免疫組化免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析

免疫組化免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析當(dāng)前第1頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫組織化學(xué)原理及特點利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理和特殊的標(biāo)記技術(shù)，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體顯色，對組織細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原進(jìn)行定位、定性、定量檢測的一門技術(shù)。免疫組化具有操作簡單，特異性強，敏感性高，定位準(zhǔn)確，形態(tài)與功能相結(jié)合等特點。免疫組織化學(xué)

（Immunohistochemistry,IHC）

當(dāng)前第2頁\共有32頁\編于星期五\2點細(xì)胞抗原一抗二抗辣根過氧化物酶（HRP）3，3-二氨聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑棕褐色絡(luò)合物IHC反應(yīng)原理示意圖當(dāng)前第3頁\共有32頁\編于星期五\2點組織切片/芯片制作當(dāng)前第4頁\共有32頁\編于星期五\2點2.組織芯片應(yīng)用領(lǐng)域組織芯片的應(yīng)用領(lǐng)域包括與生命科學(xué)相關(guān)的基礎(chǔ)研究、臨床研究、應(yīng)用研究和新藥開發(fā)等。免疫組化染色（IHC）；原位雜交（ISH）；熒光原位雜交（FISH）；原位末端標(biāo)記分析（TUNEL）；原位PCR以及激光捕獲顯微分離系統(tǒng)輔助的cDNA雜交。1.組織芯片組織芯片（或組織微陣列）是將數(shù)十個甚至上千個不同個體的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上，組織芯片中含有蛋白，RNA及DAN分子，是一種高通量的研究分析工具。研究者一次可有效利用成百上千份正?；蚣膊顟B(tài)下的組織標(biāo)本來研究特定基因及其所表達(dá)的蛋白質(zhì)與疾病之間的關(guān)系。3.Abgent

現(xiàn)有組織切片/芯片產(chǎn)品全套鼠類器官組織切片；全套猴類器官組織切片；人類常見癌癥組織切片；組織芯片客戶定制服務(wù)。組織芯片/切片應(yīng)用當(dāng)前第5頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫組化流程示意圖當(dāng)前第6頁\共有32頁\編于星期五\2點2.SP法原理：根據(jù)生物素(Biotin)與鏈霉親和素(Streptavidin)具有強結(jié)合力的原理設(shè)計。在一抗（兔源與鼠源）與相應(yīng)的靶抗原結(jié)合后，生物素化標(biāo)記的抗多價二抗與一抗特異結(jié)合；二抗上標(biāo)記的生物素與標(biāo)記了辣根過氧化物酶（HRP）的鏈霉親和素結(jié)合，形成抗原～特異性一抗～生物素化的二抗～HRP標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物。特點：該法孵育時間短（通常為10min），靈敏度高以及低背景染色等特點。1.SABC法原理：SABC法是利用鏈酶親和素(Streptavidin)與生物素(Biotin)特有的高度親和力這一生物學(xué)性質(zhì)，先將生物素與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合，形成生物素化HRP，然后與鏈酶親和素按一定比例混合，形成SABC復(fù)合物。用生物素化二抗與第一抗體結(jié)合，再與SABC復(fù)合物聯(lián)結(jié)形成抗原～抗體～生物素化二抗～SABC復(fù)合物。最后用底物顯色劑顯色。特點：該法具有靈敏度高以及低背景染色等特點。3.Polymer酶標(biāo)二抗法原理：該法采用一段多聚氨基酸聚合物做為載體鏈，將該多聚物與二抗結(jié)合，然后可再標(biāo)記上多個HRP/AP酶分子，所以同樣具有很高的信號放大作用。特點：靈敏度高；操作步驟簡單；無需進(jìn)行內(nèi)源性的生物素封閉。IHC二抗原理及選擇4.直接酶標(biāo)二抗法該法是將HRP/AP酶分子直接標(biāo)記于二抗上。因此需要普通的酶標(biāo)二抗即可完成。實驗簡單，成本低，但是因為沒有信號放大作用，所以對很多表達(dá)豐度不是很高的抗原就可能檢測不到。當(dāng)前第7頁\共有32頁\編于星期五\2點IHC常用酶標(biāo)二抗原理示意圖當(dāng)前第8頁\共有32頁\編于星期五\2點2.AEC顯色法產(chǎn)品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)是過氧化物酶(Peroxidase)的顯色底物，在過氧化物酶的催化下，AEC顯色工作液會于反應(yīng)部位產(chǎn)生溶于酒精的紅色沉淀，必須在水溶性介質(zhì)中復(fù)染和封片。本試劑盒適用于辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)的免疫組化顯色，包括AEC顯色原和與之配套的稀釋液。試劑盒組成：AEC顯色原（試劑A）AEC底物緩沖液（試劑B）1.DAB顯色法產(chǎn)品描述：二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)

