基因分析技術(shù)簡介專家講座

陶慧卿基因分析技術(shù)介紹基因分析技術(shù)簡介專家講座第1頁在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用基因分析技術(shù)簡介專家講座第2頁測序應(yīng)用基因組DNA測序cDNA測序未知序列測序已知序列再測序基因分析技術(shù)簡介專家講座第3頁雙脫氧鏈終止法原理Sanger雙脫氧鏈終止法最大特點(diǎn)是引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。ddNTP能夠在DNA聚合酶作用下和多核苷酸鏈3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能再與下一個核苷酸縮合，結(jié)果使得多核苷酸鏈延伸終止。基因分析技術(shù)簡介專家講座第4頁雙脫氧鏈終止法測序主要步驟擴(kuò)增待測DNA片段，使其變性，取得單鏈DNA模板。選擇一條與DNA單鏈互補(bǔ)短鏈引物，將引物用放射性同位素標(biāo)識。引物先同單鏈模板復(fù)性。在四個反應(yīng)管中分別加入待測DNA單鏈模板、互補(bǔ)引物分子、四種dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不一樣ddNTP進(jìn)行聚合反應(yīng)?；蚍治黾夹g(shù)簡介專家講座第5頁基因分析技術(shù)簡介專家講座第6頁雙脫氧鏈終止法測序與PCR區(qū)分?測序只用一條引物，PCR需要兩條引物?測序產(chǎn)物線性增加，PCR產(chǎn)物指數(shù)增加?測序需要dNTP和ddNTP，PCR只用dNTP?測序產(chǎn)物是一系列長度相差一個堿基片段，PCR產(chǎn)物只有一條帶基因分析技術(shù)簡介專家講座第7頁

1、商品化測序試劑盒-熒光染料標(biāo)識

ABIPRISMBigDyev3.1和v1.1試劑盒2、自動化測序儀

ABIPRISM

310、3100和3730全自動遺傳分析儀

雙脫氧鏈終止法發(fā)展基因分析技術(shù)簡介專家講座第8頁BigDyev3.1試劑盒反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系：

單鏈DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+4種dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)

4種不一樣熒光標(biāo)識ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)循環(huán)條件：

96℃1min→(96℃10s→50℃5s→60℃4min)×25個循環(huán)→4℃保溫基因分析技術(shù)簡介專家講座第9頁基因分析技術(shù)簡介專家講座第10頁ABIPrism310GeneticAnalyzercapillarySyringewithpolymersolutionAutosamplertrayOutletbuffer+Injectionelectrode-Inletbuffer基因分析技術(shù)簡介專家講座第11頁AutosamplerTraySampleVialsElectrodeCapillarySeeTechnologysectionformoreinformationonCE電進(jìn)樣及電泳基因分析技術(shù)簡介專家講座第12頁熒光激發(fā)和檢測基因分析技術(shù)簡介專家講座第13頁影響測序質(zhì)量原因測序成功前提：PCR本身是成功PCR產(chǎn)物一定要經(jīng)過純化后再測序測序引物比PCR引物靠后一些(Nestedprimers)在測序反應(yīng)過程中反應(yīng)體積不要有波動（蒸發(fā)）選擇適當(dāng)測序產(chǎn)物純化方法基因分析技術(shù)簡介專家講座第14頁SNP篩查單核苷酸多態(tài)(SNP)是基因組中最為豐富遺傳多態(tài)，是決定個體差異最主要遺傳基礎(chǔ)。多態(tài)形式主要包含單堿基替換、插入或缺失，普通也包含微小片斷插入/缺失。因?yàn)楹芏郤NP位點(diǎn)本身就是功效多態(tài)位點(diǎn)，使得SNP在疾病易感基因相關(guān)性研究中有著廣泛應(yīng)用?；蚍治黾夹g(shù)簡介專家講座第15頁SNaPshot?MultiplexSystem基因分析技術(shù)簡介專家講座第16頁基因分析技術(shù)簡介專家講座第17頁SNaPshot試劑盒反應(yīng)體系及條件反應(yīng)體系：

單鏈DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+

4種不一樣熒光標(biāo)識ddNTP

循環(huán)條件：

(96℃10sec→50℃5sec→60℃30sec)×25循環(huán)→4℃保溫基因分析技術(shù)簡介專家講座第18頁方法特點(diǎn)

分型準(zhǔn)確：該技術(shù)也稱小測序技術(shù)，其準(zhǔn)確度僅亞于直接測序。多位點(diǎn)同時檢測：能夠同時檢測達(dá)12個位點(diǎn)，而Taqman一次僅能檢測一個。不受樣本量限制:而Taqman對少許樣本不適合。

基因分析技術(shù)簡介專家講座第19頁注意事項(xiàng)

1．同一反應(yīng)管中，不一樣位點(diǎn)引物長度必須不一樣，最好能相差4-6個堿基。2．引物與模板互補(bǔ)部分（有效引物）Tm值最少要50℃。3．為了改變引物長度，區(qū)分不一樣位點(diǎn)，能夠在引物5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。這四種尾巴理論上不輕易形成二級結(jié)構(gòu)，而且都經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證。小心：poly(dT)有可能與真核基因3’端poly(dA)尾巴互補(bǔ)。4．在引物設(shè)計(jì)時候，假如+鏈DNA序列不理想，難以設(shè)計(jì)出最正確引物，請使用-鏈DNA設(shè)計(jì)引物?；蚍治黾夹g(shù)簡介專家講座第20頁微衛(wèi)星多態(tài)(STR)分析微衛(wèi)衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)是一個短核苷酸串連重復(fù)多態(tài)（shorttandomrepeat,STR）,重復(fù)單元通常為2-5bp,因?yàn)檫@種重復(fù)序列在DNA復(fù)制過程中不穩(wěn)定，所以突變很高，從而造成這種標(biāo)識位點(diǎn)多態(tài)性很強(qiáng)，雜合度很高，正因?yàn)檫@種特點(diǎn)，微衛(wèi)星多態(tài)在遺傳分析中有著廣泛應(yīng)用.

基因分析技術(shù)簡介專家講座第21頁熒光——引物熒光——PCR產(chǎn)物熒光激發(fā)與檢測識別統(tǒng)計(jì)結(jié)果