熒光色素的熒光壽命在納秒級(jí)。特別長(zhǎng)的熒光壽命對(duì)于高靈敏度的檢測(cè)也很有意義。有沒(méi)哪位大俠知道激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)怎么確定的，我做核酸探針?lè)矫娴?。先將溶液掃個(gè)紫外-可見(jiàn)圖，記各個(gè)吸收峰的最大波長(zhǎng)，然后以最大吸收峰的波長(zhǎng)作為激發(fā)波長(zhǎng)，進(jìn)行熒光光譜掃描，得到熒光光譜，其最大吸收波長(zhǎng)即為發(fā)射波長(zhǎng)。然后也可以先固定發(fā)射波長(zhǎng)，同樣掃描，即得到激發(fā)波長(zhǎng)。熒光激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)一般相差幾十個(gè)頃。不知道講清楚沒(méi)，自己試試看。常用光譜種類和原理簡(jiǎn)介如下：1）吸收光譜當(dāng)一束連續(xù)光通過(guò)透明介質(zhì)時(shí)，如果光波能量和介質(zhì)中從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的能量間隔相等，介質(zhì)中的狀態(tài)將由基態(tài)被激發(fā)到激發(fā)態(tài)，透過(guò)透明介質(zhì)的光將因這樣的吸收而光強(qiáng)減弱。由于激發(fā)態(tài)不同，它們的吸收能量不一樣，這樣在記錄透過(guò)透明介質(zhì)后的光強(qiáng)時(shí)就形成了光強(qiáng)隨著波長(zhǎng)變化的譜線，即吸收光譜。吸收光譜可以給出材料基質(zhì)和激活離子的激發(fā)態(tài)能級(jí)的位置和它們的分布情況。2）熒光（發(fā)射）光譜一束特定波長(zhǎng)的單色光將激活離子從基態(tài)激發(fā)到某一個(gè)激發(fā)態(tài)能級(jí)，從這個(gè)激發(fā)態(tài)向低于它的各個(gè)能級(jí)躍遷發(fā)光，可以得到它到下面各個(gè)能級(jí)以及下面各能級(jí)到更低能級(jí)的發(fā)光譜圖，即熒光光譜。材料所發(fā)熒光經(jīng)單色儀分光后，由探測(cè)器收集并記錄下各個(gè)波長(zhǎng)的發(fā)光強(qiáng)度，它能夠反映這個(gè)能級(jí)到下面各個(gè)能級(jí)的躍遷概率、熒光強(qiáng)度以及熒光分支比等信息，提供該材料的最佳發(fā)射波長(zhǎng)。同時(shí)，可以求得下面各個(gè)能級(jí)的位置，包括稀土離子的能級(jí)在晶場(chǎng)中的劈裂情況等。3）激發(fā)光譜監(jiān)控一個(gè)特殊的熒光發(fā)射波長(zhǎng)，改變激發(fā)波長(zhǎng)，得到一個(gè)在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光強(qiáng)度變化圖，即激發(fā)光譜。激發(fā)光譜可以提供熒光能級(jí)以上各個(gè)能級(jí)的位置，反映出各個(gè)能級(jí)向熒光能級(jí)的能量傳遞能力，找出該熒光獲得最高效率的最佳發(fā)射波長(zhǎng)。4）選擇激發(fā)光譜（稀土離子）在復(fù)雜晶體中，通常有幾個(gè)稀土離子可以取代的陽(yáng)離子格位，稀土離子的發(fā)光變得復(fù)雜并且難以分析。激光器出現(xiàn)以后，利用激光功率高、單色性好的特點(diǎn)，發(fā)展起來(lái)一種新的光譜測(cè)量方法，稱為選擇激發(fā)光譜。一般同一種稀土離子摻雜到同一晶體的不同格位時(shí)，不同格位稀土離子的能級(jí)會(huì)產(chǎn)生微小差別，可以利用可調(diào)諧激光器，調(diào)到一個(gè)合適的激發(fā)波長(zhǎng)使某個(gè)格位的離子被激發(fā)，另一些離子暫不激發(fā)，得到一個(gè)格位的光譜后再按照同樣的操作更換到其他格位。這樣的復(fù)雜光譜將被各個(gè)格位的光譜解析。FluorescentDye（熒光染料）Excitation（激發(fā)波長(zhǎng)，nm）Emission（發(fā)射波長(zhǎng)，nm）Cy2TM489506GFP（RedShifted）488507YO-PROTM-1491509YOYOTM-1491509Calcein494517FITC494518FluorXTM494519AlexaTM488490520Rhodamine110496520ABI,5-FAM494522OregonGreenTM500503522OregonGreenTM488496524RlboGreenTM500525RhodamineGreenTM502527Rhodamine123507529MagnesiumGreenTM506531CalciumGreenTM506533TO-PROTM-1514533TOTO?-1514533ABI,JOE520548BODIPY?530/550530550Dil549565BODIPY?TMR542568BODIPY?558/568558568BODIPY?564