是過氧化物酶(Peroxidase)的顯色底物，在過氧化物酶的催化下，DAB顯色工作液會于反應(yīng)部位產(chǎn)生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本試劑盒適用于辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)的免疫組化顯色。試劑盒組成：DAB顯色原（20×）（試劑A）DAB底物緩沖液（1×）（試劑B）3.BCIP/NBT顯色法產(chǎn)品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑）是一種冷藏穩(wěn)定的、單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜交、westernblot、northernblot和southernblot，特異性地與堿性磷酸酶（AP）反應(yīng)生成紫色物質(zhì)。試劑盒組成：有機(jī)溶劑中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮藍(lán)四唑IHC顯色方法原理及選擇4.BCIP/INT顯色法產(chǎn)品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/p-碘硝基四唑）是一種冷藏穩(wěn)定的、單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜交、westernblot、northernblot和southernblot，特異性地與堿性磷酸酶反應(yīng)生成橙色/棕褐色物質(zhì)。

試劑盒組成：有機(jī)溶劑中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝基四唑當(dāng)前第9頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫組織化學(xué)結(jié)果分析當(dāng)前第10頁\共有32頁\編于星期五\2點2.非特異性顯色石蠟切片脫蠟不徹底，建議延長脫蠟時間。操作過程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數(shù)與沖洗時間。組織富含內(nèi)源性的生物素與過氧化物酶，建議使用相關(guān)試劑進(jìn)行封閉。發(fā)生抗原異位。蛋白封閉不充分，建議增加蛋白封閉時間。1.顯色過深一抗?jié)舛冗^高或孵育時間過長，建議降低一抗?jié)舛然驕p少孵育時間。孵育溫度過高，建議室溫或4℃孵育。HRP標(biāo)記二抗孵育時間過長，建議縮短時間。3.顯色強度弱一抗?jié)舛冗^低或孵育時間過短，建議增加一抗?jié)舛然蜓娱L孵育時間。試劑超過保質(zhì)期，建議實驗前確認(rèn)試劑的保質(zhì)期。操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。免疫組織化學(xué)常見問題分析4.無染色組織中無目的抗原的表達(dá)。一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實驗前確認(rèn)一抗的種屬來源。顯色物質(zhì)與HRP系統(tǒng)不匹配，建議實驗前確認(rèn)顯色體系。當(dāng)前第11頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫熒光原理及特點免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒光素標(biāo)記技術(shù)，通過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下觀察熒光的變化從而對細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行分析的技術(shù)。用免疫熒光顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）技術(shù)。免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。免疫熒光

（Immunofluorescence,IF）

當(dāng)前第12頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫熒光原理示意圖當(dāng)前第13頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫熒光實驗過程

細(xì)胞爬片（多聚賴氨酸處理，生長密度70-80%）細(xì)胞固定（合適的固定液，如4%甲醛溶液等）細(xì)胞膜穿透（TritonX-100等）封閉（3%BSA-PBS等）一抗孵育熒光二抗孵育胞漿/核襯染（鬼筆環(huán)肽/DAPI/PI）封片熒光顯微鏡拍照當(dāng)前第14頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫熒光結(jié)果分析當(dāng)前第15頁\共有32頁\編于星期五\2點免疫熒光雙染色抗體的選擇直接法：一抗種屬來源無要求標(biāo)記兩種不同熒光素的一抗。間接法：一抗種屬來源來源不同二抗分別標(biāo)記不同熒光素。當(dāng)前第16頁\共有32頁\編于星期五\2點細(xì)胞核襯染染料：DAPI是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料它可以透過完整的細(xì)胞膜，因此以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。Hoechst33342是一種DNA結(jié)合型熒光染料,可以嵌合到堿基分子中,在紫外激發(fā)光作用下發(fā)出蘭色熒光.能夠透過完整的細(xì)胞膜，可用于活細(xì)胞染色。碘化丙啶(PI)是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。細(xì)胞漿襯染染料：鬼筆環(huán)肽（phalloidin）由鬼筆鵝膏真菌（Amanitaphalloides）產(chǎn)生的一種環(huán)肽?？膳cF肌動蛋白結(jié)合，使F肌動蛋白保持穩(wěn)定。其熒光標(biāo)記物是鑒定F肌動蛋白的重要試劑。熒光抗體的選擇：綠色熒光素：FITC，Alex488，Dylight488等。紅色熒光素：PE，Alex546等。各種熒光染料原理及選擇當(dāng)前第17頁\共有32頁\編于星期五\2點2.信號弱或無信號無目的蛋白或表達(dá)量極少，建議選用表達(dá)量高的細(xì)胞或組織。細(xì)胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。一抗/二抗?jié)舛忍?，建議增大其濃度。二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。1.背景過高一抗質(zhì)量不高，建議使用特異性高、效價高的一抗。一抗/二抗?jié)舛忍撸ㄗh降低一抗/二抗?jié)舛?。封閉不完全，建議增加蛋白封閉時間。洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)熒光顯微鏡的參數(shù)來減低背景。3.熒光猝滅快熒光素本身特性決定，光穩(wěn)定性差，建議選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗。用普通的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。免疫熒光常見問題分析4.細(xì)胞有自發(fā)熒光使用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進(jìn)行熒光淬滅，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光。材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光，建議設(shè)立陰性對照，通過降低熒光顯微鏡的參數(shù)來消除背景染色。

細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細(xì)胞色素等）的含量高；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞／活細(xì)胞比例高；當(dāng)前第18頁\共有32頁\編于星期五\2點流式細(xì)胞術(shù)定義及原理流式細(xì)胞儀（FLOWCYTOMETOR）：

進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，是集光電子物理，光電測量，計算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，抗體技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)（FLOWCYTOMETRY）:

利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達(dá)99%以上）的技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FC）當(dāng)前第19頁\共有32頁\編于星期五\2點細(xì)胞抗原一抗二抗熒光物質(zhì)（FITC,PE等）不同顏色的激發(fā)光FC反應(yīng)原理示意圖激光源轉(zhuǎn)化為計算機(jī)識別數(shù)據(jù)當(dāng)前第20頁\共有32頁\編于星期五\2點流式細(xì)胞儀工作原理圖當(dāng)前第21頁\共有32頁\編于星期五\2點當(dāng)前第22頁\共有32頁\編于星期五\2點流式細(xì)胞術(shù)實驗過程

細(xì)胞懸浮液制備（濃度為1～5×106個/ml）細(xì)胞固定（合適的固定液，如4%甲醛溶液等）細(xì)胞膜穿透（

冰冷的甲醇等）封閉（3%BSA-PBS等）一抗孵育熒光二抗孵育流式細(xì)胞儀分析當(dāng)前第23頁\共有32頁\編于星期五\2點人外周全血細(xì)胞雙參數(shù)散點圖直方圖：單參數(shù)分析流式細(xì)胞術(shù)常見結(jié)果分析當(dāng)前第24頁\共有32頁\編于星期五\2點散點圖：多參數(shù)分析常用細(xì)胞表型及意義：（ClusterofDifferentiation,CD）CD3

總T細(xì)胞CD4T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群CD8T抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞亞群CD19

B細(xì)胞抗原LL:CD3-CD4-B細(xì)胞群+細(xì)胞毒T細(xì)胞亞群LR：CD3+CD4-細(xì)胞毒T細(xì)胞亞群UR：CD3+CD4+T輔助細(xì)胞亞群UL0.70UR24.2LR22.3LL52.80當(dāng)前第25頁\共有32頁\編于星期五\2點熒光補償示原理熒光補償是指修正熒光滲漏的過程，如從探測器出去除匹配熒光以外的任何熒光信號。當(dāng)采用兩種或兩種以上熒光標(biāo)記時（如FITC,PE），當(dāng)攜帶兩種熒光素的細(xì)胞受到激光照射激發(fā)時，將發(fā)出兩種不同波長的熒光。然而，熒光染料所發(fā)出的熒光都具有一定的波長范圍（寬發(fā)射譜性質(zhì)），雖然各自的熒光峰值不同，但發(fā)射譜范圍會有一定的重疊。因而就會造成不同通道之間的熒光干擾，對實驗結(jié)果造成影響。當(dāng)前第26頁\共有32頁\編于星期五\2點熒光補償示意圖當(dāng)前第27頁\共有32頁\編于星期五\2點AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測原理在細(xì)胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或Biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinV-FITC作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在細(xì)胞凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，碘化丙啶PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將細(xì)胞凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。當(dāng)前第28頁\共有32頁\編于星期五\